Разварка это: Разварки. Что это такое, основные плюсы и минусы. Как сделать своими руками. Разбираемся в тонкостях

Что такое разварки дисков и для чего они нужны (видео) — Самостоятельный ремонт авто

Новых автомобилей на рынке любых стран всегда много. Но столь же много и автомобилей старого образца. Люди пытаются совершенствовать свои автомобили во всем, включая колеса. Стандартные штампованные диски на машине говорят нам о том, что хозяин мало заботится о своем четырехколесном друге. Но литые диски на старых автомобилях смотрятся нелепо и безвкусно. На этот случай автолюбители использовали технологию, применяемую на мускул карах примерно в середине прошлого века, когда для улучшения сцепления и устойчивости чересчур мощной машины на автомобиль ставили широкие диски.

В наше время найти широкие заводские диски на старый автомобиль почти невозможно и люди научились делать индивидуальные колеса сами.

Смысл установки разварок дисков заключается в возможности использования более широкой резины, которая позволяет машине иметь прекрасную управляемость, полученную за счет повышенного сцепления, в свою очередь полученного за счет увеличения пятна контакта резины с покрытием дороги. Даже надетая на широкий обод стандартная резина сильно повышает коэффициент сцепления, хоть и быстрее изнашивается. Кроме того, широкие диски очень тяжелые, что означает, что они очень неохотно поворачиваются, следовательно, машину не будет вести в сторону.

Изготовление разварок дисков своими руками

Разварки дисков изготавливают двумя способами – вварив полосу металла в один диск, или же сварив два частично обрезанных диска в один. Звучит не очень убедительно, но, вопреки всему, это вполне надежно и машина почти не теряет в ходовых характеристиках после установки разварок. Несмотря на это проблемы все же существуют и они вполне предсказуемы.

Наиболее серьезной сложностью является подбор, установка и шиномонтаж резины.

Чаще всего для широких дисков используют обычную резину, которую нагревают и натягивают на диск, что определенно не прибавляет ей прочности. Кроме того, снять резину таким же образом невозможно. Следует так же отметить вероятность недобросовестной работы сварщика, который может плохо сварить диск повредив металл или даже упустив отверстие, через которое может выходить воздух. Для решения проблемы спускания колес есть только один выход – использования камер, давно вышедших из постоянного использования.

Полезный совет

Из-за повышенной площади соприкосновения у автомобиля все же падает маневренность и увеличивается расход топлива.

Ширина таких дисков обычно варьируется в промежутке от шести до девяти дюймов. Особым достоинством считается широкая «полка», получаемая при разварке, выполненной из литых дисков чаще всего крайне низкого качества или же при наваривании пластины на передний обод. Однако установка широких дисков не может быть разовым случаем тюнинга вашего автомобиля.

Чаще всего вместе с разварками делается покупка низкопрофильной резины, а так же занижение автомобиля. Это делается для уменьшения эффекта «внедорожника», когда колеса выглядят непропорционально большими для автомобиля. При более детальном подходе к применению разварок дисков готовят почти весь автомобиль:

• меняют угол развала
• дорабатывают части подвески
• меняют ширину колесных арок и прочее

Использование разварок делает любой автомобиль яркой индивидуальностью, постоянно притягивающей взгляд прохожих, вызывающей заинтересованные вопросы и жаркие споры на счет целесообразности использования данных дисков. Многие диски красят в яркие, провокационные цвета, такие как розовый, желтый, синий и ядовито-зеленый.

Доработанный автомобиль с разварками дисков имеет крупные шансы попасть в газеты, а «обутый» таким образом автомобиль стиля «rat look», и так отличающийся повышенной неординарностью, повергнет в шок большинство обывателей.

Ниже вы можете просмотреть видео с описанием процесса изготовления разварок дисков своими руками в гаражных условиях.

Технологии — Микроразварка и технология Chip-On-Board / Хабр

В этой самоизоляционной статье я расскажу о разварке проволочных микровыводов (англ. wire bonding). В контексте печатных плат речь пойдёт о технологии монтажа кристаллов на печатную плату (англ. chip-on-board, COB). Обязательно смотрите видео по ссылкам, микроразварка — это очень красиво!

Разварка обеспечивает электрическое соединение кристалла с выводами корпуса (при корпусировании микросхемы), либо напрямую с проводниками печатной платы (технология COB). Альтернативный способ электрического соединения – это перевёрнутый монтаж кристалла (англ. flip-chip), как в конструкции самого корпуса, так и непосредственно на печатную плату (рис.

1).

Монтаж с использованием микропроволочных выводов появился следом за первыми интегральными схемами в начале 1960-ых годов и успешно используется до сих пор. Перевёрнутый монтаж – это современная технология, возникшая в ответ на требования повышения количества выводов, увеличения быстродействия и снижения габаритов. Однако она имеет ряд конструкционных ограничений, связанных с обеспечением надёжности (подробно об этом я писал

здесь

), и является технологически более сложной.

В этой статье не будет подробно рассматриваться классификация и теория различных методов разварки – это очень объёмный материал, выходящий за рамки обсуждаемого вопроса. Дело в том, что за свою продолжительную историю технология присоединения микропроволочных выводов развивалась в направлениях повышения стабильности, надёжности, скорости процесса сборки, расширения возможностей оборудования по созданию сварочных петель сложной формы и высокой плотности монтажа (рис. 2). Разнообразие задач и отсутствие универсальной технологии привело в процессе поиска к разработке различных методов разварки.

Рассмотрим кратко основные моменты. Несмотря на разнообразие методов, общим для всех принципом является то, что сварное соединение образуется в результате давления и нагрева контактирующих поверхностей до высокой температуры до образования межатомных соединений (чаще всего это интерметаллиды). В зависимости от метода нагрева разварка делится на следующие основные типы: термокомпрессионная (внешний нагрев), ульразвуковая (трение при ультразвуковом импульсе), термозвуковая (сочетание внешнего нагрева и ультразвукового импульса) и контактная (импульсный нагрев при протекании электрического тока) сварки. Основные материалы микропроволочных выводов – алюминий, золото, медь. Медь используют вместо золота для снижения стоимости, но она более жёсткая, а также быстро окисляется на воздухе, что осложняет процесс сварки, и требует более сложного оборудования, создающего в зоне разварки инертную среду (азот или формовочный газ). Высокая же проводимость меди является драйвером для замены алюминия в разварке силовых приборов, несмотря на более сложный техпроцесс.

Ось проволоки при разварке может быть ориентирована параллельно – это разварка типа «клин» (англ. wedge bond), или перпендикулярно – это разварка типа «шарик» (англ. ball bond) (рис. 3). У петли чаще всего две точки контакта, поэтому по типу сварочных точек методы разварки делятся на «шарик-клин» и «клин-клин». Наиболее распространены ультразвуковая сварка алюминиевой проволокой типа «клин-клин» (

видео

) и термозвуковая сварка золотой/медной проволокой типа «шарик-клин» (

видео

). В последнем случае для формирования шарика используется оплавление кончика проволоки искровым разрядом (

видео

), что только добавляет эпичности и красоты в процесс разварки. Для силовых приборов используются алюминиевые и золотые ленты (

видео

с шикарным звуковым сопровождением).

Ключевыми параметрами при ультразвуковой/термозвуковой разварке являются усилие сварки, мощность и продолжительность ультразвукового импульса. Их сочетание для заданной установки разварки, конкретной проволоки (диаметр, жесткость), конкретного разварочного инструмента, конкретных параметрах контактной площадки (размер, материал) должно обеспечивать повторяемость процесса разварки с гарантируемыми параметрами надёжности соединения.

Напрямую контролируемыми параметрами являются внешний вид, усилие на отрыв (англ. pull test) и усилие на сдвиг (англ. shear test) (рис. 4), косвенно – сбои при термоциклировании и других испытаниях в составе изделия.

Подбор параметров является в некотором роде магической процедурой, но тут есть ряд рекомендаций. В целом, выполняется он методом

научного тыка

поставноки эксперимента (англ. design of experiment, DOE), то есть последовательным перебором параметров в некотором диапазоне. Отталкиваться в этом поиске можно от опубликованных результатов по оптимизации параметров (например, статьи [1, 2]), от рекомендаций производителя оборудования и, конечно, от наработанного опыта. Далее выполняются тестовые разварки для каждого набора параметров с последующим контролем внешнего вида и усилий на отрыв/сдвиг. Для контроля внешнего вида вполне достаточно увеличения x100 с возможностью измерения линейных размеров (рис. 5), для измерения усилий на отрыв/сдвиг применяются специализированное оборудование (для лабораторных задач можно, например, использовать граммометр с крючком, а сдвиг выполнять вручную и исследовать форму разрушения на увеличениях x100…200 и более).

Для оценки внешнего вида важно насмотреться на как можно большее количество микрофотографии красивых и некрасивых точек разварки (вот

здесь

и

здесь

, например, есть несколько хороших микрофотографий с описанием), потому что по моему опыту есть корреляция между красотой разварки и её качеством. Кроме того, с опытом появляется понимание того, как при наладке параметров их варьировать, чтобы получить требуемый результат (не хватает усилия при сварке или же слишком большая мощность), то есть перебор становится всё более осознанным и направленным. В своё время мне очень помогло прочтение статей с теорий формирования сварки и влияния параметров на её качество [3, 4]. И ещё вот этих не менее прекрасных статей [5, 6], где авторы (памятники таким ставить) исследовали формирование петли с помощью высокоскоростной камеры. А так, количество прочитанных статей добить до 100, количество разваренных и оторванных перемычек до 10000 и магии в этом процессе станет несколько меньше. Всё ещё очень от установки, конечно, зависит – я в упорной борьбе выжимал максимум из белорусского автомата ЭМ-4450.

Теперь вернёмся к печатным платам и некоторым особенностям их проектирования по технологии COB. Технология применяется для снижения стоимости или при микроминиаютиризации, создании многокристальных модулей и сборок (в частности, светодиодных). На рис. 6 приведено изображение из одной из

презентаций

Wurth Electronics по данной теме с рекомендациями по проектированию. Представленные ограничения на размеры могут служить в качестве ориентира, дополнительно рекомендуется использовать 3D-модель разварочного инструмента для проверки доступности всех КП во избежание проблем уже по факту. Важно обратить внимание, что в зоне разварки на печатной плате снята маска, чтобы не создавать помех рабочей плоскости разварочного инструмента. Зону под кристаллом лучше не использовать под трассировку, а разместить там монтажную площадку (как на рисунке), особенно если основание кристалла имеет потенциал или требуется монтаж на проводящий клей для повышения теплоотвода. Монтаж кристалла на маску возможен, особенно в случае дальнейшего компаундирования кристалла. Монтаж кристалла может также осуществляться в вырез в печатной плате (англ. pcb cavity) с расположением КП в том же топологическом слое или уровнем выше.

Следующий нюанс, касающийся трассировки, заключается в рекомендации ориентировать КП на печатной плате по направлению разварочных петель для золотой проволоки. Обоснованность её я понял только при написании программы разварки. Суть в том, что вторая точка варки образуется на краю капилляра (рис. 7), а при написании программы указывается его центр, что при больших углах приводит к необходимости учитывать это и смещать расположение точки в программе. Иными словами, так удобней, но это не является принципиальным ограничением, и удобство трассировки имеет более высокий приоритет.

По поводу финишного покрытия печатных плат в отрасли имеется консенсус: для разварки алюминиевой проволокой достаточно ENIG, для золотой проволоки – ENEPIG или гальваническое золото (рис. 8). Почему нельзя использовать более дешёвый и доступный ENIG для разварки золотой проволокой? Ответ, который удавалось найти, заключается в том, что дрейф никеля приводит к деградации сварного соединения со значительным снижением его надёжности. А в ENEPIG палладий служит барьерным слоем, который препятствует этому дрейфу. Для отладочных образцов использовать ENIG вполне допустимо, тем более что параметры разварки при прочих равных для этих покрытий близки. ENEPIG же прямо указывается как рекомендуемое покрытие во многих источниках, по нему приводятся данные по испытаниям на надёжность [7, 8].

Большое внимание также уделяется проблеме образования нежелательных интерметаллидов Au-Al («пурпурная чума» и другие страшные слова), которые возникают при разварке золотой проволокой на алюминиевые КП кристалла или алюминиевой проволокой на ENIG. Вопрос этот достаточно сложный и для полного его понимания необходимых знаний химии у меня, к сожалению, нет. Вывод такой, что разварка в системе Au-Al является потенциальным источником сбоев, особенно при высоких температурах, и должна тщательно испытываться на надёжность. Максимизация усилия на отрыв как одна из стратегий, так как прочность сварки и долговременная надёжность связаны (более тонкий интерметаллический слой с большей площадью покрытия).

Слабым местом разварки «шарик-клин» на ENEPIG из-за тонкого слоя золота является вторая точка сварки. Задача получения качественной разварки осложняется также загрязнением КП после этапа поверхностного монтажа компонентов на печатную плату. Существуют два метода повышения надёжности: с укреплением бампом после сварки (англ. security bump/ball, SB) и c предварительным бампированием (англ. ball stich on ball, BSOB, или stand-off stich, SOS) (рис. 9). Дополнительным параметром оптимизации в этих технологиях является смещение бампа относительно точки сварки [9, 10]. По собственному опыту могу сказать, что для COB себя хорошо показала BSOB. Кстати, BSOB хороша ещё тем, что позволяет ставить вторую точку сварки на кристалл (англ. reverse bonding) и осуществлять разварку между кристаллами напрямую в многокристальных сборках. Буду рад, если в комментариях поделитесь своим опытом применения SB/BSOB и ENIG/ENEPIG.

И напоследок практический совет, может быть, кому-то будет полезно. Разварочные капилляры (а они недешёвые и поставка долгая), бывает, наглухо забиваются золотом. В случае, когда канал невозможно прочистить даже нихромовой проволокой, инструмент всё ещё рано списывать. Поможет «царская водка» – и инструмент как новый.

Сейчас появилось свободное время, поэтому планирую дополнить в адаптированном виде этой и предыдущей публикацией очередной релиз полной версии #SamsPcbGuide! Решил сделать самоизоляционную противовирусную скидку на полную версию – #сидидомаичитай, так сказать. Постепенно начинаю работу над калькулятором #SamsPcbCalc. Также прошу написать в комментариях, какие темы из нераскрытых интересно было бы рассмотреть. И, как всегда, буду благодарен за конструктивную критику и обратную связь. Всем удачи, народ, здоровья родным-любимым и продуктивного карантина!

Литература

[1] J. Gomes, M. Mayer, B. Lin, ”Development of a Fast Method for Optimization of Au Ball Bond Process”, 2015

[2]

Byung-Chan Kim, Seok-Jae Ha, etc. “Process Capability Optimization of Ball Bonding Using Response Surface Analysis in Light Emitting Diode (LED) Wire Bonding”, 2017

[3] Hui Xu, Changqing Liu, etc, “Initial bond formation in thermosonic gold ball bonding on aluminium metallization pads”, 2010

[4]

Hui Xu, Changqing Liu, etc. “The role of bonding duration in wire bond formation: a study of footprints of thermosonic gold wire on aluminium pad”, 2010

[5] Fuliang Wang, Yun Chen, Lei Han, ”Experiment study of dynamic looping process for thermosonic wire bonding”, 2012

[6]

Fuliang Wang, Yun Chen, Lei Han, “Effect of Capillary Trace on Dynamic Loop Profile Evolution in Thermosonic Wire Bonding”, 2012

[7]

Chun-Hsien Fu, Liang-Yi Hung, etc. “Evaluation of New Substrate Surface Finish: Electroless Nickel/Electroless Palladium/Immersion Gold (ENEPIG)”, 2008

[8]

Kuldip Johal, Sven Lamprecht, Hugh Roberts, ”Electroless nickel/electroless palladium/immersion gold plating process for gold-and aluminum-wire bonding designed for high-temperature applications”, 2000

[9] Chunyan Nan, Michael Mayer, etc. “Golden bump for 20 micron diameter wire bond enhancement at reduced process temperature”, 2011

[10]

Young K. Song and Vanja Bukva, “Challenges on ENEPIG Finished PCBs: Gold Ball Bonding and Pad Metal Lift”, 2017

Multitran dictionary

English-Russian forum   EnglishGermanFrenchSpanishItalianDutchEstonianLatvianAfrikaansEsperantoKalmyk ⚡ Forum rules
		✎ New thread | Private message	Name	Date
3	74	ОФФ вирусные ветки?	leka11	8.12.2021	11:10
	33	родительский тариф	shurumdirum	8.12.2021	11:38
1	31	system powering the unit	adelaida	8.12.2021	9:32
1	32	transducer sheath	adelaida	8.12.2021	9:29
1	35	parenting with influence	olegborisov	8.12.2021	9:51
8	114	proof  | 1 2 all	Bill Board1	7.12.2021	23:03
7	198	Названия концертов  | 1 2 all	Tae_tae	7.12.2021	15:58
17	221	Расслышать слова в видео британский английский  | 1 2 all	Jerk	6.12.2021	19:10
8	173	«кто о чём»  | 1 2 all	arthastrasza	7.12.2021	14:08
3	162	Расшифровка аббревиатуры WOT  | 1 2 all	Елена9364	7.12.2021	10:43
3	234	Прошу проверить мой перевод  | 1 2 all	finance	6.12.2021	18:47
64	1402	Транскрипция  | 1 2 all	aksa	12.11.2021	23:21
6	84	Circular run-out tot. max  | 1 2 all	anyaiulya	7.12.2021	11:47
21	661	Где послушать произношение  | 1 2 all	Susan	19.11.2021	14:07
10	256	Найти синонимы  | 1 2 all	Destiny5562	5.12.2021	23:36
600	19181	Проблемы в работе нового сайта  | 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 all	4uzhoj	15.05.2019	11:05
1	261	Просто классный ролик — посмеяться на выходные	niccolo	4.12.2021	23:16
6	406	OFF: Стрижка «под Канадку».  | 1 2 all	Alex1888	1.12.2021	14:31
2	128	Инструменты и термины ортопедии  | 1 2 all	Plavunez	5.12.2021	23:14
6	154	shin washer	ochernen	5.12.2021	0:56
3	196	Waiver  | 1 2 all	LordBEleth	1.12.2021	21:30
4	163	Ордер адвоката  | 1 2 all	Garbuziabr	1.12.2021	22:43
4	114	Radial/Anti-Radial  | 1 2 all	adelaida	4.12.2021	0:42
14	246	Carrington elevators  | 1 2 all	ochernen	2.12.2021	11:27
	130	Свидетельство о браке	Larisochka	3.12.2021	19:29
4	127	Помогите перевести / OSA Original Side Appeal , CMP Civil Miscellaneous Petition  | 1 2 all	fddhhdot	3.12.2021	18:13
7	126	services implement specifications  | 1 2 all	Miche	3.12.2021	12:53

Workshop – Делаем разварки. Часть 2 «ПЕРЕЗАГРУЗКА» – BODYBEAT

С тех пор как был сделан первый пост про разварки утекло много воды. Тогда это была проба этой темы и что приятно – тема эта вызвала большой интерес публики. Когда писался тот пост, я знал что он будет не единственным на тему разварок. Метод там описанный хорош в определенных условиях, но имеет большой недостаток – надо два комплекта дисков чтобы из них сделать один. Как-то затратно – не правда ли?.. Гораздо более интересным и правильным мне показался другой метод. Нужен всего один комплект дисков, доступна любая ширина, полка получается более красивая.

Мы долго не писали про второй способ изгтотовления разварок потому, что хотели сами все попробовать и описать собственный опыт. Все для вас!

Без лишней лирики – сразу к делу. Взяли комплект дисков. Лучше в нормальном состоянии. В нашем случае был уже бывший в употреблении комплект. Общая идея описывается следующей иллюстрацией.

Внешний обод диска распиливаем примерно в середине, перпендикулярно оси вращения, но чуть ближе к наруже относительно мест сварки внешнего обода и ступичной части диска.(Это самое сложное предложение в статье.) Надо быть аккуратным и не резать ступичную часть, во всяком случае не насквозь. Мелкий порез не страшен – потом в этом месте будет сварка. Аккуратно отделяем две части диска друг от друга. Некоторые умудряются отпиливать ножовкой, но гораздо лучше это делать на токарном станке – гораздо ровнее и точнее получается.

Ровно отрезаем полосу металла нужной ширины и гнем ее. Толщина металла на сколько помню 3мм. Гнуть можно как угодно, но лучше специальными роликами. Далее берем часть диска со ступицой и к ней прихватываем полосу. Ступичная часть хорошо придерживает полосу и задает ей правильное направление. (Следующие три фотки с черным диском я утащил у наших коллег из комментариев в первой статье)

Далее прихватываем полосу к второй части диска. И провариваем все швы, стараясь сделать так чтоб диск не повело. Хорошо если есть возможность автоматической сварки вращающейся детали – так все гораздо прочнее и предсказуемей.

Зачищаем швы – проверяем что все держится. Хорошо если у вас есть токарный станок чтобы зачистить шов на полке диска в том месте где он будет потом радовать глаз. Это к тому же поможет подправить геометрию диска если она немного нарушилась(а это очень веротяно). Даже если все сделано аккуратно – до покраски желательно получившиеся диски прокатать, чтобы быть уверенным в их геометрии. Наши разварки порадовали качеством и не смотря на кажущийся не очень ровным обод (диски то были б/у) показали минимальное биение.

Далее отправляем диски в покраску. Наши были отпескоструены и покрашены порошковой краской. На той стороне диска что обычно скрыта от глаз шиной было решено оставить усиление шва сварки(т.е. сам шов). На лицевой стороне шов был сточен. Диски собрали без камер и они отлично держат давление. Спасибо заводским условиям изготовления и автоматической сварке.

Как наши разварки встали на машину смотрите в разделе про Низкую астру и кокретно вот в этой записи.

Справедливости ради я отмечу, что метод этот универсальный во всех смыслах. Я предположил тут с самого начала, что чаще всего всем надо разваривать диск наружу, чтобы получилась полка и специфичный вид. Но нужды и идеи бывают разные. Разварить диск можно и в другую сторону.

С тестовой разваркой у нас так и получилось. Мы этому были не очень рады в тот момент, но зато теперь можем тут показать вто эти фотки. Швы дополнительно не обработаны и их хорошо видно.

Если включить капельку фантазии – совсем не трудно догадаться, что можно разваривать диск в обе стороны сразу.

Отвечу заранее на возможные вопросы. Мы делали разварки из дисков 16 дюймов. Тестовый диск был разварен на два дюйма. Но при примерке задняя арка Астры села на резину. В итоге комплект мы сделали с расширением в 40мм. Была грандиозная идея сделать видео процесса изготовления, но не всем планам суждено сбываться.

И вот еще. Один из главных вопросов почему и зачем все это? Разварки это пожалуй самый дешевый способ сделать диски большой ширины и что не менее важно – желаемой ширины. Внешний вид оставляет намек на сток – это уже вопрос стиля и восприятия.

 

This entry was posted by Михаил Жуков in Лента and tagged Astra, wide steel rims, wide steel wheels, диски, мастерская, разварка, разварки.

определение разматывания по The Free Dictionary

Таким образом, Паук, упорно следивший за Эстеллой, перехитрил многих более ярких насекомых и часто разворачивался и падал в нужный момент. Огромное, похожее на змею тело скручивалось вокруг своей добычи. Первый помощник разворачивался, как пружина с пружиной. приятный, хриплый, приятный звук, наполовину мурлыканье, наполовину мяуканье, вытянул лапы в воздухе, перевернулся и снова свернулся клубочком. Это был город машин и высоких труб, из которых во веки веков тянулись бесконечные змеи дыма. , и никогда не разматывался.В нем был черный канал, и река, лиловая от дурно пахнущей краски, и огромные груды зданий с окнами, где весь день дребезжали и дрожали, и где работал поршень паровой машины. монотонно вверх и вниз, как голова слона в состоянии меланхолического безумия. Он разматывал свою травяную веревку — это было последнее дополнение к его вооружению, но он умел с ней. землю и свернулся и размотался один или два раза, чтобы убедиться, что каждая ступня его длинного тела находится в рабочем состоянии.Мгновенно Змей развязался с его шеи и, коснувшись влажной земли, снова принял форму прелестной девушки. Когда они это сделали, фигура в углу самодовольно размотала все веревки и позволила им упасть. Внешний вид настолько похож на то, что можно увидеть в каждом потоке, где поток разматывается длинными полосами из пены, собранной в водоворотах, что я должен приписать этот эффект аналогичному действию воздушных или морских течений. в нем особенно одна река, могучая большая река, которую вы могли видеть на карте, напоминающую огромную змею, развернувшуюся, с головой в море, с покоящимся телом, изгибающимся издалека над обширной страной, и с его хвостом, потерянным в глубинах земли.«Тем не менее, мы перейдем к Доусону». Он размотал кнут. Трое мужчин подбирают метлы и используют ручки, чтобы вырвать собаку из плотной хватки питона. После нескольких минут борьбы им, наконец, удается распутать хвост змеи, а двое других удерживают неподвижную собаку.

Объяснение раскрутки происхождения у эукариот

Чтобы исследовать активность мотора CMG при окружении дцДНК, мы разработали три Т-образных ДНК-субстрата, которые блокируют пассивное скольжение по двум негомологичным плечам в Т-соединении (Рисунок 2A и Рисунок 2 — рисунок Приложение 1).Если CMG не пассивный, а вместо него двигатели CMG на дцДНК с силой, он может расплавить плечи Т-образного соединения и произвести размотанные изделия, при условии, что плечи не слишком длинные для плавления CMG. Подобные субстраты использовались для изучения кольцевых геликаз, которые отслеживают дцДНК с силой, включая геликазу DnaB E. coli и мотор сегрегации хромосомы FtsK (Bigot et al., 2005; Crozat and Grainge, 2010; Kaplan and O’Donnell , 2004; Любимов и др., 2011). Т-субстраты содержат 3 ‘дТ-хвост оцДНК, который требуется для загрузки CMG (рис. 2а и рис. 2 — дополнение к рисунку 2), за которым следует слитное соединение оц / дцДНК, которое позволяет CMG перемещаться на дцДНК, не раскручивая его (Kang et al. ., 2012; Langston and O’Donnell, 2017), после чего он сталкивается с блоком Т-образного соединения негомологичных плеч (рис. 2а). Три Т-образные ДНК идентичны, за исключением длины разветвленных плеч (20, 30 или 60 п.н.). Негомологичные ответвления отжигают с радиоактивно меченным «C» олиго ³² P. Прохождение блоков T-плеча требует, чтобы CMG перемещалась с силой, окружая дцДНК, чтобы одновременно расплавить оба плеча, поэтому Т-субстрат с плечами 30 п.н. требует плавления всего 60 п.н. для высвобождения ³² P-C oligo.

CMG перемещается с силой, окружая дуплексную ДНК.

( A ) Схема реакций с использованием Т-субстратов с 3 ‘dT ₃₀ хвостом оцДНК для загрузки CMG, гладким ss / ds-переходом и 35 п.н. дцДНК (зеленый), предшествующих негомологичным блокам плеч (синий и оранжевый). См. Рисунок 2 — приложение к рисунку 1 для получения подробной информации о подложках.Для разматывания ³² P-образного поперечного стержня (помеченного *) требуется, чтобы CMG отслеживал с силой при окружении дцДНК. ( B ) Нативный гель для электрофореза в ПААГ с динамическими реакциями с использованием CMG (без Mcm10) на Т-субстратах с разной длиной плеч. ( C ) Повторение ( B ) с добавлением Mcm10. ( D ) Графики данных из ( B ) и ( C ). Показанные значения представляют собой среднее значение трех независимых экспериментов, а полосы ошибок показывают одно стандартное отклонение.Звездочки справа от гелей показывают гелевый сдвиг субстрата за счет CMG и Mcm10. См. Также рисунок 2 — дополнения к рисункам 2–3.

https://doi.org/10.7554/eLife.46515.003

CMG предварительно инкубировали с Т-субстратами в течение 10 минут, а затем добавляли АТФ для инициации раскручивания, как показано на Фигуре 2А. Избыток немеченого олиго C был добавлен через 1 ’в качестве ловушки для предотвращения повторного отжига любого развернутого олиго ³² P-C. CMG имеет только слабую активность в плавлении плеч 20 п.н. и не может дестабилизировать плечи 30 п.н. или 60 п.н. (Рисунок 2B, D).Однако после добавления Mcm10 CMG размотал все три Т-субстрата (рис. 2C, D). Сам по себе Mcm10 не проявляет активности в этих анализах (рисунок 2 — приложение к рисунку 3). Результаты согласуются с предыдущими исследованиями, показывающими, что Mcm10 стимулирует активность геликазы CMG, увеличивает процессивность CMG во время раскрутки (Langston et al., 2017; Lõoke et al., 2017) и требуется для активации раскрутки CMG в исходных точках (Douglas et al., 2018; Kanke et al., 2012; van Deursen et al., 2012; Watase et al., 2012; Yeeles et al., 2015).Возможные роли Mcm10 в стимулировании раскручивания CMG при окружении дцДНК представлены в обсуждении. Степень раскручивания уменьшается по мере увеличения длины негомологичных плеч, указывая на либо ограниченную процессивность CMG + Mcm10 в направленной транслокации дцДНК, либо что CMG вытесняет не отслеживающую цепь и переходит к транслокации оцДНК при раскручивании более длинных Т-субстратов; вытеснение нити привело бы только к частичному раскручиванию с последующим быстрым внутримолекулярным повторным отжигом для преобразования исходного субстрата, тема, которую мы рассмотрим позже.

Предыдущие исследования мульти-субъединичных кольцевых моторов, которые окружают и отслеживают dsDNA, показывают, что они в первую очередь контактируют с одной цепью дуплекса. Двумя наиболее хорошо изученными примерами являются двигатель упаковки ДНК phi29, который отслеживает только одну цепь, окружая дцДНК (Aathavan et al., 2009), и бактериальный зажимной загрузчик, который также окружает дцДНК, но контактирует только с одной цепью (Simonetta et al. ., 2009) (рисунок 3 — приложение к рисунку 1). Точно так же криоЭМ-структура CMG на разветвленной ДНК показывает, что цепь транслокации принимает спиральную форму B-формы в моторных доменах (Рисунок 3 — рисунок в приложении 1), подразумевая, что моторы не должны изменять конформацию, чтобы окружать дцДНК (Abid Ali et al. al., 2016; Георгеску и др., 2017). Соответствующая спираль оцДНК в центральном канале является общей чертой всех репликативных структур геликазы, исследованных до сих пор (Gao et al., 2019; O’Donnell and Li, 2018; Parker et al., 2017). Эти данные предполагают, что CMG может отслеживать одну цепь, окружая дцДНК. Транслоказы связывают отрицательный фосфатный остов для подвижности (Kaplan, O’Donnell, 2004; Любимов и др., 2011; Parker et al., 2017), и, таким образом, чтобы проверить CMG на отслеживание на одной цепи дцДНК, мы поместили десять нейтральных метилфосфонатных связей. на любой цепи дуплекса, предшествующего плечам Т-субстрата (рис. 3A и рис. 3 — приложение 2), стратегия, используемая для идентификации отслеживающей цепи для двигателя phi29 (Aathavan et al., 2009). Когда метилфосфонатные связи находились на 3’-5 ’цепи в направлении раскручивания, раскручивание дуплекса было значительно снижено по сравнению с метилфосфонатными связями на противоположной цепи (рис. 3B, C). Этот результат согласуется с отслеживанием CMG в основном на 3’-5 ’цепи, окружающей дцДНК, которая также является цепью отслеживания для активности геликазы при окружении оцДНК. Это примечательно, учитывая, что в неактивном двойном гексамере Mcm2-7 каждое кольцо имеет одинаковое количество контактов с цепями 3′-5 ‘и 5′-3’ (Abid Ali et al., 2017; Noguchi et al., 2017). Следовательно, взаимодействие дуплексной ДНК посредством MCM и CMG принципиально различается.

Взаимодействие цепей CMG + Mcm10 во время дуплексной транслокации.

( A ) Схема встречающейся в природе отрицательно заряженной фосфодиэфирной связи в фосфатном остове цепи ДНК (слева) и незаряженных метилфосфонатных связей, использованных в этих экспериментах (справа).( B ) Эксперимент на Фигуре 2C (CMG + Mcm10) был повторен с использованием субстрата T30 с 10 нейтральными метилфосфонатными связями (показаны розовым цветом на схемах над гелем) в 5′-3′-цепи (слева) или в прядь 3′-5 ‘(правая) дуплекса. См. Рисунок 3 — дополнение к рисунку 2 и дополнительный файл 1 для получения дополнительных сведений о носителе. Знак * рядом с гелями указывает на гелевый сдвиг субстрата на CMG + Mcm10. ( C ) График данных из ( B ) показывает средние значения трех независимых испытаний с использованием этих субстратов.Планки погрешностей показывают стандартные отклонения. См. Также рисунок 3 — дополнение к рисунку 1.

https://doi.org/10.7554/eLife.46515.007

Исследования рисунков 2 и 3 показывают, что CMG + Mcm10 отслеживает дцДНК с силой и взаимодействует с 3’-5 ’цепью больше, чем с 5’-3’. На основе этих наблюдений мы выдвинули гипотезу, что стоящие лицом к лицу CMG, окружающие дцДНК и толкающие друг друга в источниках, будут тянуть противоположные нити дуплекса, обеспечивая силу, необходимую для плавления источника.Чтобы проверить это, мы разработали линейный дуплекс с сайтами загрузки CMG на обоих концах, чтобы имитировать источник, в котором два CMG ориентированы лицом к лицу на дцДНК (рис. 4A). Субстрат поддерживает загрузку двух (по крайней мере) противоположно ориентированных комплексов CMG на дуплексную ДНК, которые будут перемещаться друг к другу и сталкиваться таким же образом, как CMG в исходной точке, но без необходимости сборки геликазы CMG с помощью нескольких факторов инициации (рис. 4A). , середина). Это позволяет нам определить, присуща ли дуплексная активность плавления, необходимая в исходных точках, комплексам CMG + Mcm10, идущим в прямом направлении, или необходимы дополнительные факторы.В этом анализе, если субстрат разматывается, олиго-ловушка предотвращает повторный отжиг, образуя вилку с размотанной нитью, меченной ³² P, и структура вилки перемещается в геле медленнее, чем исходный субстрат (рис. 4A, внизу).

Прямые CMG раскручивают дцДНК.

( A ) Схема реакции с двусторонним субстратом и два возможных процесса, которые могут привести к раскручиванию ДНК.Цветовая схема такая же, как на рисунке 1. CMG смешивают с субстратом на льду, а затем инкубируют при 30 ° C в отсутствие АТФ (вверху), чтобы дать реакции достичь температуры. Спустя 1 ‘добавляется АТФ, чтобы позволить группам CMG загружаться в дуплекс в противоположных ориентациях и блокировать прохождение друг друга (в центре). Одновременно с АТФ добавляется Mcm10, чтобы инициировать реакцию разматывания дуплекса. 45 ‘спустя добавляется олиго-ловушка оцДНК (оранжевый), который гасит дальнейшую загрузку CMG (Рисунок 4 — рисунок в приложении 1), а также отжигается с размотанным радиоактивно меченным продуктом, создавая разветвленную структуру (внизу), которая мигрирует в определенное положение в гель от субстрата.Раскручивание может происходить либо путем срезания цепи (стрелка влево), либо путем вытеснения цепи (стрелка вправо) с образованием CMG, которые окружают оцДНК для обычной геликазной активности. ( B ) Динамика результатов в геле в собственном ПААГ с использованием CMG + Mcm10. Дорожки 1-5 показывают реакцию с использованием двустороннего субстрата, описанного в ( A ), в то время как дорожки 6-10 и 11-15 показывают контрольные реакции с использованием того же дуплекса только с одним хвостом на одном или другом конце. Миграция субстратов и размотанного / захваченного продукта указана слева и справа от геля.( C ) График данных из ( B ) показывает средние значения трех независимых испытаний с использованием этих субстратов. Планки погрешностей показывают стандартные отклонения. См. Также рисунок 4 — дополнения к рисункам 2–3.

https://doi.org/10.7554/eLife.46515.010

Принимая во внимание, что кольцевые геликазы, такие как CMG, неэффективны для переноса на ДНК, мы предполагаем, что связывание двух CMG с одним субстратом, вероятно, является редким событием. Чтобы еще больше снизить вероятность загрузки> 2 CMG, мы минимизировали возможность связывания CMG с субстратом следующим образом.Сначала CMG смешивали с субстратом на льду, а затем инкубировали в течение 1 мин при 30 ° C в отсутствие АТФ, чтобы позволить смеси достичь температуры реакции. Затем добавляли АТФ, чтобы инициировать загрузку CMG и транслокацию дуплекса вместе с Mcm10, чтобы инициировать плавление дуплекса (Douglas et al., 2018; Kanke et al., 2012; van Deursen et al., 2012; Watase et al., 2012; Yeeles и др., 2015). Затем через 45 с после добавления АТФ и Mcm10 мы добавили олигонуклеотид-ловушку, который гасит дальнейшую загрузку CMG (рисунок 4 — приложение к рисунку 1).Как показано на рисунке 4B (дорожки 1–5), CMG легко разматывает двусторонний субстрат в присутствии Mcm10. Кроме того, раскрутка продолжается намного дольше времени добавления ловушки, тем самым исключая возможность того, что для раскрутки потребуются дополнительные события загрузки CMG (см. Рис. 4B и C; также см. Рис. 4 — дополнение к рисунку 1 для оценки эффективности ловушки). Реакция полностью зависит от добавления Mcm10 (рисунок 4 — приложение к рисунку 2), а также требует АТФ и CMG (рисунок 4 — приложение к рисунку 3), показывая, что наблюдаемое раскручивание является продуктом АТФ-зависимой моторной активности CMG, связанной с Mcm10. функция, а не продукт отдельно действующих CMG или Mcm10.Реакция также требует загрузки комплексов CMG «голова к голове», поскольку дуплексы только с одним концом загрузки CMG на одном или другом конце были по существу неактивными по сравнению с двусторонним субстратом (рис. 4B, дорожки 6–15 и рис. 4C). . В общем, эти результаты демонстрируют, что комплексы CMG «голова к голове» вместе с Mcm10 могут выполнять плавление ДНК, необходимое в источниках репликации, без участия каких-либо других факторов. Кроме того, результаты согласуются с действием двух независимых CMG, сталкивающихся друг с другом на дцДНК, в отличие от сильно взаимосвязанных и взаимозависимых, но неактивных комплексов Mcm2-7 в двойном гексамере.

Два объяснения разматывания при прямом соединении CMG-Mcm10 показаны на рисунке 4A. Один процесс включает в себя срезание нити (рис. 4А, стрелка влево), что наблюдается в реакциях с использованием Т-субстрата, в которых два негомологичных плеча раздвигаются (рис. 2 и 3). Альтернативный процесс состоит в том, что как только достаточное количество дцДНК разматывается, не отслеживающая цепь может быть вытеснена из внутренней камеры CMG, что позволяет завершить раскручивание с помощью обычной активности геликазы CMG, в которой CMGs окружают и перемещают 3′-5 ‘на оцДНК ( Рисунок 4A, стрелка вправо).

В попытке выяснить, происходит ли вытеснение цепи во время раскручивания, мы сконструировали модифицированный Т-субстрат, в котором два некомплементарных плеча Т-субстрата по 50 п.н. отожжены для разделения олигонуклеотидов с 5 ‘створками, что позволяет нам контролировать раскручивание. каждой руки независимо от другой (рис. 5А). Это контрастирует с подложкой на Рисунке 2, где оба Т-образных рычага должны были быть расплавлены, чтобы наблюдать раскручивание (см. Рисунок 5 — дополнение к рисунку 1). Для субстрата на фиг.5 5 ‘лоскут в олиго’ C ‘на верхнем плече субстрата (фиг.5А, слева) был создан с использованием обратной полярности 3′-3′ связи около основания лоскута, чтобы предотвратить загрузку CMG на то, что в противном случае было бы 3-футовой заслонкой (рис. 5 — дополнение к рисунку 2).Другой олиго с 5’-створками на нижнем плече упоминается здесь как «D» -олиго. Для этих реакций используются две ловушки олигонуклеотидов для предотвращения повторного отжига размотанных продуктов: ^{ловушка} E предотвращает повторный отжиг развернутого олиго C до олиго B, в то время как ^{ловушка} A представляет собой немеченую версию олиго A, которая предотвращает размотку олиго B и / или D. от повторного отжига до радиоактивно меченного олиго А (рис. 5А, справа). Этот экспериментальный план позволяет визуализировать все возможные результаты продукта транслокации CMGM на дцДНК, включая то, будет ли CMG постоянно окружать дцДНК или может ли он вытеснить одну цепь, чтобы охватить только отслеживающую цепь в какой-то момент процесса (см. Рис. 5A, D).

CMG + Mcm10 предпочтительно разматывает следящий рычаг Т-подложки.

( A ) Схема субстрата и возможных продуктов реакции в зависимости от пути разматывания. Олиго A помечен радиоактивной меткой на 5′-конце ( ³² P), а олиго C содержит связь обратной полярности (3′-3 ‘) для создания 5’-створки, которая предотвращает загрузку CMG на олиго C (Рисунок 5 — приложение к рисунку 2 ).В реакции используются две ловушки, каждая в 40-кратном избытке над субстратом: одна представляет собой немеченый олиго A ( ^{ловушка,} A, зеленый и оранжевый), что предотвращает повторный отжиг размотанных олиго D или B до размотки ³² П-олиго А; другой — олиго E ( ^{ловушка,} E, синий), который комплементарен олиго C и, таким образом, предотвращает повторный отжиг развернутого олиго C до олиго B. Эти ловушки показаны отожженными для возможных продуктов (справа). ( B ) Типичный образец нативного ПААГ-геля временного графика анализа с использованием CMG + Mcm10.Положение миграции указанных создателей ДНК показано слева, а ход реакции — справа. ( C ) График данных из ( B ). Показанные значения представляют собой среднее значение трех независимых экспериментов, а полосы ошибок показывают одно стандартное отклонение. ( D ) Схема пути изгнания цепи. CMG частично раскручивает два гетерологичных плеча, создавая оцДНК (вверху в середине), а затем не отслеживающая цепь B выталкивается к внешней стороне кольца (вверху справа), после чего CMG окружает оцДНК (внизу справа) и завершает раскручивание нижней махнул рукой (внизу слева).( E ) Схема пути сдвига ДНК. CMG расплавляет оба плеча (вверху в середине), но с неравной скоростью (вверху справа), так что нижнее плечо с отслеживающей цепью полностью разматывается перед верхним плечом (внизу справа), оставляя CMG окружающим не отслеживающую оцДНК (внизу слева). См. Также рисунок 5 — дополнение к рисунку 1.

https://doi.org/10.7554/eLife.46515.014

Когда CMG загружается на начальный дуплексный сегмент модифицированного субстрата, он может следовать одним из двух путей.Если CMG перемещается исключительно на дуплексной ДНК во время реакции и расплавляет оба негомологичных плеча, то оба закрытых олигонуклеотида (олигонуклеотиды C и D на рисунке 5A, в середине справа) будут высвобождены под действием мотора CMG. В качестве альтернативы возможно, что CMG будет плавить только олиго D (рис. 5A, вверху справа). Например, если CMG первоначально перемещается на дцДНК и расплавляет часть негомологичных плеч, а затем вытесняет не отслеживающую цепь, только нижний крылатый олиго D будет разматываться (рис. 5A, D).Тот же результат может возникнуть, если CMG остается на дцДНК, но быстрее плавится олиго D по сравнению с олиго C (рис. 5A, E). В качестве альтернативы, несмотря на отсутствие 5-дюймового клапана на начальном промывном дуплексном сегменте, CMG может воспользоваться термическим истиранием на промывном конце и раскрутить 3′-хвостовой олиго ( ³² P-олиго A на рисунке 5A, внизу справа ) от остальной части субстрата. Предыдущие эксперименты с подобными субстратами показывают, что раскручивание смываемых дуплексов незначительно (Langston and O’Donnell, 2017).Помечая радиоактивной меткой 3’-хвостовой олиго «А», эти потенциальные продукты наблюдаются в виде отдельных полос в нативном геле (рис. 5В). Условия реакции идентичны условиям экспериментов на рисунке 2C (CMG + Mcm10) за исключением модифицированной конструкции подложки и использования двух ловушек для предотвращения повторного отжига размотанных подложек (см. Рисунок 5A, справа).

Результаты эксперимента с модифицированным субстратом показывают, что плавление олиго D является наиболее заметным продуктом реакции, проявляющимся в виде четкой и отчетливой полосы в геле уже через 90 минут после начала реакции (полоса, обозначенная * ABC в Рисунок 5B) и происходит на 40% подложек в течение всего рабочего дня (Рисунок 5C).Напротив, ожидаемый продукт для CMG, окружающего дцДНК и плавления обоих плеч одновременно, составлял ~ 10% от общего количества субстрата (* AB на фиг. 5B, C), как показано на фиг. 2 для субстрата плеча длиной 60 п.н. Непрерывная транслокация оцДНК в течение всего эксперимента была второстепенным результатом (~ 5%, * A на рис. 5B, C), как и ожидалось, потому что на начальном дуплексном сегменте нет 5 ‘лоскута, что дополнительно подтверждает вывод о том, что CMG плавно перемещается с оцДНК на дуплекс заподлицо, не разматывая его, как уже отмечалось ранее (Langston and O’Donnell, 2017).

Как обсуждалось выше, плавление олиго D можно объяснить либо тем, что CMG + Mcm10 вытесняет не отслеживающую цепь (рис. 5D), либо тем, что CMG + Mcm10 непрерывно окружает дцДНК, но плавит олиго D быстрее, чем олиго C (рис. 5E). Хотя мы не можем провести различие между этими двумя механизмами, мы отмечаем, что гейт оцДНК был ранее продемонстрирован для Drosophila CMG (Ilves et al., 2010; Moyer et al., 2006), и впоследствии было показано, что он распространяется на человеческий CMG и S .cerevisiae CMG (Kang et al., 2012; Лэнгстон и О’Доннелл, 2017). Кроме того, в недавних исследованиях одиночных молекул мы показали, что CMGM действуют как отдельные частицы и что CMGM на дцДНК при встрече с вилкой, покрытой RPA, вытесняет одну нить и переходит в окружение оцДНК, где она медленно перемещается, раскручивая дуплекс (Вассерман и др. ., 2018). Несмотря на это, ансамблевые эксперименты на фиг. 5 не могут строго различить, вытесняет ли CMG + Mcm10 не отслеживающую цепь или непрерывно окружает дцДНК, чтобы расплавить олиго D с образованием продукта ABC.

Раскручивание вилки репликации ДНК гексамерной вирусной геликазой

Крио-ЭМ-структура комплекса E1RF

Кристаллические структуры E1HD с ¹⁴ и без ²⁵ АДФ и оцДНК (PDB 2GXA, 2V9P, соответственно ) представляют собой асимметричные гексамерные сборки и демонстрируют сходную архитектуру нуклеотидных и оцДНК-связывающих сайтов, несмотря на присутствие или отсутствие лигандов. Соответственно, мы пришли к выводу, что остановленная сборка E1RF может быть сгенерирована в отсутствие нуклеотидов и без использования искусственных препятствий ДНК ¹⁶ для препятствования транслокации.Комплекс гексамерной E1-репликационной вилки (E1RF), остановившийся в RFJ, был собран и очищен, как описано ранее (рис. 1c) ²⁹ . Субстрат репликационной вилки ДНК (RF) состоял из 30 пар оснований дцДНК, 3′-Т20-активной цепи оцДНК (цепи, по которой перемещается геликаза, или ведущей цепи репликации ДНК) и 5′-пассивной цепи из 13 оснований (отставание репликации). ) прядь (рис. 1б, см. раздел «Методы»). Используемый субстрат вилки активно разматывается геликазой, в то время как субстраты без 5′-пассивной нити менее эффективны, а субстраты без активной 3′-нити не разматываются в значительной степени ²⁹ (рис.1г).

Крио-ЭМ-данные комплексов E1RF были собраны на микроскопе Titan Krios, работающем при 300 кэВ, с использованием камеры Gatan K3 и обработаны с использованием RELION 3.0 ³⁰ и cryoSPARC v2.1 ³¹ (дополнительная таблица 1 и дополнительные рисунки. 1 и 2, см. Раздел «Методы»). Средние значения класса 2D крио-ЭМ-изображений E1RF показали отчетливую двухуровневую структуру, которая, как подтверждено, является воротником и доменами AAA + модуля E1HD (Рис. 2a, Дополнительный Рис. 1). От E1HD идет стержень с плотностью шириной ~ 20 A, слегка наклоненный относительно его центральной оси (17 °), с основной плотностью на его внешней стороне (рис.2). Существует также плотность в центральном канале E1HD, указывающая на связывание оцДНК, и, следовательно, был сформирован стабильный комплекс с вилкой ДНК. Диффузная плотность, видимая над областью E1HD в средних значениях класса, предполагает гибкое расположение некоторых OBD ​​и N-концевых субдоменов (дополнительные рисунки 1a и 3).

Рис. 2: Структура E1RF.

a Вид сбоку (слева) и вертикальный центральный срез (справа) карты E1RF EM (серым цветом) с подогнанными атомными моделями RF DNA (синий) и доменов E1HD и OBD.Субъединицы A – F E1RF показаны розовым, красным, оранжевым, желтым, зеленым и фиолетовым цветом соответственно (и на всех последующих рисунках). b Соответствующая атомная модель раскручивающейся репликационной вилки и OBD B и OBD E, взаимодействующих с дцДНК и 5′-цепями оцДНК, соответственно, вид сбоку (слева) и сверху (справа). Указаны углы между дцДНК и 5′-оцДНК.

КриоЭМ карта E1RF была получена с разрешением 3,9 Å (рис. 2, дополнительные рисунки 1 и 2). Структура однозначно демонстрирует положения дцДНК, активной цепи 3’ssДНК во всем центральном канале E1HD и пассивной цепи 5’ssДНК, расположенной на вершине воротникового кольца (рис.2). На атомную модель дцДНК можно было наложить стержень плотности, выступающий из центра гексамера. ДцДНК примыкает к 3′-цепи оцДНК, расположенной в центральном туннеле связывания оцДНК E1HD, и к 5′-пассивной цепи оцДНК (рис. 2). Точка отделения дцДНК, RFJ, расположена на входе в туннель воротника. Основываясь на положениях оцДНК-связывающих β-шпилек, мы выровняли структуру E1RF относительно кристаллических структур ^14,25 , как описано ниже.Для прямого сравнения мы пометили шесть белковых субъединиц сборки E1RF A – F, что соответствует обозначению субъединицы в кристаллических структурах E1HD.

Примечательно, что крио-ЭМ структура имеет два четко определенных объема в дополнение к E1HD и ДНК. Один расположен на ~ 25 Å выше воротникового кольца E1HD и прикреплен к дцДНК, а второй, на противоположной стороне, находится в нижнем положении, связанном с 5’ssДНК (рис. 2а). Плотность, соответствующая E1 NtDs (рис. 1a), не была разрешена на карте EM, что позволяет предположить, что эти части комплекса неупорядочены.Примечательно, что плотности для C-концевого кислотного хвоста E1 (C-tT, остатки 579-605, Fig. 1a) были определены для всех шести субъединиц до остатка 598, но моделировались как поли-аланин. Этот домен необходим для стабильности гексамера и процессивного раскручивания ДНК ³² . Остатки C-tT, хотя и присутствуют в белковой конструкции, используемой для получения структуры E1HD, свободной от нуклеотидов и ДНК (но отсутствуют в лиганд-связанной форме ¹⁴ ), не видны на рентгеновской карте ²⁵ .

Позиции бортовых диагностических систем

Два дополнительных блока высокой плотности очень хорошо соответствуют размеру БД ³³ (PDB 1KSX и 1KSY). Ориентация этих OBD ​​из B и E субъединиц (Fig. 2b) определялась связями между их N-концами и соответствующими C-концами воротникового домена E1HD. OBD B и E были лучше определены из-за их взаимодействия с ДНК (дополнительный рисунок 3). OBD субъединицы B взаимодействует с дцДНК, в то время как OBD субъединицы E взаимодействует с 5′-пассивной цепью оцДНК и располагается рядом со стороной воротникового кольца E1HD (рис.2). Другие OBD и связанные с ними NtD других субъединиц были определены хуже, в разной степени, но они окружают дцДНК (дополнительный рис. 3). Анализ OBD A, C, D и F выявил значительную гибкость в их положениях, при этом положения A и C определены наименее.

Взаимодействие E1 OBD B с dsDNA

Рентгеновские структуры E1 OBD показали, что он имеет два ДНК-связывающих сегмента, ДНК-связывающую петлю (DBL, Arg180 – Asn189) и ДНК-связывающую спираль (DBH, Arg243 – Leu254), которые распознают сайты связывания дцДНК в PV ori , связанные с консенсусной последовательностью сайта связывания E1 (E1BS) 5′-ATTGTT ^33,34 .DBL вносит основной вклад в связывание дцДНК за счет общих гидрофильных и ван-дер-ваальсовых контактов, что согласуется с относительно низкой специфичностью связывания и аффинностью взаимодействия. В структуре E1RF автоматическая стыковка (iMODFIT ³⁵ , см. Раздел «Методы») атомной модели OBD E1 (1KSY) в OBD B карты EM привела к среднеквадратическому значению 3,6 Å (рис. 3a, b. ). Хотя последовательность дцДНК вилки не содержит последовательности, подобной E1BS, структура крио-ЭМ указывает, что OBD B взаимодействует с dsDNA посредством взаимодействия между DBL и большой бороздкой в ​​последовательности TGTGA в пассивной цепи ДНК, 16 -20 нуклеотидов из RFJ (рис.3в). Вместе четко определенное взаимодействие OBD B-dsDNA и контакты с другими окружающими, но более свободно расположенными OBD (дополнительный рис. 3) согласуются с предыдущими биохимическими экспериментами по «отпечатку» ²⁹ . Этот анализ продемонстрировал защиту дцДНК от нуклеолитической атаки гидроксильных радикалов, скорее всего, путем прямого контакта с OBD и N-концевыми сегментами E1.

Рис. 3: Взаимодействие OBD B с дцДНК.

a Подходящая атомная модель для OBD-B (красным цветом, α-спирали отмечены) с DBH (Thr239-Asn248) и DBL (Arg180-Asn189), показанными голубым цветом.DBL взаимодействует с дцДНК. b Взаимодействие OBD B рассматривается сверху, показывая, что Lys183 и Lys186 взаимодействуют с дцДНК. c Взаимодействие OBD B с дцДНК, спроецированной на последовательность вилки, взаимодействующая последовательность выделена красным.

Лизины 183 и 186 в DBL OBD консервативны в последовательностях папилломавируса (дополнительный рисунок 4) и, как было продемонстрировано, имеют решающее значение для связывания дцДНК ³⁶ . Чтобы проверить, влияют ли взаимодействия дцДНК с OBD на активность геликазы, мы генерировали белок E1 с аланином в положениях 183 и 186 (K183A / K186A).В анализах геликазы (рис. 4a) почти двукратное снижение раскручивания ДНК наблюдалось для измененного белка (рис. 4b, дополнительный рис. 5a), демонстрируя, что домен OBD играет вспомогательную роль в раскручивании ДНК.

Фиг. 4: Раскручивающая активность мутантов E1.

Были созданы мутации для нарушения взаимодействий с дцДНК (двойной мутант K183A / K186A) и 5′-оцДНК (K168A и K279A в OBD и K310A в междоменном линкере) E1. a Очищенные белки (50, 100, 200 и 400 нМ) анализировали с использованием вилкообразного субстрата (0.1 нМ) с той же последовательностью, которая использовалась для образования E1RF. Кипяток — это термически денатурированный субстрат, а «-» — нативный субстрат (№ E1). b Графическое представление данных ( n = 3 независимых эксперимента; показаны средние значения с ошибками ± стандартное отклонение). Дикий тип (Wt), черная линия; К183 / К186А, синий; К168А, красный; К279А, зеленый; К310А, пурпурный.

Кольцо воротникового домена

В структуре E1RF субъединицы воротникового кольца расположены с почти шестикратной вращательной симметрией, и три нуклеотида оцДНК кажутся вытянутыми через его канал (рис.2а). Кольцо воротника E1RF жесткое и совмещение с кристаллической структурой E1HD / ssDNA / ADP (PDB 2GXA) ¹⁴ указывает на низкое общее структурное отклонение (RMSD 0,65). В структуре E1RF консервативные положительно заряженные остатки Lys356 и Lys359 проецируют свои боковые цепи в канал E1HD, но их ε-аминогруппы находятся по крайней мере на 4 Å от фосфатного остова 5′-оцДНК (рис. 5a, b). Таким образом, сильные электростатические взаимодействия между белком и оцДНК маловероятны, что подтверждается наблюдениями, что замена этих остатков не оказывает значительного влияния на связывание и раскручивание оцДНК ³⁷ .

Рис. 5: Путь выхода 5′-пассивной цепи оцДНК.

a Соответствующая атомная модель соединения вилки ДНК на карте EM (серая сетка). Указаны субъединица D Asn352 и субъединица E Lys310. Остатки Lys356 и Lys359 выделены темно-синим и коричневым цветом соответственно. b и c Атомные модели вписываются в карту плотности EM, чтобы показать взаимодействия Asn352 и Lys310 с оцДНК вблизи соединения репликационной вилки (RFJ). Расположение остатков Lys356 и Lys359 в субъединице D показано синим цветом. d — f Атомарная модель взаимодействия 5′-оцДНК с субъединицей E OBD с указанием Lys168 и Lys279.

Выход 5′-пассивной нити оцДНК

В крио-ЭМ структуре E1RF 5′-оцДНК отклоняется от точки разделения под углом 95 ° относительно оси дцДНК (рис. 2b), проходя через бороздка между субъединицами E1 D и E (рис. 5а). Элементами воротниковых доменов, которые удерживают RFJ, являются остатки петли ³⁵¹ ThrAsnSer ³⁵³ (петля TNS) из α3 – α4-шпилечного поворота в субъединице D воротникового домена E1.Эксперименты по построению отпечатков ДНК показывают, что ДНК в RFJ защищена от нуклеолитической атаки, подразумевая тесные контакты белок-ДНК ²⁹ . Однако нет никаких доказательств того, что эти шпильки непосредственно участвуют в раскручивании dsDNA, поскольку это происходит над шпильками (~ 4 Å), и поэтому расстояния между RFJ и α-α-витком шпильки довольно большие.

Четыре отличительных черты отмечают путь, по которому проходит 5′-цепь оцДНК. Во-первых, оцДНК близка к Lys310 в междоменном линкере между OBD и E1HD (расстояние ~ 2.3 Å, субъединица E), которая, вероятно, вступает в контакт с оцДНК, таким образом фиксируя путь оцДНК (рис. 5b, c, дополнительный рис. 5b). В то время как Lys310 не консервативен в последовательностях папилломавируса (дополнительный рис. 4), мутация K310A показывает значительное снижение (до ~ 50%) активности геликазы, подтверждая его функциональную роль в раскручивании ДНК E1 BPV (рис. 4a). Во-вторых, TNS-петля субъединицы D взаимодействует с ssDNA и смещает ее вверх (Fig. 5a-c). Сопоставление почти 100 последовательностей вируса папилломы из баз данных показывает, что в этом сегменте преобладают полярные остатки; только в некоторых случаях Asn352 замещается серином, треонином и очень редко аланином.Ряд аминокислотных замен, протестированных в положении 352, показал сниженную активность раскручивания ДНК (дополнительные рис. 5c-e). Примечательно, что замены глицина и лизина показали более чем 50% и почти четырехкратное снижение раскручивания, соответственно, указывая на то, что могут потребоваться относительно слабые взаимодействия с ДНК полярным Asn352. Таким образом, вместе Lys310 и Asn352 могут быть оптимальными для направления пути выхода 5′-оцДНК. В-третьих, мы проследили как полиаланин C-концевые хвосты E1 (C-tT).Они начинаются с AAA + домена и образуют петли на интерфейсах субъединиц (Fig. 2a), заканчиваясь внутри щели между субъединицами воротникового домена. Это помещает кислую часть хвоста (аминокислоты 584-594) на ~ 8 Å ниже пути оцДНК (рис. 2a, левая панель и дополнительный рис. 5b). Близость этого сегмента к оцДНК будет вызывать отталкивание между этими электроотрицательными элементами, обеспечивая тем самым беспрепятственный проход оцДНК от подсборки геликазного домена. Наконец, OBD из субъединицы E взаимодействует с 5′-пассивной цепью оцДНК.Линкер (остатки 303–314), связывающий OBD E с E1HD, позволил нам определить его приблизительную ориентацию, которая была уточнена с помощью автоматической стыковки рентгеновской атомной модели (1KSY) (рис. 5d – f, см. «Методы»). » раздел). Подгонка показывает, что Lys168 N-концевой спирали (α1) и Lys279 из спирали α5 OBD близки к оцДНК (3 и 4 Å соответственно), таким образом представляя другую поверхность связывания с ДНК по сравнению с OBD B. Lys168 является консервативным во всех последовательностях E1 папилломавируса, за исключением редких замен на аргинин, тогда как большинство последовательностей PV содержат Lys или Arg в положении, соответствующем Lys279 в BPV E1 (дополнительный рис.4). В анализах геликазы варианты белков E1 K168A и K279A показывают ~ 15% и 30% снижения раскручивания ДНК, соответственно (рис. 4a, дополнительный рис. 5a). Соответственно, Lys168 и Lys279 OBD E могут играть роль в направлении возникающей цепи 5′-оцДНК от двигателя геликазы.

Взаимодействие 3′-оцДНК с E1HD

В обеих кристаллических структурах E1HD (PDB 2GXA с ¹⁴ и 2V9P без ²⁵ связанных кофакторов) связывающие оцДНК сегменты субъединиц расположены в спиральном массиве вдоль ось оцДНК-связывающего туннеля.В E1HD / ssDNA / ADP (PDB 2GXA) взаимодействия с ssDNA опосредуются через консервативные ДНК-связывающие β-шпильки (500–514 аминокислотных остатков) Lys506 и His507 ^14,38 . В структуре 2GXA есть большой промежуток между субъединицами A и F, а β-шпилька субъединицы A расположена наверху лестницы. В комплексе E1RF, как и в E1HD / оцДНК / АДФ, шесть нуклеотидов 3′-цепи оцДНК образуют правую спираль с β-шпильками доменов AAA +, прежде чем она выйдет из канала (рис. 2а, 6а). . В E1RF ДНК-связывающие β-шпильки субъединиц C – E находятся в контакте с ДНК и хорошо выравниваются со структурой 2GXA, в то время как β-шпилька F также контактирует с ДНК в E1RF, она находится немного ниже соответствующей β-шпильки. в 2GXA.Однако существует различие в конформации соответствующих β-шпилек в субъединицах A и B. В то время как в обеих структурах β-шпилька субъединицы A не контактирует напрямую с 3′-оцДНК, в E1RF β-шпилька A расположена на 11 Å ниже соответствующей β-шпильки в кристаллической структуре (рис. 6b). Β-шпилька субъединицы B также не контактирует с 3′-оцДНК, поскольку ее His507 повернут от оцДНК по сравнению с кристаллической структурой (рис. 6а, б). Таким образом, наши наблюдения, по-видимому, согласуются с скоординированным механизмом сопровождения транслокации оцДНК ¹⁴ , хотя другое конформационное состояние, по-видимому, зафиксировано в крио-ЭМ-структуре, где субъединица А β-шпилька отсоединилась от оцДНК и имеет еще не мигрировали обратно на вершину комплекса для повторного взаимодействия с ssDNA.

Рис. 6. Взаимодействие ДНК-связывающих β-шпилек с 3′-оцДНК.

a Вверху слева поперечное сечение E1RF при просмотре сверху, показывающее подобранную атомную модель шести ДНК-связывающих β-шпилек на EM-карте (серая сетка). На нижней левой панели показан вид сбоку той же области, показывающий лестничную организацию β-шпилек. Правые панели показывают те же срезы атомных моделей с боковыми цепями аминокислот, чтобы показать взаимодействия с 3′-оцДНК. b Наложение ДНК-связывающих β-шпилек из подобранной атомной модели крио-ЭМ-карты E1RF (в цветах, соответствующих субъединицам E1) и рентгеновской структуры E1HD / ssDNA / ADP ¹⁴ (в серый, PDB 2GXA). Справа рисунок иллюстрирует пошаговую организацию отдельных ДНК-связывающих β-шпилек в каждой структуре. Показаны His507 и их относительная высота в центральном канале домена AAA +.

Биохимический анализ взаимодействий E1RF-ДНК

Мы проанализировали взаимодействия E1RF-ДНК с помощью анализа отпечатков пальцев, в котором тесные контакты белок-ДНК выявляются за счет защиты ДНК от нуклеолитической атаки гидроксильного радикала (OH •) ²⁹ .Гексамерные геликазные комплексы были собраны с ³² Р-меченых субстратов, полное связывание ДНК было подтверждено гелевым сдвигом, в то время как остаток реакции подвергался воздействию ОН • (см. Раздел «Методы»). Комплекс E1RF дикого типа сравнивали со сборками с E1 K183A / K186A, чтобы исследовать взаимодействие OBD B с дцДНК и E1 K310A / K168A / N352G (нацеленные остатки в междоменном линкере, OBD E и воротниковом домене, соответственно; Фиг. , 5 и дополнительный рис. 5f), чтобы исследовать взаимодействие с компонентом 5′-оцДНК RF-субстрата.Важно отметить, что гомогексамерная природа E1RF не позволяет биохимически исследовать отдельные взаимодействия одной субъединицы.

Следы E1RF OH • (дополнительный рис. 6), визуализированные и количественно оцененные с помощью фосфорного изображения, показывают умеренную и неполную защиту по всей ДНК, как и следовало ожидать от взаимодействий, которые являются обширными, но слабыми и временными. При сравнении 3′-активной цепи RF-комплексов дикого типа и E1 K183A / K186A (дополнительный рис. 6b, d) нуклеотиды оцДНК, близкие к точке раскручивания, демонстрируют очень похожие уровни защиты, в то время как все остальные нуклеотиды 3′-оцДНК показывают увеличение высоты пика (восприимчивость к расщеплению ОН •) до ~ 12%.Однако повышенная восприимчивость к расщеплению OH • наблюдается в дцДНК E1 K183A / K186A-RF, увеличиваясь с расстоянием от RFJ (до ~ 30% увеличения высоты пика), что подразумевает более слабые контакты между белком и дцДНК. На 5′-пассивной цепи ДНК пики продуктов расщепления оцДНК почти идентичны. Однако, опять же, высота пиков увеличивается до ~ 30% в области dsDNA 10-25 нуклеотидов от RFJ для E1 K183A / K186A по сравнению с RF комплексами дикого типа. Сниженная защита дцДНК в E1 K183A / K186A-RF наиболее выражена в области ~ 15–20 оснований от RFJ, наблюдаемой при взаимодействии с OBD B в E1RF (рис.3). Эти наблюдения подтверждают структурные данные, показывающие, что OBD A – D и F окружают dsDNA (Supplementary Fig. 3), при этом B формирует более стабильные контакты с dsDNA (Fig. 3).

Для E1 K310A / K168A / N352G-RF характер расщепления OH • отличается от K183A / K186A и комплексов RF дикого типа. Для 3′-активной цепи ДНК (дополнительный рис. 6b, e) высоты пиков для продуктов расщепления в положениях нуклеотидов дцДНК 6-25 от RFJ почти эквивалентны между вариантом и E1RF дикого типа.Однако высота пиков уменьшается, что означает более тесные контакты с ДНК, в пяти нуклеотидах дцДНК, близких к RFJ, и до девяти нуклеотидов 3’ssDNA, ближайших к RFJ, в E1 K310A / K168A / N352G-RF. Можно предположить, что в этом варианте расположение RFJ было нарушено. В 5′-пассивной цепи ДНК расщепление всех нуклеотидов дцДНК и трех нуклеотидов 5′-оцДНК, близких к RFJ, почти эквивалентно (дополнительный рис. 6e) для мутанта по сравнению с комплексами дикого типа. Однако нуклеотиды 5′-оцДНК в положениях 4-7 от RFJ обнаруживают небольшое усиление защиты для E1 K310A / K168A / N352G-RF.Эти наблюдения предполагают, что остатки Lys310, Lys168 и Asn352 минимизируют стабилизирующие контакты с белком и 5’ssDNA, но необходимы для отведения 5’ssDNA от белкового комплекса во время раскручивания. Более того, путь, по которому проходит 5′-оцДНК через воротничок, является преимущественно нейтральным по характеру (дополнительный рис. 5b), указывая на то, что в целом нет сильных взаимодействий 5′-оцДНК с воротниковым кольцом.

Конформационные изменения в E1HD

Хотя кольцо воротника жесткое, выравнивание между структурой ЭМ и кристаллической структурой E1HD / ssDNA / ADP (PDB 2GXA) показывает изменения в положениях субъединиц воротникового домена, где D и E являются сдвинута на ~ 3 Å вверх в сторону 5′-оцДНК (рис.7а и дополнительный рис. 7). Таким образом, кольцо воротника наклонено на 3 ° как твердое тело относительно его положения, наблюдаемого в обеих рентгеновских структурах ^14,25 . Однако в доменах AAA + трансляционные сдвиги некоторых сегментов значительны, особенно в субъединицах A, B и F, с отклонениями Cα между E1RF и кристаллической структурой 2GXA до 8 Å. Эти различия, наблюдаемые в основном как сдвиги в β-слоях и α-спиралях на периферии комплекса (рис.7, дополнительный рис.8), вероятно, будут наблюдаться из-за связанной RF и естественной некристаллографической среды E1RF в крио-ЭМ. В скоординированной модели сопровождения ¹⁴ шесть AAA + доменов и их ассоциированные ssDNA-связывающие сегменты следуют конформационной волне вокруг комплекса во время транслокации ssDNA (Fig. 7b). Интересно, что спираль α-5 E1HD, по-видимому, действует как главный «шарнир» между воротником субъединицы и доменами AAA +. В структуре E1RF «шарнир» α-5, по-видимому, перемещается на расстояние до 6 Å по волнообразной траектории вокруг субъединиц гексамера A – F (рис.7в). Таким образом, эти наблюдения подразумевают, что движение петли α-5 будет координировать движение как воротника, так и доменов AAA + во время транслокации на оцДНК (рис. 7d и дополнительный фильм 1), с наклоном и подъемом воротникового кольца вслед за волной. -подобное движение вокруг субъединиц, чтобы оттолкнуться от RFJ. Соответственно, транслокация оцДНК и разделение пар оснований с помощью хеликазы E1 связаны. Мы предполагаем, что по мере того, как каждая из шести субъединиц гексамера E1 завершает цикл гидролиза АТФ, протягивая шесть нуклеотидов оцДНК через двигатель AAA +, существует интегральный силовой ход, толкающий RFJ, эквивалентный смещению одной пары оснований (~ 3 Å).Мы предполагаем, что воротник геликазы E1 можно рассматривать как активный механический разделительный клин, управляемый событиями связывания нуклеотидов и гидролиза, а не как простое препятствие для смещения цепи.

Рис. 7: Позиционная вариация доменов субъединиц в E1RF.

a Частичное представление атомных моделей воротниковых доменов E1RF (радуга), наложенных на соответствующие домены рентгеновской структуры E1HD / ssDNA / ADP (серым цветом). Синяя кривая показывает сдвиги воротниковых доменов в ЭМ-структуре по сравнению с рентгеновской структурой, которая достигает максимума под 5’-оцДНК (синий кружок). b Черная кривая показывает сдвиги в ДНК-связывающих β-шпильках в рентгеновской структуре; состояния нуклеотидов на границах раздела субъединиц обозначены коричневыми (АТФ) или бледно-коричневыми (АДФ) треугольниками. c Кривые, отслеживающие движение петли α5 (зеленый) и ДНК-связывающих β-шпилек (красный) в E1RF. d Графическое изображение смещений воротниковых доменов, β-шпилек и точки петли α-5 субъединиц E1RF относительно соответствующих субъединиц в рентгеновской структуре.На точность измерений указывает толщина кривых.

Транскрипция

---

Создано Джорджем Райсом, Государственный университет Монтаны

В общем, ДНК реплицируется путем раскручивания спирали, разделения цепей путем разрыва водородных связей между комплементарными цепями и синтеза двух новых цепей путем спаривания комплементарных оснований. Репликация начинается в определенном участке ДНК, который называется точкой начала репликации.Репликация ДНК является двунаправленной от точки начала репликации. Чтобы начать репликацию ДНК, раскручивающие ферменты, называемые ДНК-геликазами, заставляют две родительские цепи ДНК раскручиваться и отделяться друг от друга в точке начала репликации с образованием двух Y-образных вилок репликации. Эти репликационные вилки и являются фактическим местом копирования ДНК. Белки, дестабилизирующие спираль, связываются с одноцепочечными областями, поэтому две цепи не соединяются повторно. Ферменты, называемые топоизимеразами, производят разрывы в ДНК, а затем воссоединяются с ними, чтобы снять напряжение в спиральной молекуле во время репликации.Поскольку нити продолжают раскручиваться и разделяться в обоих направлениях вокруг всей молекулы ДНК, водородная связь свободных нуклеотидов ДНК с нуклеотидами на каждой родительской нити дает новые комплементарные нити. Поскольку новые нуклеотиды выстраиваются в линию напротив каждой родительской цепи за счет водородных связей, ферменты, называемые ДНК-полимеразами, присоединяются к нуклеотидам посредством фосфодиэфирных связей. Фактически, нуклеотиды, выстраивающиеся путем комплементарного спаривания оснований, представляют собой дезоксинуклеозидтрифосфаты, состоящие из азотистого основания, дезоксирибозы и трех фосфатов.Когда фосфодиэфирная связь образуется между 5′-фосфатной группой нового нуклеотида и 3′-ОН последнего нуклеотида в цепи ДНК, два фосфата удаляются, обеспечивая энергию для связывания. В конце концов, каждая родительская цепь служит шаблоном для синтеза комплементарной копии самой себя, в результате чего образуются две идентичные молекулы ДНК.

---

Транскрипция — это процесс, посредством которого последовательность ДНК ферментативно копируется РНК-полимеразой с образованием комплементарной РНК.Или, другими словами, перенос генетической информации из ДНК в РНК. В случае ДНК, кодирующей белок, транскрипция является началом процесса, который в конечном итоге приводит к трансляции генетического кода (через промежуточный продукт мРНК ) в функциональный пептид или белок. Транскрипция имеет некоторые механизмы корректуры, но они менее эффективны и менее эффективны, чем контроль ДНК; следовательно, транскрипция имеет более низкую точность копирования, чем репликация ДНК. Подобно репликации ДНК, транскрипция происходит в направлении от 5 ‘до 3’ (т. Е. Старый полимер читается в направлении от 3 ‘до 5’, а новые комплементарные фрагменты генерируются в направлении от 5 ‘до 3’).Транскрипция делится на 3 стадии: инициация, элонгация и завершение.

Типы РНК:

• мРНК — информационная РНК является копией гена. Он действует как фотокопия гена, имея последовательность, комплементарную одной цепи ДНК и идентичную другой цепи. МРНК действует как помощник по телефону, чтобы нести информацию, хранящуюся в ДНК в ядре, в цитоплазму, где рибосомы могут превратить ее в белок.
• тРНК — РНК-переносчик представляет собой небольшую РНК, которая имеет очень специфическую вторичную и третичную структуру, так что она может связывать аминокислоту на одном конце и мРНК на другом конце.Он действует как адаптер для переноса аминокислотных элементов белка в соответствующее место, как это закодировано мРНК.
• рРНК — рибосомная РНК является одним из структурных компонентов рибосомы. Его последовательность представляет собой набор участков мРНК, так что рибосома может соответствовать и связываться с мРНК, из которой она будет производить белок.

Развертывание загадки огурца

В усиках ползучего растения исследователи открывают биологический механизм скручивания и натыкаются на пружину необычного типа.

Кембридж, Массачусетс.Ученые из Гарвардского университета, очарованные странным скручивающимся поведением цепких усиков огурца, охарактеризовали новый тип пружины, которая при мягком натяжении становится мягкой, а при сильном — жесткой. если катушка не скручена, то усики огурца на самом деле сворачиваются на , а затем на . Чтобы понять это нелогичное поведение, потребовалось сочетание чесания головы, физического моделирования, математического моделирования и клеточной биологии, не говоря уже о большом количестве силикона.

Неповрежденный усик огурца (вверху) и волокнистая лента (внизу), извлеченные из усика, скручиваются одинаково и предсказуемо. Изучение клеточной структуры этих усиков помогло исследователям понять новый тип пружины. (Изображение любезно предоставлено Джошуа Пьюзи и Шэрон Гербоде.)

Результат, опубликованный 31 августа в выпуске Science , описывает механизм, с помощью которого происходит скручивание огурца, и предлагает новый тип био-вдохновленной пружины без закручивания.

Под руководством главного исследователя Л. Махадевана, основного преподавателя Института биологической инженерии Висса в Гарварде, профессора прикладной математики Гарвардской школы инженерии и прикладных наук (SEAS) и профессора организма и эволюционной биологии и профессора физики в Гарварде, исследователей двигало простое любопытство к миру природы.

«Природа решила все виды энергетических и механических проблем, делая это очень медленно и действительно получая все правильно», — говорит ведущий автор Шэрон Гербоде, бывший научный сотрудник SEAS, которая теперь перешла на должность преподавателя на физическом факультете в Харви. Мадд Колледж.«Но мало кто изучает биологические механизмы с точки зрения физика или инженера. Нам едва ли пришлось коснуться поверхности этого вопроса об огурце — как он скручивается? Что может быть более простым вопросом? И что мы на самом деле был найден этот новый вид пружины, который еще никто не характеризовал ».

Хорошо известные ботаникам и садоводам извивающиеся усики вьющихся растений, таких как огурцы, душистый горошек и виноградные лозы, позволяют растениям подниматься к солнечному свету и прочно прикрепляться к существующим конструкциям, таким как деревья или решетки.Однако биологический и физический механизм этого свертывания на уровне клеток и тканей растения оставался загадкой.

Усик огурца начинается с прямого стебля, который удлиняется, пока не найдет что-то, за что можно зацепиться. Затем, закрепленный на обоих концах, он образует левую спираль и правую спираль, соединенные в центре «извращением» — поразительно викторианским термином Чарльза Дарвина, обозначающего точку, в которой спираль меняет направление.

«Легко создать одну из этих пружин без перекручивания с помощью телефонного кабеля, — говорит Гербоде, — и они раздражают».Но с телефонным шнуром вы можете потянуть за оба конца, и он распрямится в плоскую ленту. Что странно в усике огурца, так это то, что если потянуть за его концы, он на самом деле перекручивается, добавляя больше витков к обеим спиралям ». Чтобы изучить механизм такого поведения, Гербоде и ее коллеги из Гарварда внимательно изучили клетки и типы тканей. внутри усика.

Одревесневшие клетки в волокнистой ленте усика светятся ярко-синим цветом в ультрафиолетовом свете. Утолщенные стенки клеток хорошо видны на двух нижних изображениях.(Фотографии любезно предоставлены Джошуа Пьюзи и Шэрон Гербоде.)

Волокнистая лента, сделанная из нитевидных клеток, называемых клетками желатинового волокна (g-волокно), проходит по длине каждого усика. Эта лента толщиной в два клеточных слоя, кажется, обеспечивает силу, необходимую для того, чтобы усик образовывал спираль без помощи мускулов. Исследователи подумали, что если клетки на одной стороне такой ленты сожмутся, это заставит ленту изогнуться и свернуться.

Гербоде и ее соавтор Джошуа Пузи (Ph.D. ’12), который в то время изучал организменную и эволюционную биологию в Высшей школе искусств и наук (GSAS), попытался воссоздать эту волоконную ленту с помощью силиконовой модели. Они растянули лист эластичного силикона, закрепили концы, а затем нанесли тонкий слой силиконового герметика по его поверхности. Когда герметик затвердел, они отрезали от модели тонкую полоску, держали оба конца и наблюдали, как она скручивается в пару идеальных спиралей. Однако, когда они потянули за оба конца, он просто распустился и лежал ровно, не добавляя дополнительных катушек, как они надеялись.

«Это когда я потратил много времени на то, чтобы тянуть телефонные шнуры», — признается Гербоде. Как выяснилось, разгадка была внутри клеток g-волокна. Эти клетки были тщательно изучены на деревьях; они обладают способностью сжиматься или удлиняться благодаря особой архитектуре клеточной стенки.

«Мы думаем, что может происходить то, что внутренний клеточный слой усика содержит больше лигнина, который представляет собой своего рода клей, который придает жесткость клеточным стенкам и удерживает вместе микрофибриллы целлюлозы, которые похожи на арматуру в клетках», объясняет Пузи.«Мы думали, что эта жесткость каким-то образом связана со скручиванием».

Чтобы проверить эту идею, Гербоде и Пьюзи приклеили тканевую ленту к одной стороне своей силиконовой модели и медный провод к другой стороне. Наконец, силиконовая полоска образовала пару спиралей, которые перекручивались, как усик огурца.

Структура, на которую они наткнулись, представляет собой пружину, состоящую из двух соединенных противоположных спиралей, чья жесткость на изгиб выше, чем их жесткость на скручивание. Другими словами, чтобы сформировать эту конкретную структуру, задействованные материалы должны облегчить скручивание ленты в осевом направлении, чем изменение ее кривизны.С помощью математических моделей, разработанных Махадеваном и соавтором Эндрю Маккормиком (аспирантом по физике в GSAS), команда смогла полностью понять параметры и синтезировать простой принцип конструкции этих пружин.

Заключительным этапом исследования было рассмотрение биологических последствий. Группа Махадевана, извлекая волокнистую ленту из усика огурца, уже заметила, что влага играет роль в поведении весны. По мере высыхания извлеченной ленты ее жесткость увеличивалась, и она скручивалась более плотно.Также известно, что лигнин является гидрофобным, отталкивающим воду. Более того, команда Махадевана измерила механическую реакцию молодых и старых усиков, обнаружив, что более старые усики оказывают гораздо большее сопротивление натяжению, и этот факт они объяснили, используя комбинацию теории и компьютерного моделирования.

Хотя группа еще не исследовала эти открытия с эволюционной точки зрения, они выдвинули гипотезу, что структура зрелой спирали обеспечивает вьющимся растениям только нужную степень структурной гибкости.

«Вы хотите, чтобы растение создавало хорошее, прочное и безопасное соединение, но вы также не хотите, чтобы оно было слишком жестким или разрывалось», — объясняет Гербоде. «Вы хотите, чтобы он имел немного гибкости, чтобы он не сломался, если ветер дует или животное проскользнет мимо него. Так что одна возможность состоит в том, что такое перекручивание позволяет растению легко приспосабливаться к небольшим движениям, но затем, если что-то действительно серьезно случается, он может стать очень жестким и защитить себя «.

Для дальнейшего изучения эволюционного значения морфологии усиков исследователи должны были бы изучить спирали у многих видов и попытаться восстановить эволюционную историю этой характеристики.Махадеван предполагает, что такой проект может дать важные экологические открытия.

«Преимущество использования усиков заключается в том, что завод экономит сложное оборудование для создания конструктивных опор, таких как стволы и ветви», — говорит Махадеван. «Недостатком является то, что создание этих опор должно зависеть от других видов. Таким образом, усики представляют собой адаптацию, которая, вероятно, будет развиваться только в регионах, изобилующих растительностью, которая может обеспечить поддержку, и где конкуренция за ресурсы интенсивна.

«Настоящий вопрос остается в следующем: насколько сложно разработать такие решения, похожие на усики?»

Пришло ли время избавляться от акций AT&T после того, как они разошлись, это только компонент роста?

Акции телекоммуникационного и медиа-гиганта AT&T, Inc. (NYSE: T) постоянно уступают по показателям эталонных индексов и сопоставимых компаний из-за его привычки к приобретениям и генерации долгов. Сделав шаг, который ошеломил и разочаровал рынки, Компания решила передать свое подразделение WarnerMedia в объединенное предприятие с Discovery Networks (NASDAQ: DISCA).Хотя рынок первоначально приветствовал этот шаг, он наказал акции, когда обнаружил, что, хотя часть его огромной долговой нагрузки будет переложена на новую структуру, Компания также сократит свои дивиденды. Эта наживка и подмена заставили инвесторов отказаться от акций, когда возникло дежавю. Руководство зашло слишком далеко, помешало любому прогрессу, а затем отступило. Взгляд на его предыдущие приобретения свидетельствует об отстающей природе менеджмента, резюмированной в четырех словах… опоздание на вечеринку! Компания, вероятно, переплатила во время аукционов за использование спектра 5G, и ей по-прежнему необходимо привлечь дополнительные средства для удовлетворения потенциального спроса на 5G.Вместо того, чтобы интегрировать и реализовывать синергетический эффект, они предпочли бы создать отдельную компанию, чтобы повысить ее рейтинг долга, чтобы … привлечь больше долга. Для этой управленческой команды характерны годы разрушения стоимости за превышение «синергетических» сценариев, переплата за приобретения (48,5 млрд долларов Direct TV и 85 млрд долларов Time Warner), взятие долга, а затем откат, чтобы перейти к следующему шагу. AT&T больше не является дивидендным аристократом, а стала поучительной историей о постоянном «опоздании на вечеринку», переоценке / чрезмерных обещаниях, отступлении и явном отсутствии подотчетности, которое продолжает разворачиваться за счет акционерной стоимости.Осмотрительные инвесторы могут ждать серьезных оппортунистических откатов, в то время как нынешние акционеры могут использовать отскоки для уменьшения рисков, поскольку этот корабль без руля продолжает быть поучительным рассказом о том, как подорвать акционерную стоимость.

Автор Depositphotos.com / Depositphotos.com через MarketBeat

Что такое Discovery Deal?

AT&T выделит свое подразделение Warnermedia в отдельную компанию с Discovery, которой будет принадлежать 71% новой компании, а Discovery — 29% компании.Через Reverse Morris Trust AT&T получит 43 миллиарда долларов в виде денежных средств, долговых ценных бумаг и удержания WarnerMedia определенного долга. Закрытие ожидается к середине 2022 года, поскольку акционеры AT&T получат акции, представляющие 71% новой компании, а акционеры Discovery — 29%. AT&T планирует к тому времени «сбросить» дивиденды и получить достаточно свободного денежного потока для финансирования инвестиций в 5G и оптоволокно, которые она считает драйвером роста. Кто на самом деле платит AT&T 43 миллиарда долларов? На самом деле, никто из AT&T не избавляется от Time Warner, который она приобрела за 85 миллиардов долларов с 50% скидкой.Возможно, им удастся провести IPO акций, чтобы передать их общественности, что не похоже на разделение новой компании 71/29. Скорее всего, это будет в основном доля, которая будет использоваться в качестве актива для… (барабанная дробь)… большего долга. Единственный способ увидеть деньги — это передать акции другому покупателю, будь то публичное размещение через IPO или частный капитал, удачи в этом!

Новый способ запутать потребителей

Несмотря на то, что Discovery рекламирует такую ​​большую библиотеку для просмотра, как Netflix (NASDAQ: NFLX), реальность такова, что контент написан по сценариям, а несценарийный контент, похожий на таблоид, обернутый вокруг кучи готовых материалов. себя (Food Network) шоу и документальные фильмы, которые нравятся совершенно другой аудитории, чем HBO Max.Discovery не выпускает боевиков-блокбастеров, они выпускают такие шоу, как «90-дневный жених» и «Настоящие домохозяйки», где бы то ни было, что не привлекает любителей театра, с нетерпением ожидающих выхода следующего выпуска театра «Бэтмен». Нет никакой синергии между кросс-маркетингом, поскольку это совершенно разные аудитории. Мысль о том, что генеральный директор Discovery каким-то образом заново изобретет вселенную DC Entertainment так же успешно, как Кевин Файги из Marvel, является несбыточной мечтой. Имейте в виду, что архитектор MCU планирует на шесть лет вперед с полной сюжетной линией и непрерывностью персонажей для развертываний.Одна вещь звучит правдоподобно во время потоковых войн: контент — король. AT&T только что выкупила одну из самых ценных в мире интеллектуальной собственности (ИС). Это вселенная DC, состоящая из супергероев, которым поколения стали поклоняться и следовать за которыми, как Супермен, Бэтмен и Чудо-женщина. Тем не менее, AT&T просто наплевать … они предпочли бы переплатить за дополнительный спектр 5G и наращивать его, не имея возможности получить отдачу в течение как минимум десяти лет. Будущее DCEU вызывает сомнения, поскольку ходят слухи о возможности продажи собственности Marvel Studios (NYSE: DIS), что было бы неплохо для акций Disney.Печально то, что рынки, наконец, установили цены на ценные ИС, поскольку акции снова начали вырываться, прежде чем руководство объявило об этом невероятном акте некомпетентности, когда Джим Крамер из Mad Money (по праву) поставил генерального директора AT&T Джона Станки и бывшего генерального директора Рэндала Стивенсона на стену. стыда.

T Траектории цен на покупку и продажу

Использование графиков винтовок в месячных и недельных временных рамках позволяет получить более широкий обзор игрового поля для приклада T.Месячный график «винтовки» пытался прорваться после года консолидации с восходящей 5-периодной скользящей средней чуть выше $ 29,48 уровня Фибоначчи (Фибоначчи) . Максимум недельной структуры рынка (MSH) сработал при пробое ниже $ 33,01. Месячный минимум рыночной структуры (MSL) сработал выше 29 долларов. Недельное пересечение стохастика вниз создает медвежьи колебания в сторону недельных более низких полос Боллинджера на уровне 26,86 доллара. Если месячный стохастик снова пересекает вниз, то более низкие месячные BB находятся на уровне 21 доллара.68 фиб. Осмотрительные инвесторы могут подумать о сокращении риска при выходе из строя в рамках триггера MSL в размере 29 долларов США. Осмотрительным инвесторам, ищущим вход в длинную позицию, следует дождаться откатов к недельным и месячным более низким BB.

Рекомендуемая статья: Анализ денежных потоков при выборе запасов

Размотка от Sharecare в App Store

Жизнь непредсказуема и иногда может казаться совершенно подавляющей. Разве не было бы хорошо, если бы жизнь пришла с инструкциями? Раскрутка с помощью Sharecare — это, по сути, всего лишь «Быстрый старт» для вашего ума.Проводя всего несколько минут в день, Unwinding помогает справляться с повседневными стрессовыми факторами и формировать здоровые привычки.

Используя научно обоснованные методы и инструменты, вы можете быть спокойнее, осознаннее, активнее в своем теле и разуме и, что наиболее важно, больше сосредоточиться на вещах, которые сейчас наиболее важны для вас. Unwinding — это мощное цифровое терапевтическое средство для психического здоровья, которое помогает вам оставаться на связи и дает вам необходимую поддержку с помощью инструментов, которые вам нужны, когда возникают моменты стресса — прямо тогда, когда вам нужно перевести дыхание и вернуть свое любопытство.

Получите неограниченный доступ к эксклюзивным, основанным на фактах мини-курсам по таким темам, как беспокойство, финансовый стресс, прокрастинация и питание, чтобы помочь вам понять, как работает ваш мозг — и как его переобучать — чтобы меньше нервничать, становиться психически сильнее и т. Д. возможность наслаждаться жизнью. Вы узнаете, как стресс и тревога влияют на многие наши вредные привычки и нежелательное поведение, включая переедание, прокрастинацию, самокритику и многое другое.

Каждый мини-курс сочетается с конкретными техниками повышения осведомленности и изменения поведения, которые работают, чтобы переобучить ваш мозг, уменьшить или устранить бесполезные привычки и научить вас, как улучшить общее психическое благополучие, независимо от того, что вам бросает в жизнь.

Приложение Unwinding by Sharecare было создано группой поведенческого здоровья в Sharecare в партнерстве с доктором Джудом Брюэром (доктор медицинских наук) и основано на его работе в области беспокойства, зависимости и изменения привычек. Понимая, как наш мозг реагирует на стресс на самых глубоких уровнях, Unwinding может помочь вам внести в свою жизнь долговременные и необратимые изменения, уменьшив страдания людей в сегодняшнем разрушенном мире.

Стоимость и условия подписки:
Unwinding by Sharecare предлагает автоматически продлеваемую годовую подписку за 59 долларов.99 в год, что дает вам неограниченный доступ ко всем функциям в приложении, пока вы сохраняете активную подписку.

Оплата будет снята с кредитной карты, связанной с вашей учетной записью iTunes, когда вы подтвердите первоначальную покупку подписки. Подписки автоматически продлеваются, если автоматическое продление не отключено по крайней мере за 24 часа до окончания текущего периода подписки. С вашей учетной записи будет взиматься плата за продление в течение 24 часов до окончания текущего периода, и будет указана стоимость продления.Вы можете управлять своей подпиской, а автоматическое продление можно отключить, перейдя в настройки своей учетной записи после покупки. Любая неиспользованная часть бесплатного пробного периода, если таковая предлагается, будет аннулирована при покупке подписки, если это применимо.

Нужна помощь с приложением? Пожалуйста, напишите по адресу [email protected] или перейдите по ссылке https://claritasmindsciences.zendesk.com/hc/

УСЛОВИЯ ОБСЛУЖИВАНИЯ и ПОЛИТИКА КОНФИДЕНЦИАЛЬНОСТИ: https://drjud.com/terms-conditions-privacy/

Для научных справок : https: // ученый.google.com/citations?hl=en&user=GjmDbisAAAAJ&view_op=list_works&sortby=pubdate

.