Trms: Чем отличается TRMS от RMS? (Страница 1) — Спрашивайте

Коммуна nity »Школы

Бизнес »Управление

иммунизировали и заражали аллергеном для индукции острого EAA с последующим выздоровлением и рецидивом и сравнивали со здоровыми мышами и сенсибилизированными, не подвергшимися воздействию мышами (дополнительная фигура 1A). Одна группа мышей была проанализирована на предмет воспаления дыхательных путей и легких, выработки слизи и сывороточных антител, а отдельные фазы заболевания охарактеризованы на дополнительных рисунках 1B – E.Для сенсибилизации мышей они получали две внутрибрюшинные (i.p.) инъекции 10 мкг OVA (степень V, Sigma-Aldrich, MI), растворенного в 200 мкл фосфатно-солевого буфера Дульбекко (PBS) в дни 0 и 21 (сенсибилизация ). Чтобы инициировать заболевание, мы подвергали сенсибилизированных мышей распылению OVA в PBS (1%) с помощью ультразвукового распылителя (Aerodyne, Kendall, Neustadt, Германия) в течение 60 минут два раза в день на 28 и 29 дни ( инициирование ). Инициирование заболевания анализировали для популяций клеток через 3, 7, 14 и 35 дней после последнего аэрозольного заражения, или мышам давали возможность восстановиться в течение минимум 100 дней ( выздоровления, ≥ дней 100–636). Рецидив был индуцирован у выздоровевших мышей однократным интраназальным введением (in) OVA (100 мкг) в 50 мкл PBS под легкой анестезией, а затем мышей анализировали на популяцию клеток на 3, 7, 14 и 35 дни. были случайным образом выбраны в разное время от начала заболевания (см. подписи к рисункам) для сбора образцов и / или повторного исследования.

Сенсибилизированным и выздоровевшим мышам мы вводили очищенное LEAF ™ mAb GK1 против CD4 мыши.5 или очищенное LEAF ™ крысиное IgG2b, контрольное антитело изотипа κ (0,2 мг, BioLegend, Сан-Диего, Калифорния) i.p. три дня подряд. Спустя семьдесят два часа мы ввели внутривенно (внутривенно) внутривенно (внутривенно) мы вводили меченные АРС mAb против CD4 (2,5 мкг; клон RM4-4). Через 10-15 минут легкие и селезенку были резецированы и легкие перфузировали через легочную артерию 15 мл PBS, содержащего 2% фетальной бычьей сыворотки (FBS; Invitrogen, Carlsbad, CA), до тех пор, пока они не стали белыми. Затем легкие разрезали на мелкие кусочки и обрабатывали 150 ед. Коллагеназы I (Invitrogen) и 50 ед. ДНКазы I (Sigma-Aldrich) в RPMI (Invitrogen), содержащей 5% FBS, в течение 45 минут при 37 ° C.Полученную суспензию отдельных клеток гомогенизировали с использованием стеклянного гомогенизатора на 15 мл (Kimble Chase, Vineland, NJ) и центрифугировали при 200 × g. Спленоциты выделяли из измельченных селезенок и суспендировали в PBS с 2% FBS. Суспензии клеток обрабатывали лизирующим раствором FACS (BD Bioscience, Сан-Хосе, Калифорния) для удаления эритроцитов и промывали PBS с 2% FBS перед окрашиванием FACS или использованием в клеточных анализах.

Клетки легких и селезенки инкубировали в RPMI с 5% FBS при 37 ° C в течение ночи.Затем мы добавили вызванные тиогликолатом перитонеальные макрофаги, меченные красителем для пролиферации клеток eFluor450 (eBioscience, Сан-Диего, Калифорния) и пульсировали OVA или бычьим сывороточным альбумином (BSA, 20 мкг / мл; Sigma) в течение ночи. Через три часа мы добавили коктейль ингибиторов транспорта белка (eBioscience) и инкубировали еще 6 часов. В качестве положительного контроля клетки стимулировали коктейлем для стимуляции клеток eBioscience плюс ингибиторы транспорта белка в течение 6 часов, прежде чем их собирали для окрашивания FACS.

Выделенных мышей BALB / c обрабатывали 250 мкл (0,5 мг / кг) FTY720 (Fingolimod, Calbiochem, San Diego, CA) i.p. растворяли только в дистиллированной воде или носителе ежедневно в течение 3 дней подряд и оценивали через 1 день.

Флуоресцентно-меченные антитела для проточной цитометрии

Для FACS использовали следующие антитела: CD4, меченный PerCP (клон RM4-5), меченный APC CD4 (клон RM4-4), меченный Pacific Blue CD62L (клон MEL-14), меченный Alexa Fluor 700 CD44 ( clone IM7) и CD69, меченный Brilliant Violet 510 (клон h2.2F3) mAb от Biolegend. PE-меченный CD3 (клон 145-2C11; BD Biosciences), меченный FITC ST2 (клон DJ8) (MD Bioproducts Zürich, Швейцария). PE-меченный CCR7 (клон 17A2), APC-меченный IL-4 (клон 11B11), PE-меченный IL-5 (клон TRFK5), IFNγ, меченный eFlour 450 (клон XMG1.2), меченный e-Fluor 450 IL -13 (клон eBio13A) и APC-меченный IL-17 (клон eBio17B7) от eBioscience.

Проточная цитометрия

Суспензии единичных клеток из легких и селезенки блокировали 6 мкг нормальных антител IgG мыши и крысы (Invitrogen), а затем инкубировали с неконкурентным клоном RM4-5 mAb против CD4 и другими меченными флуорохромом антителами против внеклеточных маркеров при 4 ° C. на 30 мин.При необходимости использовали контроли флуоресценции минус один (FMO). После отмывки клетки окрашивали фиксируемым красителем жизнеспособности eFluor-780 (eBioscience). Сбор данных выполняли на анализаторе клеток BD LSRFortessa (BD Bioscience) с 7-цветным детектированием и собирали по меньшей мере 300 000 (легкие) или 50 000 (селезенка) событий. Анализ был выполнен с помощью FlowJo 9.6 (Tree Star Inc., Сан-Карлос, Калифорния). Стратегия стробирования для популяций CD4 ⁺ Т-клеток в воротах неавтофлуоресцентных живых клеток показана на дополнительном рисунке 3.После окрашивания внеклеточными маркерами и красителем жизнеспособности клетки фиксировали и повышали проницаемость с использованием набора буферов для внутриклеточной фиксации и пермеабилизации (eBioscience) в соответствии с протоколом, рекомендованным производителем. Затем клетки инкубировали в течение ночи при 4 ° C с последующей 45-минутной инкубацией с антицитокиновыми антителами при комнатной температуре. Затем клетки промывали буфером для пермеабилизации, а затем PBS с 2% FBS. Стратегия стробирования для популяций CD4 ⁺ Т-клеток в воротах неавтофлуоресцентных живых клеток показана на дополнительном рисунке 3.Общее количество клеток в популяции рассчитывали с использованием общего количества живых клеток, подсчитанных с помощью цитометра, и данных FACS, как описано ранее (24). Вкратце, процент каждой популяции клеток выражали как процент от общего числа живых клеток (всего клеток), а количество клеток в этой популяции рассчитывали по следующей формуле: количество клеток (популяция X) = Общее число x популяция X (% от общего числа клеток). всего ячеек) / 100%.

Иммунофлуоресцентная микроскопия

Мышам вводили APC-меченные mAb против CD4 (2.5 мкг, клон GK1.5, Biolegend) внутривенно. Легкие собирали через 10–15 мин, надували смесью ОКТ и PBS (1: 1) и помещали в ОКТ. Замороженные ткани разрезали на срезы 9 мкм при -20 ° C и хранили при -80 ° C до дальнейшего использования. Замороженные срезы регидратировали в PBS, а сайты неспецифического связывания блокировали 5% BSA в PBS в течение 30 мин. Для обнаружения защищенных Т-клеток CD4 ⁺ срезы окрашивали меченным Alexa Fluor 594 анти-CD4 (GK1.5, Biolegend) в течение ночи при 4 ° C. Затем срезы промывали PBS, окрашивали DAPI (Invitrogen) в течение 3 минут и наносили на среду для монтажа Fluoroshield (Abcam, Кембридж, Великобритания).Изображения получали в течение 3 дней с помощью автоматического микроскопа Leica DM6000B (Wetzlar, Германия), камеры Baumer TXG50c (Friedberg, Германия), объективов Leica HC Plan APO 20x / 0,7 + HC PL FLUOTAR 5x 0,15. Микрофотографии анализировали с помощью программного обеспечения TissueFAXS © (TissueGnostics, Вена, Австрия) и ImageJ (NIH, Bethesda, MD).

Воспаление дыхательных путей

BAL выполняли в указанные сроки после последнего заражения OVA у анестезированных мышей путем интубации и 3-кратной промывки дыхательных путей PBS до общего объема 1 мл.Общее количество клеток в БАЛ подсчитывали на гемоцитометре Нойбауэра, а дифференциальный подсчет клеток производили путем морфологического исследования> 300 клеток на цитоспиновых слайдах, окрашенных Kwik-Diff (Thermo Fisher Scientific Inc., Питтсбург, Пенсильвания). Количество эозинофилов, лимфоцитов, нейтрофилов и макрофагов рассчитывали путем умножения общего количества клеток ЖБАЛ на процентное содержание клеток.

Воспаление легких и секреция слизи

После БАЛ легкие фиксировали в 4% забуференном формалине и заливали парафином.Срезы легких (3 мкм), содержащие главные стволовые бронхи, окрашивали гематоксилином и эозином (H&E) и оценивали с использованием 2 баллов по интенсивности воспаления и степени воспаления в легком. По интенсивности: 0 — воспалительные инфильтраты отсутствуют; 1 — случайные клетки или манжеты клеток вокруг бронхов / сосудов; 2 – тонкий слой воспалительных клеток (1-2 клетки) вокруг бронхов / сосудов; и 3-толстый слой воспалительных клеток (> 2 клеток) вокруг бронхиол / сосудов. По степени воспаления: 0 — воспалительные инфильтраты отсутствуют; 1 — воспалительные инфильтраты в центральных дыхательных путях; 2 — воспалительные инфильтраты, распространяющиеся до средней трети паренхимы легкого; и 3 — воспалительные инфильтраты, распространяющиеся на периферию легких.Гистологический балл рассчитывали для каждой доли легкого как произведение интенсивности и степени воспаления и усредняли для каждого образца. Соседние срезы легких окрашивали на эозинофилы с помощью красителя Luna. Эозинофилы подсчитывали на 10 случайных полях (40-кратное увеличение), содержащих альвеолы ​​и без основных дыхательных путей / сосудов (выбранных при малом увеличении), и усредняли для каждого легкого. Срезы легких окрашивали периодической кислотой Шиффа (PAS) и подсчитывали количество клеток, содержащих слизь / мм базальной мембраны, и усредняли для каждой мыши.Все анализы проводились на микроскопе BX40 с использованием объективов 10x, 20x, 40x и 100x (Olympus Europa Holding GmbH, Гамбург, Германия) с камерой Progress Speed ​​XT ^Core 5 с использованием программного обеспечения ProgRes ^® CapturePro 2.9.0.1 (оба Jenoptik, Йена, Германия).

Статистический анализ

Все данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего и были проанализированы с использованием GraphPad Prism v.5.0 (GraphPad Software Inc., Сан-Диего, Калифорния) с тестами Student t , ANOVA для определения количества эозинофилов в дыхательных путях и легких. срезов и количества продуцирующих слизь клеток в центральных дыхательных путях: однофакторный дисперсионный анализ с последующим тестом множественного сравнения Тьюки и для оценки воспаления: критерий хи-квадрат.Значения p <0,05 считались значимыми.

Результаты

CD3

EAA индуцировали у мышей i.p. Введение OVA (сенсибилизация) с последующей аэрозольной провокацией, ведущей к началу острого заболевания (начало). Затем мышей оставляли выздоравливать в отсутствие аллергена на 100–636 дней (выздоровление), а затем повторно вводили тот же аллерген, что привело к сильному обострению заболевания (рецидиву) (дополнительный рисунок 1A).За ходом EAA следили, оценивая воспалительную реакцию в легких и аллерген-специфические антитела в сыворотке крови. Инициирование и рецидив заболевания характеризовались эозинофильным воспалением легких, гиперсекрецией слизи, сывороточными OVA-специфическими IgG1 и IgE, тогда как во время выздоровления эозинофилия, слизь и IgE отсутствовали (дополнительные рисунки 1B – E).

Чтобы проследить за популяциями CD4 ⁺ Т-лимфоцитов на протяжении болезни, начиная с здоровых (наивных) мышей, мы использовали метод маркировки антител in vivo — in vitro для количественного определения CD3 ⁺ CD4 ⁺ Th-клеток в легком и сравнил их с селезенкой.Чтобы специфически отличить in vivo CD4-меченых от немеченых CD4 ⁺ Т-клеток, мы вводили мышам внутривенно. с mAb против CD4 (клон RM4-4), удалили клетки через 10 мин и окрашивали их in vitro другим mAb против CD4 (клон RM4-5). Используя этот метод, стало возможным различать «меченые или циркулирующие» и «защищенные» клетки (немеченые / неокрашенные с помощью в / в анти-CD4 mAb) из-за предпочтительного мечения клеток, находящихся в кровотоке, по сравнению с клетками, которые оседают в ткани (дополнительная информация Рисунки 3, 4А).Чтобы охарактеризовать CD3 ⁺ CD4 ⁺ Т-клетки в течение аллергической астмы, мы оценили легкие и селезенку (1) здоровых мышей, (2) сенсибилизированных, неинфицированных мышей, (3) во время инициации на 3, 7 дни, 14 и 35 после последнего заражения аэрозолем, (4) во время выздоровления и (5) при рецидиве на 3, 7, 14 и 35 дни после последнего заражения с использованием проточной цитометрии (дополнительный рисунок 2).

В легких здоровых мышей мы выделили меченые и защищенные CD3 ⁺ CD4 ⁺ Т-клетки с исходными числами на уровне 2.42 ± 0,11 × 10 ⁶ и 0,12 ± 0,01 × 10 ⁶ соответственно. У сенсибилизированных мышей было аналогичное количество меченых клеток (2 ± 0,22 × 10 ⁶ ), но было в 3 раза больше защищенных клеток (0,36 ± 0,15 × 10 ⁶ ), что свидетельствует о том, что защищенные CD3 ⁺ CD4 ⁺ Т-лимфоциты образуются в легких сразу после ip. аллерген без заражения дыхательными путями (25). Меченые клетки оставались постоянными на каждой фазе заболевания в диапазоне 2,0 × 10 ⁶ –4.30 × 10 ⁶ . Напротив, количество защищенных клеток значительно варьировалось в течение болезни. У мышей, зараженных аэрозольным OVA, количество защищенных клеток увеличивалось и достигало пика на D7 (2,10 ± 0,31 × 10 ⁶ клеток) и медленно снижалось до D35 (0,45 ± 0,10 × 10 ⁶ клеток), хотя они оставались значительно повышенными по сравнению со здоровыми. мышей. Во время восстановления защищенные CD3 ⁺ CD4 ⁺ Т-клетки (0,37 ± 0,05 × 10 ⁶ клеток) были стабильны в течение более 100 дней, но после повторного введения вторичного аэрозольного OVA числа увеличились и снова достигли пика на D7 (3.641 ± 0,47 × 10 ⁶ клеток) и уменьшилось на D35 после рецидива (2,145 ± 0,25 × 10 ⁶ клеток), но было примерно в 4 раза выше, чем D35 после инициации. Эти данные показывают, что защищенные CD3 ⁺ CD4 ⁺ Т-клетки увеличивались и сокращались в ходе EAA (рис. 1A).

Рисунок 1 . Легкие CD3 ⁺ CD4 ⁺ Т-клетки защищены от in vivo мечения антителами во время аллергической астмы у мышей. (A) Здоровые мыши и мыши, перенесшие аллергическую астму, были in vivo, мечены анти-CD4 mAb (клон RM4-4), и органы были извлечены через 10-15 минут. Суспензии клеток легких и селезенки получали и окрашивали неперекрывающимся mAb против CD4 (клон RM4-5) и антителами к другим внеклеточным маркерам для анализа проточной цитометрии. Общее количество защищенных и меченых CD3 ⁺ CD4 ⁺ Т-клеток в легких и селезенке показано во время инициации, после 185 дней восстановления (диапазон от 142 до 234 дней) и во время рецидива. (B) Количество защищенных и меченых эффекторных / клеток памяти и наивных Th-клеток в легких и селезенке здоровых животных и мышей на различных стадиях аллергической астмы. (C) Количество защищенных и меченых CD3 ⁺ CD4 ⁺ CD44 ^hi CD62L ^— Т-лимфоцитов с различной экспрессией ST2 и CD69 в селезенке и легких здоровых людей контрольной группы, во время начала астмы, через 185 дней после начала лечения. выздоровление (диапазон от D142–234) и рецидив. Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего для 8–16 мышей / момент времени и были собраны из 6 независимых экспериментов.

В селезенке общее количество CD3 ⁺ CD4 ⁺ Т-клеток было выше, чем в легких, и они были более защищенными по сравнению с мечеными клетками. И меченые, и защищенные клетки находились под влиянием фазы заболевания и имели иную кинетическую картину по сравнению с легкими. Произошло уменьшение количества клеток до D3 с последующим увеличением, достигающим пика на D7 как во время инициации, так и во время рецидива (рис. 1A). Примечательно, что на D3 во время инициации и рецидива заболевания вдыхаемый аллерген увеличивал количество CD4 ⁺ Т-клеток в легких, одновременно уменьшая количество CD4 ⁺ Т-клеток в селезенке.Эти данные показывают, что вдыхаемый аллерген влиял на количество и поведение местных и системных CD4 ⁺ Т-клеток.

CD4 с защищенной памятью

Мы сначала охарактеризовали наивный фенотип и фенотип памяти меченых и защищенных CD4 ⁺ Т-клеток, проследив экспрессию маркеров CD44 и CD62L на этих клетках в легких и селезенке на протяжении всего периода болезни. На рисунке 1B показаны числа и процентное соотношение (дополнительные рисунки 4B, C) меченых и защищенных наивных (CD4 ⁺ CD44 ^lo CD62L ⁺ ) и памяти / эффектора (CD4 ⁺ CD44 ^hi CD62L ^— ) клетки.Меченые клетки были преимущественно наивными в легком и селезенке, в то время как защищенные клетки были клетками памяти / эффекторными клетками в легких и наивными клетками в селезенке.

Во-вторых, мы исследовали кинетику защищенных и меченых CD3 ⁺ CD4 ⁺ CD44 ^hi CD62L ^— Т памяти / эффекторных клеток, экспрессирующих CD69 (10, 11, 15, 26–28) и ST2 (24) , которые являются маркерами для T _RMs и Th3 клеток, соответственно (рис. 1C). Основное изменение кинетики ответа происходит в защищенных клетках легких, что отражает расширение и сокращение CD3 ⁺ CD4 ⁺ CD44 ^hi CD62L ^— Популяция Т-клеток памяти / эффекторных клеток, показанная на рисунке 1B. независимо от экспрессии CD69 и ST2.Субпопуляции CD69 ⁺ ST2 ⁺ , CD69 ^— ST2 ^— и CD69 ⁺ ST2 ^— субпопуляции хорошо представлены по сравнению с популяцией CD69 ^— ST2 ⁺ Т-клеток. Примечательно, что в популяции меченых клеток памяти / эффекторных клеток легких имеется больше клеток CD69 ^— ST2 ^— по сравнению с другими субпопуляциями с аналогичной, но менее драматической кинетикой. Наиболее заметная защищенная и маркированная субпопуляция памяти / эффектора селезенки не имела экспрессии CD69 и ST2 и варьировала в зависимости от фазы заболевания, тогда как все другие субпопуляции оставались неизменными.

Затем мы сосредоточились на клетках легких и селезенки выздоровевших и здоровых мышей, чтобы дополнительно охарактеризовать субпопуляции Т-клеток памяти. Во время восстановления CD44 ^hi CD62L ^— Т-клетки являются клетками памяти, но не эффекторными клетками. Таким образом, определение экспрессии маркеров клеток CD69 и ST2 будет определять клетки Т _RM Th3 в защищенных и меченных CD3 ⁺ CD4 ⁺ CD44 ^hi CD62L ^— популяциях Т-клеток. Мы наблюдали две многочисленные защищенные популяции клеток: CD69 ⁺ ST2 ⁺ и CD69 ^— ST2 ⁺ Т-клеток памяти в восстановленных по сравнению со здоровыми легкими (Рисунок 2A и дополнительный рисунок 5).Напротив, меченые Т-клетки легких были преимущественно CD69 ^— ST2 ^— Т-клетками памяти со значительным, но небольшим увеличением количества CD69 ^— ST2 ⁺ клеток памяти в восстановленных по сравнению со здоровыми легкими. В селезенке не было обнаружено значительных различий между здоровыми и выздоровевшими мышами в отношении защищенных клеток, окрашенных CD69 и ST2, тогда как меченые клетки селезенки были подобны меченым клеткам легких. Примечательно, что экспрессия CD103, другого принятого маркера для T _RM , была отрицательной на резидентных клетках легких (данные не показаны).Взятые вместе, эти данные демонстрируют, что защищенные CD3 ⁺ CD4 ⁺ CD44 ^hi CD62L ^— CD69 ^{— / +} ST2 ⁺ Т-клетки в легких фенотипически представляют собой Т _RM .

Рисунок 2 . Защищенные аллерген-специфические легкие CD3 ⁺ CD4 ⁺ Т-клетки экспрессируют CD69 и ST2. (A) Абсолютное количество защищенных и меченых CD3 ⁺ CD4 ⁺ CD44 ^hi CD62L ^— Т-клеток, различающихся экспрессией CD69 и ST2 в легких и селезенках мышей в среднем через 199 дней (диапазон от D164-244) выздоравливающих и здоровых людей соответствующего возраста контрольной группы.Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего для 12 мышей / момент времени и были собраны из трех независимых экспериментов. * p <0,05 с использованием двустороннего дисперсионного анализа. (B) Типичные точечные графики, показывающие, что аллерген-специфические клетки Th3 присутствуют в легких и селезенках выздоровевших мышей. На D227 клетки легких и селезенки от здоровых и выздоровевших мышей ( n = 3) выделяли, объединяли и стимулировали в течение 9 часов перитонеальными макрофагами, нагруженными OVA. Точечные диаграммы показывают сравнение CD44 с внутриклеточным IL-4, IL-5 или IL-13 на закрытых клетках CD3 ⁺ CD4 ⁺ .Цифры указывают процент клеток в соответствующих воротах, продуцирующих цитокины. Данные представляют из трех независимых экспериментов. (C) Гистограммы показывают экспрессию ST2 на общем CD3 ⁺ CD4 ⁺ CD44 ^hi Т-клетки (серые) и CD3, продуцирующие IL-4, IL-5 или IL-13 ⁺ CD4 ⁺ CD44 ^hi Т-клетки (красные) в легких и селезенках выздоровевших мышей ( n = 3 ) на D227. Данные представляют из трех независимых экспериментов. (D) Клетки легких и селезенки от восстановленных мышей ( n = 3 ) на D227 были изолированы через 10-15 минут после внутривенного введения. введение mAb против CD4, объединенные и стимулированные в течение 9 часов перитонеальными макрофагами, нагруженными BSA или OVA. Точечные графики слева показывают сравнение ST2 с внутриклеточным IL-5 на закрытых клетках CD3 ⁺ CD4 ⁺ . Точечные диаграммы с правой стороны показывают, что большая часть IL-5, продуцирующих OVA-специфические CD3 ⁺ CD4 ⁺ ST2 ⁺ клеток в легких, но не в селезенке, защищены от in vivo мечения антител .Цифры указывают процент клеток в соответствующих воротах, продуцирующих цитокины. Данные представляют из трех независимых экспериментов.

Защищенные CD3

Чтобы определить, являются ли Т-клетки CD3 ⁺ CD4 ⁺ OVA-специфичными, мы стимулировали клетки легкого и селезенки in vitro с помощью OVA или неперекрестно-реактивного БСА. Мы обнаружили, что восстановленные по сравнению со здоровыми CD3 ⁺ CD4 ⁺ CD44 ^hi Т-клетки продуцировали цитокины Th3 в ответ на OVA, но не на BSA, и что ни одна популяция не продуцировала IFNγ или IL-17α (рисунок 2B и дополнительный рисунок). 6).Более того, большинство клеток, экспрессирующих ИЛ-5 и ИЛ-13, в легких совместно экспрессирует ST2 (рис. 2С). Примечательно, что эти восстановленные CD3 ⁺ CD4 ⁺ ST2 ⁺ Th3-клетки имели вторичный OVA-специфический ответ in vitro через 636 дней после начала заболевания (дополнительная фигура 7), демонстрируя, что клетки сохраняются после одного эпизода EAA на всю жизнь. На фигуре 2D показано, что 88% OVA-специфичных CD3 ⁺ CD4 ⁺ ST2 ⁺ Т-клетки IL-5 ⁺ у выздоровевших мышей защищены в легких по сравнению с 30% в селезенке.

Легкое T

Чтобы продемонстрировать, что защищенные Т-клетки легких находятся в легких и временно не проходят через паренхиму легких, мы лечили выздоровевших мышей в течение 3 дней разбавителем или FTY720, который блокирует эмиграцию лимфоцитов из лимфатических узлов (29, 30). Обработка FTY720 заметно уменьшила общую популяцию Th-клеток в легких, что было полностью связано с уменьшением циркуляции меченых клеток на 92% (Рисунок 3A и дополнительные рисунки 8A, C), со значительным сокращением 2 субпопуляций меченых CD3 ⁺ . CD4 ⁺ CD44 ^hi CD62L ^— CD69 ^— ST2 ^— и CD3 ⁺ CD4 ⁺ CD44 ^hi CD62L ^— CD69 ^— клеток + 95%, соответственно, но никаких изменений ни в одной из субпопуляций защищенных Th-клеток памяти (Рисунок 3B и дополнительный рисунок 8B).В селезенке эффект FTY720 был менее драматичным: снижение общего количества Th-клеток на 84% объяснялось значительным снижением меченых CD3 ⁺ CD4 ⁺ CD44 ^hi CD62L ^— CD69 ^— ST2 ^{— / +} Субпопуляции Т-клеток (Рисунок 3B и дополнительный Рисунок 8B). Подобно легким, защищенные клетки памяти Th селезенки оставались постоянными (рис. 3B). Кроме того, оставшиеся защищенные CD3 ⁺ CD4 ⁺ ST2 ⁺ Th-клетки были способны продуцировать OVA-специфический IL-5 in vitro (Фигуры 3C, D).Эти данные показывают, что функциональные, аллерген-специфически защищенные Т-клетки CD4 ⁺ после обработки FTY720 сохраняются, что указывает на то, что они являются резидентными OVA-специфическими клетками памяти Th3 / Th3-T _RM .

Рисунок 3 . Защищенные аллерген-специфические CD3 ⁺ CD4 ⁺ Т-клетки остаются в легких и селезенке после лечения FTY720. Мышей на D172 и D174, выздоравливающих после начала заболевания, лечили FTY720 (0,5 мг / кг) или разбавителем i.п. ежедневно в течение трех дней подряд. Через день мышей оценивали через 10-15 минут после в / в. инъекция mAb против CD4 для определения эффекта лечения на меченые и защищенные CD3 ⁺ CD4 ⁺ популяции Т-клеток в легких и селезенке. (A) Общее количество меченых и защищенных CD3 ⁺ CD4 ⁺ Т-клеток в легких и селезенках контрольных групп и групп, обработанных FTY720. Данные представлены в виде индивидуальных значений (точки) и групповых средних (линии), составленных из 2 независимых экспериментов ( n = 6 ).* p <0,05 с использованием теста Стьюдента t . (B) Количество защищенных и меченых CD3 ⁺ CD4 ⁺ CD44 ^hi CD62L ^— , экспрессирующие поверхностные маркеры CD69 и ST2 в селезенках и легких мышей, обработанных разбавителем и FTY720. Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего, полученные из двух независимых экспериментов ( n = 6 ). * p <0,05 с использованием двустороннего дисперсионного анализа. (C) Типичные точечные графики, показывающие, что аллерген-специфические клетки Th3 остаются в легких и селезенках выздоровевших мышей после обработки FTY720.Клетки легких и селезенки от трех мышей / группу выделяли, объединяли и стимулировали в течение 9 часов перитонеальными макрофагами, нагруженными OVA. Точечные диаграммы показывают сравнение ST2 с внутриклеточным IL-5 на закрытых клетках CD3 ⁺ CD4 ⁺ . Цифры указывают процент клеток в соответствующих воротах, продуцирующих цитокины. Данные представляют два независимых эксперимента. (D) Точечные графики показывают частоту меченых и защищенных продуцирующих IL-5 CD3 ⁺ CD4 ⁺ ST2 ⁺ Т-клеток при стимуляции перитонеальными макрофагами, нагруженными OVA.Данные представляют два независимых эксперимента.

T

Поскольку Т _RM в значительной степени устойчивы к истощению, вызванному mAb, лечение mAb против CD4 в основном истощает циркулирующие клетки (31–33). Чтобы определить роль Т _RM в индукции заболевания, мы лечили выздоровевших и сенсибилизированных мышей i.p. либо с mAb против CD4 (GK1.5), либо с крысиным IgG2b, контрольным антителом изотипа κ в течение 3 дней. Мы обнаружили, что анти-CD4 истощили большую часть CD3 ⁺ CD4 ⁺ Т-клеток в легких (96.5% сенсибилизированных и 81,75% восстановленных) и селезенки (99,5% сенсибилизированных и 99,75% восстановленных) (дополнительный рисунок 9A). Более того, все истощенные Т-клетки были CD4 ⁺ , меченные in vivo (дополнительная фигура 9B), и все IL-5 ⁺ , in vivo CD4 ⁺ -меченые Т-клетки были удалены из обоих органов (дополнительная фигура). 9С). Примечательно, что популяции Т-клеток IL-5 ⁺ в легких (4,65%) и в селезенке (<1%) выздоровевших мышей не были помечены in vivo mAb к CD4 и присутствовали в количестве <0.1% у сенсибилизированных мышей (дополнительная фигура 9C). Затем мы установили количество антиген-специфичных анти-CD4 mAb-резистентных (IL-5 ⁺ ST2 ⁺ ) Т-клеток и обнаружили, что у восстановленных мышей сенсибилизированных мышей больше, чем в 8,2 раза в селезенке и в 46 раз. в легком. Более того, обработка mAb против CD4 уменьшала количество как в легких, так и в селезенке выздоровевших и сенсибилизированных мышей, оставляя 70000 антиген-резистентных антигенспецифических анти-CD4 mAb (IL-5 ⁺ ST2 ⁺ ) Т-клеток в легких и 39000 в селезенках выздоровевших мышей и 1500 в легких и 4700 в селезенках сенсибилизированных мышей (рис. 4A).

Рисунок 4 . Аллергенспецифические клетки Th3 в легких, оставшиеся после истощения анти-CD4 mAb, опосредуют ранний воспалительный ответ на повторный вызов аллергена. Сенсибилизированным и выздоровевшим мышам вводили внутрибрюшинную терапию. с 0,2 мг анти-CD4-истощающего mAb (клон GK1.5; анти-CD4) или контрольного антитела изотипа (контрольный Ig) в течение 3 дней подряд. Через три дня после последней обработки суспензии отдельных клеток легкого и селезенки были приготовлены для анализа FACS для одной когорты мышей, а вторая когорта мышей была заражена 100 мкг OVA i.п. для индукции аллергической астмы у сенсибилизированных мышей (необработанных ^OVA , контрольных Ig ^OVA , анти-CD4 ^OVA ) или рецидива заболевания у выздоровевших мышей (нелеченых ^OVA , контрольных Ig ^OVA , анти-CD4 ). Параметры заболевания оценивали в D3 и D7 после провокации аллергеном. (A) Клетки легких и селезенки сенсибилизированных или восстановленных мышей ( n = 6–8 ), обработанных контрольным Ig или анти-CD4 mAb, стимулировали в течение 9 часов перитонеальными макрофагами, нагруженными OVA.Гистограммы показывают количество Т-клеток IL-5 ⁺ ST2 ⁺ , представленное как среднее значение ± стандартная ошибка среднего из двух независимых экспериментов. (B) Абсолютное количество эозинофилов в BAL степени воспаления в H и E-окрашенных срезах легких, количество эозинофилов на LUNA-окрашенных срезах легких и количество слизистых клеток в центральных дыхательных путях на PAS-окрашенных срезах легких во время инициации, при D3 и D7. Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего из двух независимых экспериментов ( n = 6–8 ).* p <0,05 статистически значимо по сравнению с группой, не получавшей лечения.

Важно отметить, что для определения того, опосредуют ли анти-CD4-mAb-устойчивые клетки рецидив заболевания, мы оценили параметры заболевания после лечения анти-CD4 mAb и повторного введения OVA. Сенсибилизированные и выздоровевшие мыши, получавшие контрольные mAb крысы и OVA, имели ожидаемое увеличение эозинофильных дыхательных путей и воспаления легких и гиперсекреции слизи по сравнению с сенсибилизированными и выздоровевшими мышами. Однако у сенсибилизированных мышей, получавших анти-CD4 и OVA (во время инициации), по сравнению с необработанными мышами было снижение эозинофилов в дыхательных путях на 88%, 40.Снижение количества слизи, производимой бокаловидными клетками, на 2%, снижение количества эозинофилов в легочной ткани на 87,1% и оценка воспаления легочной ткани с 6,2 до 2,1. Напротив, лечение анти-CD4 и OVA у выздоровевших мышей не имело эффекта на эозинофилию дыхательных путей и легких или образование слизи по сравнению с необработанными мышами в D3, что указывает на то, что лечение анти-CD4 не повлияло на рецидив заболевания. Однако параметры заболевания были уменьшены к D7, показывая, что в нашей модели Т _RM ответственны за ранние, но не поздние ответы (Рисунок 4B и дополнительные рисунки 10, 11).

Обсуждение

Возвратно-ремиттирующий характер сезонных (например, пыльца) или периодических (например, аллергены кошек) аллергических заболеваний решительно поддерживает роль иммунологических аллерген-специфических клеток Th3. Ранее мы определили, что долгоживущие аллерген-специфические клетки Th3 быстро вызывают рецидивы заболевания при воздействии аллергена у сенсибилизированных мышей и находятся в легких на протяжении всей жизни (> 800 дней) мыши после всего лишь одного эпизода ЕАА (6). Здесь мы исследовали циркулирующие и резидентные субпопуляции CD4 ⁺ Th-клеток во время болезни.Мы показываем, что долгоживущие аллерген-специфические клетки памяти Th3 в легких представляют собой «аллергическую память» Th3-T _RM . Более того, аллергические Th3-T _RM в легких имеют решающее значение для быстрого инициирования аллерген-индуцированных рецидивов заболевания, имитирующих приступы аллергической астмы у пациентов.

Мы отслеживали CD4 ⁺ Т-клетки в экспериментах с анти-CD4 при инициации и рецидиве заболевания и определили, что циркулирующие CD4 ⁺ Т-клетки и легкие T _RM необходимы в разное время во время болезни.Во-первых, введение mAb против CD4 уменьшало начало аллергического заболевания легких за счет устранения преобладающей популяции циркулирующих клеток CD4 ⁺ Th, образующихся во время сенсибилизации. Эти данные подтверждают предыдущие исследования, подтверждая, что системная (i.p.) сенсибилизация аллергеном и буст генерируют в основном циркулирующие клетки с небольшим количеством Т _RM из-за отсутствия локального воздействия аллергена (17). Во-вторых, лечение анти-CD4 у выздоровевших мышей, повторно зараженных аллергеном, не уменьшало тяжесть рецидива заболевания по сравнению с необработанными контролями, как оценивалось на D3.Это указывает на то, что в легких присутствует достаточное количество клеток памяти Th3 или, более конкретно, Th3-T _RM , которые способны быстро реагировать на аллерген. Эти данные подтверждают исследования, показывающие, что Т _RM в легких мышей на инфекционных моделях играют роль в раннем ответе на вирусную инфекцию (34–36). В-третьих, в то время как наши данные демонстрируют критическую роль Th3-T _RMs в легких в рецидиве EAA сразу после повторного вызова аллергена (оценка на D3), циркулирующие CD4 ⁺ Т-клетки, по-видимому, вносят вклад в полную степень рецидива заболевания.В день 7 после повторного введения аллергена реакция на аллерген вызывает значительно менее тяжелое заболевание по сравнению с контрольной группой, не получавшей лечения. Эти данные предполагают, что циркулирующие Т-клетки, элиминированные анти-CD4, необходимы позже для иммиграции в легкие и увеличения популяции эффекторных Т-клеток CD4 ⁺ для усиления или продления общего тканевого ответа. Взятые вместе, эти эксперименты демонстрируют различные роли циркулирующих CD4 ⁺ Th-клеток и Th3-T _RM легких, несмотря на возможность того, что небольшая популяция временных циркулирующих клеток мигрировала через легкие во время мечения in vivo (37 ) остались без метки.

Для дальнейшего выяснения роли субпопуляций CD4 ⁺ Th мы отслеживали Т _RM в легких и проследили наивные и резидентные и циркулирующие в памяти клетки в легких и селезенке. В здоровом организме в основном циркулируют наивные клетки CD4 ⁺ Th, а в легких обнаружено небольшое количество резидентных клеток. По мере развития болезни (в начале) в легких значительно увеличивается количество защищенных клеток, которые, вероятно, являются эффекторными клетками Th. Большинство этих эффекторных клеток исчезают в течение ~ 1 месяца, и остается несколько резидентных Th-клеток памяти или RM T _{.При выздоровлении количество Т RM больше, чем в здоровых легких, что подтверждает присутствие этих клеток и указывает на то, что они готовы и готовы немедленно отреагировать на аллерген и вызвать приступ астмы (рецидив). Действительно, в D3 после повторного вызова OVA резидентные клетки увеличиваются в легких, поскольку они реагируют против аллергена. Эти результаты на мышах напоминают клиническую ситуацию у сенсибилизированных пациентов с атопией, которые быстро реагируют на повторный контакт аллергена (например, пыльцы или аллергена кошки).В дополнение к изменяющейся популяции резидентных клеток легких в селезенке имеется большое количество циркулирующих Т-лимфоцитов CD4 ⁺ , которые также изменяются во время болезни. Эти циркулирующие клетки уменьшаются как на ранней стадии инициации заболевания, так и при рецидиве (до D3) с последующим увеличением на D7. Механизм, лежащий в основе сопутствующей обратной пропорции циркулирующих CD4 ⁺ Т клеток селезенки и резидентных клеток легких во время инициации и рецидива заболевания, может быть объяснен циркулирующими CD4 ⁺ Т-лимфоцитами селезенки, мигрирующими из селезенки в виде эффекторных клеток CD4 ⁺ T в легкие, где они клонально расширяют T RM .В качестве альтернативы циркулирующие CD4 ⁺ Т-клетки из селезенки являются неспецифическими клетками-свидетелями, которые усиливают способность Т RM расширяться в легких. Существуют дополнительные подмножества, включая наивные защищенные Т-клетки CD4 ⁺ , которые, вероятно, находятся в белой пульпе селезенки, что было ранее показано (15, 38), и наивные циркулирующие CD4 ⁺ Т-клетки в легких, которые остаются постоянными на всех этапах болезнь. Роль любой из этих популяций не ясна, но вполне вероятно, что наивные циркулирующие клетки в легких представляют собой неспецифические клетки-свидетели.}

Чтобы определить фенотип CD4 ⁺ T субпопуляций циркулирующих и резидентных клеток, мы сосредоточились на наивной экспрессии маркеров памяти, CD69 и ST2, причем два последних рассматривались как маркеры для клеток T _RMs и Th3 соответственно (10, 11, 15, 24, 26–28). Восстановленные легкие имеют увеличенное количество CD4 ⁺ CD44 ^hi CD69 ⁺ ST2 ⁺ и CD4 ⁺ CD44 ^hi CD69 ^— ST2 ⁺ резидентных Т-клеток памяти по сравнению со здоровыми легкими.Эти клетки представляют собой Th3-T _RM независимо от экспрессии CD69, что указывает на то, что CD69 может быть не самым точным маркером для T _RM , что подтверждает предыдущие исследования (39, 40). После заражения респираторным трактом аллергеном большая часть аллерген-специфических клеток памяти Th3 остается в легких в виде Т _RM , которые, как мы предполагаем, находятся там, чтобы обеспечить более быстрые и эффективные ответы на контакт с аллергеном. Примечательно, что небольшая популяция Th3 клеток памяти (в 10 раз меньше, чем популяция легких) сохраняется в селезенке, которая, вероятно, содержит центральную память и вторичный лимфоидный орган T _RM (40-43).Вполне возможно, что эти клетки, хотя и в небольшом количестве, участвуют в поддержании памяти, являются потенциальным источником клеток памяти или способствуют увеличению популяций эффекторных клеток памяти / памяти при встрече с аллергеном. Точная роль этих Th3 клеток селезенки еще не выяснена.

Чтобы дополнительно охарактеризовать субпопуляции CD4 ⁺ T циркулирующих и резидентных клеток, мы сосредоточились на классе ответа. Помимо экспрессии ST2, T _RM продуцировали аллерген-специфические цитокины Th3.Однако, в отличие от предыдущего исследования на модели аллергического клеща домашней пыли (HDM), аллерген-специфические цитокины Th2 или Th27 не продуцировались клетками селезенки и легких (17), что, вероятно, связано с комбинацией белков HDM по сравнению с один очищенный белок OVA. Несмотря на отсутствие аллерген-специфических цитокинов, не относящихся к Th3, стимуляция с помощью PMA, индуцированного IFNγ и IL-17α из легких и IFNγ из клеток селезенки здоровых и выздоровевших мышей, демонстрирует преобладающий OVA-специфический ответ Th3 и очевидное присутствие других сторонних наблюдателей. клетки в ткани.

Убедительное доказательство присутствия резидентных клеток памяти в легких было получено при введении FTY720, которое уменьшало циркулирующие CD3 ⁺ CD4 ⁺ CD44 ^hi CD62L ^— CD69 ^— ST2 ^{— / +} (легкое> селезенка ) и увеличил процент OVA-специфичных CD3 ⁺ CD4 ⁺ CD44 ^hi CD62L ^— ST2 ⁺ Т-клеток в легких. Эти данные демонстрируют, что сохранение T _RM легких связано с их неспособностью циркулировать и эмигрировать из легочной ткани.Т _RM остаются в легких и не нуждаются в миграции, как наблюдалось ранее (15, 28, 44). Кроме того, поддержание T _RM легких происходит в отсутствие иммиграции других циркулирующих или лимфоидных Т-клеток в легкие, что подтверждается предыдущими исследованиями (15, 28). Наши данные показывают, что клетки, устойчивые к FTY720 и анти-CD4, сохраняются в легких и опосредуют заболевание, что согласуется с другими исследованиями на мышах (17, 28) и клиническими исследованиями, демонстрирующими небольшую пользу лечения анти-CD4 при тяжелой астме (45, 46). ).

Наши данные сосредоточены на аллергической реакции легких на чужеродный белок. Однако эти результаты можно обобщить, поскольку существуют дополнительные исследования, посвященные Т _RM с аналогичными свойствами при аллергии, аллергическом заболевании легких и вирусных заболеваниях (15-17, 28, 47). Наши результаты с OVA подтверждают предыдущие исследования, показывающие, что T _RM участвуют в патогенезе аллергической астмы, индуцированной HDM (17). Однако в этих исследованиях изучались реакции памяти после периода восстановления 60–80 дней (17, 28), в то время как наше исследование является первым, показывающим, что T _RM сохраняется в течение более 600 дней и доказывает, что как только память устанавливается в легких после После единичного эпизода EAA животные сохраняют клетки памяти на всю жизнь.Это имеет клинические последствия, включая объяснение того, почему большинство пациентов с аллергической астмой остаются аллергиками на протяжении всей жизни. Однако вполне вероятно, что повторное воздействие аллергенов будет постоянно поддерживать и / или увеличивать T _RM с течением времени, что приводит к потенциально более тяжелой астме. Также вероятно, что гомеостатические механизмы, которые обычно ограничивают количество Т-клеток, будут защищать от переизбытка антиген-специфичных Т _RM в ткани. Напротив, трудно объяснить, почему некоторые младенцы с аллергической астмой «вырастают» из своей аллергии, но это может быть следствием незрелой иммунной системы, которая генерирует только несколько T _RM , или несовместимого микроокружения в периферических тканях. это не поддерживает их.У детей, которые действительно обладают Т _RM в одном периферическом органе, есть соблазн предположить, что Т _RM могут лежать в основе «аллергического марша», распространяясь на другие системы органов. Однако это может относиться к циркулирующим клеткам памяти, поскольку нет исследований, изучающих продолжительность как аллерген-специфического Т _RM , так и циркулирующих клеток памяти, хотя краткосрочные эксперименты с парабиозом показывают, что Т _RM не мигрируют из ткани ( 28).

Таким образом, животные, выздоровевшие только после одного эпизода аллергического заболевания, на протяжении всей жизни имеют Т _RM в легких, поскольку они являются индикаторами быстрого инициирования рецидивов аллерген-индуцированного заболевания, что является клинически значимым.Эта модель дает возможность исследовать новые подходы к лечению аллергических заболеваний, сосредоточив внимание на аллергенспецифичных покоящихся T _RM во время выздоровления и активированных T _RM во время рецидива в качестве терапевтических мишеней.

Заявление об этике

Это исследование было проведено в строгом соответствии с инструкциями по уходу и использованию лабораторных животных Министерства науки Австрии. Протокол был одобрен Комитетом по этике Министерства науки Австрии (номер: GZ: 66.009/0330-II / 3b / 2013). Все болезненные процедуры проводились под анестезией, и все усилия были направлены на то, чтобы минимизировать страдания.

Авторские взносы

BB разработал и провел эксперименты, проанализировал образцы и внес свой вклад в подготовку рукописи. СК разработал и провел эксперименты, проанализировал образцы и внес свой вклад в подготовку рукописи. Л.А. проводил эксперименты и участвовал в подготовке рукописи. GM способствовал иммунофлуоресцентному окрашиванию легких.ME контролировал эксперименты и участвовал в подготовке рукописи. Все авторы прочитали и одобрили окончательную версию рукописи.

Финансирование

Работа финансировалась проектом FP7 Государственно-частного партнерства по визуализации и геномике астмы (P3AGI) в рамках гранта № 230739 и Hochschuljubilaeumsstiftung der Stadt Wien № H-314145/2017.

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить Вольфганга Венингера, Франка Бромбахера, Шу-Хуа Лю и Сабело Хадебе за критическое прочтение рукописи, а также Павола Миколку и Георга Водарца за технический вклад. Мы хотели бы отметить, что эксперименты по проточной цитометрии проводились в основном здании Венского медицинского университета.

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https: // www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2019.00840/full#supplementary-material

Сокращения

EAA: экспериментальная аллергическая астма; T _RMs : резидентные клетки памяти ткани; Th3: T-помощник 2 типа; CD: Кластер дифференциации; AHR: гиперреактивность дыхательных путей; БАЛ: жидкость бронхоальвеолярного лаважа; внутрибрюшинно: внутрибрюшинно; и.н .: интраназально; в / в: внутривенно; mAb: моноклональное антитело; OVA: овальбумин; ФМА: форбол 12-миристат 13-ацетат; BSA: бычий сывороточный альбумин; ПАС: периодическая кислота Шиффа; H&E: гематоксилин и эозин.

Список литературы

4. Буске Дж., Джеффри П.К., Бусс В.В., Джонсон М., Виньола А.М. Астма. От бронхоспазма до воспаления и ремоделирования дыхательных путей. Am J Respir Crit Care Med. (2000) 161: 1720–45. DOI: 10.1164 / ajrccm.161.5.92

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

7. Робинсон Д.С., Бентли А., Хартнелл А., Баррикай А., Дарем С.Р. Активированные Т-хелперы памяти в жидкости бронхоальвеолярного лаважа пациентов с атопической астмой: связь с симптомами астмы, функцией легких и реактивностью бронхов. Грудь. (1993) 48: 26–32. DOI: 10.1136 / thx.48.1.26

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

8. Truyen E, Coteur L, Dilissen E, Overbergh L, Dupont LJ, Ceuppens JL, et al. Оценка воспаления дыхательных путей путем количественного измерения мРНК цитокинов Th2 / Th3 в мокроте пациентов с астмой. Грудь. (2006) 61: 202–8. DOI: 10.1136 / thx.2005.052399

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

10. Цзян X, Кларк Р.А., Лю Л., Уэйджерс А.Дж., Фульбригге Р.К., Куппер Т.С.Кожная инфекция генерирует немигрирующие клетки памяти CD8 + T (RM), обеспечивающие глобальный кожный иммунитет. Природа. (2012) 483: 227–31. DOI: 10.1038 / природа10851

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

11. Маккей Л.К., Рахимпур А., Ма Дж.З., Коллинз Н., Сток А.Т., Хафон М.Л. и др. Путь развития CD103 (+) CD8 + резидентных Т-клеток памяти кожи. Nat Immunol. (2013) 14: 1294–301. DOI: 10.1038 / ni.2744

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

12.Мюллер С. Н., Гебхардт Т., Карбон Ф. Р., Хит В. Р.. Подмножества Т-клеток памяти, паттерны миграции и местожительство в тканях. Annu Rev Immunol. (2013) 31: 137–61. DOI: 10.1146 / annurev -munol-032712-095954

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

13. Pizzolla A, Nguyen TH, Sant S, Jaffar J, Loudovaris T., Mannering SI, et al. Резидентные Т-клетки памяти гриппа в легких являются пролиферативными и полифункциональными и поддерживают различные профили TCR. J Clin Invest. (2018) 128: 721–33. DOI: 10.1172 / JCI96957

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

15. Тернер Д.Л., Бикхэм К.Л., Том Дж. Дж., Ким С. Ю., Д’овидио Ф., Уэрри Е. Дж. И др. Ниши в легких для генерации и поддержания резидентных в тканях Т-клеток памяти. Mucosal Immunol. (2014) 7: 501–10. DOI: 10,1038 / mi.2013.67

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

17. Тернер Д.Л., Голдкланг М., Цветковски Ф., Пайк Д., Тришлер Дж., Бараона Дж. И др.Смещенная генерация и in situ активация резидентных в легочной ткани Т-лимфоцитов памяти CD4 в патогенезе аллергической астмы. J Immunol. (2018) 200: 1561–9. DOI: 10.4049 / jimmunol.1700257

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

18. Пурвар Р., Кэмпбелл Дж, Мерфи Дж., Ричардс В.Г., Кларк Р.А., Куппер Т.С. Резидентные Т-клетки памяти (T (RM)) широко распространены в легких человека: разнообразие, функция и антигенная специфичность. PLoS ONE. (2011) 6: e16245.DOI: 10.1371 / journal.pone.0016245

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

20. Пит Б., Де Бри Дж. Дж., Смидс-Дирдорп Б. С., Ван дер Лоос С. М., Реммерсвааль Э. Б., фон дер Тусен Дж. Х. и др. CD8 (+) Т-клетки с интраэпителиальным фенотипом усиливают цитотоксическую функцию при гриппозной инфекции в легких человека. J Clin Invest. (2011) 121: 2254–63. DOI: 10.1172 / JCI44675

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

21. Сатхалиявала Т., Кубота М., Юданин Н., Тернер Д., Кэмп П., Том Дж. Дж. И др.Распределение и компартментализация циркулирующих и тканевых субпопуляций Т-клеток памяти человека. Иммунитет. (2013) 38: 187–97. DOI: 10.1016 / j.immuni.2012.09.020

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

22. Снайдер М.Э., Финлейсон МО, Коннорс Т.Дж., Догра П., Сенда Т., Буш Е. и др. Генерация и сохранение резидентных Т-клеток памяти человека при трансплантации легких. Sci Immunol. (2019) 4: eaav5581. DOI: 10.1126 / sciimmunol.aav5581

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

23.Vervloet D, Penaud A, Razzouk H, Senft M, Arnaud A, Boutin C и др. Высотные и домашние пылевые клещи. J Allergy Clin Immunol. (1982) 69: 290–6. DOI: 10.1016 / S0091-6749 (82) 80006-7

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

24. Lohning M, Stroehmann A, Coyle AJ, Grogan JL, Lin S, Gutierrez-Ramos JC, et al. T1 / ST2 предпочтительно экспрессируется на мышиных клетках Th3 независимо от интерлейкина 4, интерлейкина 5 и интерлейкина 10 и важен для эффекторной функции Th3. Proc Natl Acad Sci USA. (1998) 95: 6930–5. DOI: 10.1073 / pnas.95.12.6930

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

25. Лю Л., Фульбригге Р.С., Карибиан К., Тиан Т., Куппер Т.С. Динамическое программирование трафика CD8 + Т-клеток после иммунизации живыми вирусами. Иммунитет. (2006) 25: 511–20. DOI: 10.1016 / j.immuni.2006.06.019

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

27. Hogan RJ, Usherwood EJ, Zhong W., Roberts AA, Dutton RW, Harmsen AG, et al.Активированные антиген-специфические CD8 + Т-клетки сохраняются в легких после выздоровления от респираторных вирусных инфекций. J Immunol. (2001) 166: 1813–22. DOI: 10.4049 / jimmunol.166.3.1813

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

28. Hondowicz BD, An D, Schenkel JM, Kim KS, Steach HR, Krishnamurty AT, et al. Интерлейкин-2-зависимые аллерген-специфические тканерезидентные клетки памяти вызывают астму. Иммунитет. (2016) 44: 155–66. DOI: 10.1016 / j.immuni.2015.11.004

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

29. Ledgerwood LG, Lal G, Zhang N, Garin A, Esses SJ, Ginhoux F, et al. Сфингозин-1-фосфатный рецептор 1 вызывает задержку в ткани, ингибируя проникновение Т-лимфоцитов периферической ткани в афферентные лимфатические сосуды. Nat Immunol. (2008) 9: 42–53. DOI: 10.1038 / ni1534

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

30. Tiper IV, East JE, Subrahmanyam PB, Webb TJ.Передача сигналов сфингозин-1-фосфата влияет на миграцию лимфоцитов, воспаление и инфекцию. Pathog Dis. (2016) 74. DOI: 10.1093 / femspd / ftw063

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

31. Шенкель Дж. М., Фрейзер К. А., Беура Л. К., Паукен К. Э., Везис В., Масопуст Д. Т-клеточная память. Резидентные Т-клетки памяти CD8 запускают защитные врожденные и адаптивные иммунные ответы. Наука. (2014) 346: 98–101. DOI: 10.1126 / science.1254536

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

32.Коллинз Н., Цзян X, Зайд А., Маклеод Б.Л., Ли Дж., Парк CO и др. CD4 (+) Т-клетки памяти кожи демонстрируют объединенное кластер-опосредованное удерживание и уравновешивание с кровообращением. Nat Commun. (2016) 7: 11514. DOI: 10.1038 / ncomms11514

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

33. Ватанабе Р., Гехад А., Янг С., Скотт Л.Л., Тиг Дж. Э., Шлапбах С. и др. Кожа человека защищена четырьмя функционально и фенотипически обособленными популяциями резидентных и рециркулирующих Т-клеток памяти. Sci Transl Med. (2015) 7: 279ra39. DOI: 10.1126 / scitranslmed.3010302

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

34. Wu T, Hu Y, Lee YT, Bouchard KR, Benechet A, Khanna K, et al. Резидентные в легких Т-клетки памяти CD8 (TRM) незаменимы для оптимальной перекрестной защиты от легочной вирусной инфекции. J Leukoc Biol. (2014) 95: 215–24. DOI: 10.1189 / jlb.0313180

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

35.Зенс К.Д., Чен Дж. К., Фарбер Д.Л. Резидентные Т-клетки памяти в легочной ткани, произведенные вакциной, обеспечивают гетероподтипную защиту от инфекции гриппа. JCI Insight. (2016) 1: e85832. DOI: 10.1172 / jci.insight.85832

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

36. Тейджаро Дж. Р., Тернер Д., Фам К., Уэрри Э. Дж., Лефрансуа Л., Фарбер Д. Л.. Передний край: сохраняющая ткань легочная память CD4 Т-клетки обеспечивают оптимальную защиту от респираторной вирусной инфекции. J Immunol. (2011) 187: 5510–4. DOI: 10.4049 / jimmunol.1102243

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

37. Reagin KL, Klonowski KD. Неполные воспоминания: естественное подавление резидентных в тканях памяти CD8 Т-клеток в легких. Front Immunol. (2018) 9:17. DOI: 10.3389 / fimmu.2018.00017

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

38. Андерсон К.Г., Сунг Х., Скон К.Н., Лефрансуа Л., Дайзингер А., Везис В. и др. Передний край: внутрисосудистое окрашивание по-новому определяет ответы Т-лимфоцитов CD8. J Immunol. (2012) 189: 2702–6. DOI: 10.4049 / jimmunol.1201682

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

39. Steinert EM, Schenkel JM, Fraser KA, Beura LK, Manlove LS, Igyarto BZ, et al. Количественная оценка CD8 Т-клеток памяти показывает регионализацию иммунного надзора. Ячейка. (2015) 161: 737–49. DOI: 10.1016 / j.cell.2015.03.031

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

40. Beura LK, Wijeyesinghe S, Thompson EA, Macchietto MG, Rosato PC, Pierson MJ, et al.Т-клетки в нелимфоидных тканях дают резидентные в лимфатических узлах Т-клетки памяти. Иммунитет. (2018) 48: 327–38.e5. DOI: 10.1016 / j.immuni.2018.01.015

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

41. Шенкель Дж. М., Фрейзер К. А., Масопуст Д. Передний край: резидентные Т-клетки памяти CD8 занимают передние ниши во вторичных лимфоидных органах. J Immunol. (2014) 192: 2961–4. DOI: 10.4049 / jimmunol.1400003

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

42.Marriott CL, Dutton EE, Tomura M, Withers DR. Удержание Ag-специфических CD4 (+) Т-клеток памяти в дренирующем лимфатическом узле указывает на резидентные популяции памяти в лимфоидной ткани. Eur J Immunol. (2017) 47: 860–71. DOI: 10.1002 / eji.201646681

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

43. Такамура С., Яги Х., Хаката Ю., Мотодзоно С., Макмастер С. Р., Масумото Т. и др. Специфические ниши для резидентных в легких CD8 + Т-клеток памяти в месте регенерации ткани позволяют поддерживать CD69-независимое поддержание. J Exp Med. (2016) 213: 3057–73. DOI: 10.1084 / jem.20160938

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

45. Кон О.М., Сихра Б.С., Комптон С.Х., Леонард ТБ, Кей А.Б., Барнс, Северная Каролина. Рандомизированное, рандомизированное, плацебо-контролируемое исследование химерного антитела к CD4 (келиксимабу) при хронической тяжелой астме. Ланцет. (1998) 352: 1109–13. DOI: 10.1016 / S0140-6736 (97) 12261-9

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

47.Glennie ND, Yeramilli VA, Beiting DP, Volk SW, Weaver CT, Scott P. Резидентные в коже памяти CD4 + Т-клетки усиливают защиту от основной инфекции Leishmania. J Exp Med. (2015) 212: 1405–14. DOI: 10.1084 / jem.20142101

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Начало HOBO S-FS-TRMSA FlexSmart TRMS Модуль тока / напряжения, 15 бит

Выберите CountryUnited StatesCanadaMexicoAfghanistanAlbaniaAlgeriaAmerican SamoaAndorraAngolaAnguillaAntarcticaAntigua и BarbudaArgentinaArmeniaArubaAustraliaAustriaAzerbaijanBahamasBahrainBangladeshBarbadosBelarusBelgiumBelizeBeninBermudaBhutanBoliviaBosnia и HerzegovinaBotswanaBouvet IslandBrazilBritish Индийский океан TerritoryBrunei DarussalamBulgariaBurkina FasoBurundiCambodiaCameroonCanadaCape VerdeCayman IslandsCentral африканских RepublicChadChileChinaChristmas IslandCocos (Килинг) IslandsColombiaComorosCongoCongo, Демократическая Республика TheCook IslandsCosta RicaCote D’ivoireCroatiaCubaCyprusCzech RepublicDenmarkDjiboutiDominicaDominican RepublicEcuadorEgyptEl SalvadorEquatorial GuineaEritreaEstoniaEthiopiaFalkland (Мальвинских) островах Фарерских IslandsFijiFinlandFranceFrench GuianaFrench PolynesiaFrench Южный TerritoriesGabonGambiaGeorgiaGermanyGhanaGibraltarGreeceGreenlandGrenadaGuadeloupeGuamGuatemalaGuernseyGuineaGuinea- bissauГайанаГаитиОстров Херд и Макдональд LY Престол (Ватикан) HondurasHong KongHungaryIcelandIndiaIndonesiaIran, Исламская Республика ofIraqIrelandIsle из ManIsraelItalyJamaicaJapanJerseyJordanKazakhstanKenyaKiribatiKorea, Корейская Народно-Демократическая Республика ofKorea, Республика ofKuwaitKyrgyzstanLao Народная Демократическая RepublicLatviaLebanonLesothoLiberiaLibyan Арабская JamahiriyaLiechtensteinLithuaniaLuxembourgMacaoMacedonia, бывшая югославская Республика ofMadagascarMalawiMalaysiaMaldivesMaliMaltaMarshall IslandsMartiniqueMauritaniaMauritiusMayotteMexicoMicronesia, Федеративные Штаты ofMoldova, Республика ofMonacoMongoliaMontenegroMontserratMoroccoMozambiqueMyanmarNamibiaNauruNepalNetherlandsNetherlands AntillesNew CaledoniaNew ZealandNicaraguaNigerNigeriaNiueNorfolk IslandNorthern Mariana IslandsNorwayOmanPakistanPalauPalestinian край, ОккупированнаяПанамаПапуа-Новая ГвинеяПарагвайПеруФилиппиныПиткэрнПольшаПортугалияПуэрто-РикоКатарВоссоединениеРумынияРоссийская ФедерацияРуандаСвятой ЕленыСент-Китс и НевисСент-ЛюсияСент-Пьер и МикелонСэн т Винсент и GrenadinesSamoaSan MarinoSao Томе и PrincipeSaudi ArabiaSenegalSerbiaSeychellesSierra LeoneSingaporeSlovakiaSloveniaSolomon IslandsSomaliaSouth AfricaSouth Джорджия и Южные Сандвичевы IslandsSpainSri LankaSudanSurinameSvalbard и Ян MayenSwazilandSwedenSwitzerlandSyrian Arab RepublicTaiwan, провинция ChinaTajikistanTanzania, Объединенная Республика ofThailandTimor-lesteTogoTokelauTongaTrinidad и TobagoTunisiaTurkeyTurkmenistanTurks и Кайкос IslandsTuvaluUgandaUkraineUnited арабских EmiratesUnited KingdomUnited StatesUnited Штаты Америки Внешние малые IslandsUruguayUzbekistanVanuatuVenezuelaViet NamVirgin острова , Британские Виргинские острова, U.С.Уоллис и ФутунаЗападная СахараЙеменЗамбияЗимбабве

IDEAL® 660 Amp Clamp W / TRMS

Магазин не будет работать правильно в случае, если куки отключены.

Похоже, в вашем браузере отключен JavaScript. Для наилучшей работы с нашим сайтом обязательно включите Javascript в своем браузере.

Токоизмерительные клещи TightSight®, 660 AAC с TRMS

Обзор продукта

• Нижний дисплей TightSight ™
• Конические губки с кончиком крючка
• Истинное среднеквадратичное значение тока и напряжения
• Напряжение переменного / постоянного тока
• Звуковая непрерывность
• Подавление высоких частот *
• Пиковое значение
• Макс / мин удержание
• Сохранение данных
• Выбираемые звуковые и визуальные предупреждения при обнаружении потенциально опасного напряжения на клеммах датчика
• Выбираемое автоматическое отключение питания
• Подсветка дисплей
• Индикатор разряда батареи
• Точно считывает электрические цепи с шумом

Проблема: приходилось ли вам когда-нибудь измерять ток в замкнутом, тускло освещенном и труднодоступном месте?

Решение: токоизмерительные клещи IDEAL TightSight ™! Этот измеритель позволяет пользователю безопасно и легко просматривать текущие измерения с эксклюзивным вторым дисплеем TightSight®.

Безопасность

• Запатентованный дисплей TightSight ™ позволяет легко снимать показания, удерживая голову на безопасном расстоянии от панели — больше не нужно крутить глюкометр или рисковать потянуть за провод под напряжением.
• Легко читаемый дисплей с подсветкой с большим номера и значки, чтобы вы всегда могли видеть правильные показания
• Выбираемые звуковые и визуальные предупреждения при обнаружении потенциально опасного напряжения на клеммах датчика
• Электронная защита от перегрузки на всех диапазонах
• Поставляемые измерительные провода соответствуют стандарту IEC61010-031

Производительность

• Чтение и запись в зажатом состоянии вместо удерживания считывания, разжима, перемещения и записи
• Наконечник крючка для облегчения отделения проводов и конические губки для проникновения в ограниченные пространства
• Помощь в поиске и устранении неисправностей с помощью считывания минимальных и максимальных значений за определенный период , я.е. ложное срабатывание и колебания напряжения питания
• True RMS обеспечивает точные показания несинусоидальных токов нагрузки
• Широкий диапазон тока от 0 до 1000 ампер (серия 61-770) охватывает множество приложений
• Большой диаметр губок для кабелей до 2 «» (51 мм) в диаметре (только серия 770)

Value

• Включает кейс для переноски и измерительные провода с зажимами типа «крокодил»
• Полные возможности переменного / постоянного тока: Tightsight ™ в равной степени адаптируется к требованиям измерения как переменного, так и постоянного тока, например как солнечная энергия, общественный транспорт и резервные батареи
• Доступны услуги по калибровке
• 2-летняя гарантия

Перечислено в cULus:

• Электрические характеристики CAT / рабочие диапазоны метра

Технические характеристики

• Приложения Коммерческое, промышленное, Жилое, рабочее и производственное освещение, склады

• Сертификаты cULus

  90 026

• Масса в упаковке 1.

  No related posts.