Секвентальный механизм: Как это работает: секвентальная коробка передач

Содержание

Как это работает: секвентальная коробка передач

Эволюция механической коробки передач привела к изобретению целого ряда типов трансмиссий, которые в той или иной мере упрощали водителю управление автомобилем. Важным шагом в этом плане стало изобретение автоматической коробки передач, которая впоследствии трансформировалась и совершенствовалась, позволяя водителю вообще не задумываться о том, когда и как нужно переключиться на нужную передачу. Но и механическая трансмиссия не осталась без внимания инженеров – ее тоже постоянно модернизировали и модифицировали, изобретая все новые и новые механизмы переключения передач. Одним из результатов таких изысканий стала секвентальная коробка передач – трансмиссия, отличающаяся тем, что ее передачи можно включать только в строгой последовательности: вверх для повышения передачи, вниз – для понижения.

Секвентальная коробка передач

Принцип работы секвентальной трансмиссии

Этот тип КПП построен на базе обычной механической трансмиссии.Секвентальный механизм: Как это работает: секвентальная коробка передач Ее основное отличие заключается в том, что вместо косозубых здесь стоят прямозубые шестерни, отсутствует педаль сцепления (эту роль выполняет электронный блок управления), а передачи в этой коробке переключаются при помощи гидравлического механизма. Это в значительной мере (до 150 миллисекунд) сокращает скорость переключения, что наиболее важно для спортивных автомобилей, на которых, кстати, секвентальная КПП устанавливается наиболее часто. Так, именно коробка передач с секвентальным механизмом монтируется на гоночные болиды, участвующие в Формуле 1 и прочих соревнованиях подобного толка. Конструкторы поняли, что коробка передач с таким механизмом будет наиболее удобной для гонщика, ведь при езде на высокой скорости, когда автомобиль подвержен вибрации, достаточно сложно попасть в нужную передачу. А секвентальная коробка передач справляется с этой задачей на пять с плюсом.

Впрочем, уже не один десяток лет секвентальный механизм переключения передач используют и на «гражданских» машинах.Секвентальный механизм: Как это работает: секвентальная коробка передач В обиходе его называют «ручным» режимом и характерен он для автоматических трансмиссий.

Плюсы и минусы секвентальной коробки передач

Как и у всякого механизма, который работает под нагрузкой, у секвентальной трансмиссии есть свои особенности. К положительным сторонам этого агрегата относится отсутствие педали сцепления, что важно для водителей-новичков (если мы говорим об использовании этого типа трансмиссии на серийных автомобилях). Вторым положительным фактором селективной КПП считается скорость переключения передач, которая выше чем у классических автоматической и механической трансмиссий. Третьим плюсом этой коробки передач является экономичность – благодаря сокращенному времени переключения передач. Четвертый аспект – выбор из двух режимов переключения передач (автоматический либо механический). Для такой коробки характерно наличие подрулевых «лепестков», посредством которых водитель переключает передачи, не отрывая рук от рулевого колеса.

Есть у этой коробки и свои минусы, и кроются они в конструкции самого агрегата.Секвентальный механизм: Как это работает: секвентальная коробка передач Дело в том, что гидравлический механизм секвентальной КПП неустойчив к износу и при езде под большой нагрузкой склонен к частому выходу из строя. На спортивных автомобилях, где нагрузки весьма высоки, такую коробку зачастую перебирают после каждой второй гонки. Для секвентальных коробок, использующихся на серийных автомобилях (BMW M3, M5, Mercedes-Benz C-Class) характерен более высокий ресурс мощности вследствие того, что они не испытывают перегрузок, подобно гоночным автомобилям. И все же, если эксплуатировать секвентальную коробку неправильно (в ручном режиме важно чувствовать момент и вовремя переключать передачи), то и на серийном автомобиле она долго не прослужит – может выйти из строя гидравлический привод сцепления и прочие узлы и агрегаты этой трансмиссии. А ремонт секвентальной КПП – удовольствие не из дешевых.

принцип работы, её плюсы и минусы

Коробка переключения передач автомобиля является одним из самых прогрессирующих узлов транспортного средства.Секвентальный механизм: Как это работает: секвентальная коробка передач

За время производства автомобилей были разработаны принципиально новые системы переключения передач с отличающимися механизмами. Одним из таких устройств является секвентальная КПП.

Секвентальная коробка передач: что это такое

Понятие «секвентальная» произошло от английского слова

sequence, что означает «последовательность». Передачи в такой коробке переключаются последовательно, от низшей к высшей, и наоборот. Такой принцип переключения применяется в мотоциклах, где управление происходит ногой. Действительно, управляя переключением передач ногой, трудно совершать сложные манипуляции. Поэтому выбрали простой алгоритм: перемещение рычага вверх соответствует повышению передачи, вниз – переходу на низшую передачу.

Есть еще некоторые транспортные средства, где традиционно применяется секвентальная КПП, военная техника (самоходные артиллерийские машины, танки). В них есть своя специфика. Во-первых, ими управляют неквалифицированные водители. Во-вторых, осуществляется быстрый переход на повышенную передачу с минимальными «провалами» по мощности во время переключения.Секвентальный механизм: Как это работает: секвентальная коробка передач Второе качество (практическое отсутствие провалов по мощности и скорости) обуславливает применение секвентальной передачи в скоростных спортивных болидах.

Видео — что значит секвентальная коробка передач на гоночном автомобиле Пежо 208:

Принцип работы секвентальной коробки передач

Конструкция секвентальной КПП по внешнему виду мало отличается от традиционной механической коробки передач.

Если рассмотреть поближе шестеренчатый механизм, можно сразу заметить, что зубья расположены строго перпендикулярны боковой поверхности шестерни.

Это необходимо, чтобы обеспечить их прямолинейное перемещение во время переключения.

С одной стороны, прямозубые шестерни имеют меньшее трение, чем косогубые за счет полного соответствия поверхностей. С другой стороны, косогубые шестерни в механической коробке предназначены для увеличения крутящего момента, который выдерживает шестеренчатая передача.Секвентальный механизм: Как это работает: секвентальная коробка передач Поэтому во многие секвентальные коробки устанавливают шестерни увеличенных размеров по ширине. Тем самым усиливается конструкция зубьев и их прочность.

Конструкция секвентальной коробки переключения передач позволяет довольно просто организовать автоматическое переключение режимов. Различают следующие секвентальные КПП:

  • с обычной механической системой переключения передач;
  • со спортивной системой переключения;
  • с автоматизированной системой переключения.

Для увеличения скорости переключения применяются гидравлика. С помощью гидравлических сервоприводов время на переключение минимальное. Во время активации перехода на другую передачу наполняется гидроаккумулятор, что способствует созданию давления в гидравлической системе. Время переключения передачи составляет десятую долю секунды. Этот решающий факт определяет применение секвентальной КПП в спортивных автомобилях. Часто органы управления КПП выносят в область рулевой колонки, что еще больше упрощает управление режимами.Секвентальный механизм: Как это работает: секвентальная коробка передач

Чем она отличается от роботизированной

Многие автолюбители ошибочно считают, что секвентальная КПП является близкой родственницей роботизированной. Их принципиальное отличие состоит в применении в секвентальной коробке гидравлической системы при переключении передач. Роботизированная коробка использует для этого электропривод. Также в роботизированных коробках применен другой режим переключения шестеренчатых передач.

Видео — переключение передач на секвентальной КПП гоночного автомобиля:

Их преимущества и недостатки

Основные преимущества таких коробок:

  • минимальное время на переключение скорости;
  • минимальные потери по мощности прямозубых шестерен;
  • экономия топлива;
  • возможность перехода с ручного на автоматический режим;
  • возможность управления переключением с рулевой колонки;
  • применение системы без использования педали сцепления.Секвентальный механизм: Как это работает: секвентальная коробка передач

Недостатки секвентальной КПП:

  • последовательное переключение передач иногда стесняет водителя в плане применения экстремальных стилей вождения, необходимых включений передачи, например, во время запуска двигателя «с толкача»;
  • относительно высокий вес КПП при аналогичной мощности;
  • уменьшенный срок эксплуатации, связанный с технической сложностью механизмов;
  • большая стоимость обслуживания и ремонта.

В каких легковых автомобилях можно встретить секвентальную КПП

Из наиболее распространенных легковых машин можно привести пример BMW 1996 года выпуска с коробкой SMG. Системы SMG1 и SMG2 устанавливались на BMW третьей серии с индексом S. С 2004 года такая трансмиссия устанавливалась на BMW E60 M5. Также секвентальная КПП устанавливались на отдельные модели автомобилей Тойота Королла, Мерседес С-класс, БМВ Х5.

Схема расположения секвентальной коробки передач и ее элементов показана на рисунке:

На рисунке: 1 – блок управления секвентальной КПП, 4 и 5 – индикатор и переключатель режимов, 7 – 6-ти ступенчатая КПП, 12 – блок гидравлический, 10 – гидропривод, 11 – сцепление.Секвентальный механизм: Как это работает: секвентальная коробка передач

Особенности установки секвентальной КПП на автомобили ВАЗ

Многие автолюбители в качестве апгрейта своего ВАЗа приобретают секвентальные коробки переключения передач с кулачковым механизмом. Их внешний вид приблизительно такой.

Что касается значительного эффекта, то рассчитывать на это не приходится, так как динамика автомобиля при этом, судя по отзывам владельцев, увеличивается незначительно, хотя эти коробки именуются «спортивные». Помимо этого вес таких коробок обычно выше, чем традиционных. Там применены широкие массивные шестерни с перпендикулярным расположением зубьев, чтобы компенсировать их невысокую нагрузочную способность.

Кроме этого, прямозубые зубья увеличивают шумность КПП. Реальный срок службы секвентальной КПП кустарного производства небольшой. Такую коробку передач можно устанавливать, если предполагается участие автомобиля в спортивных соревнованиях, но не для каждодневной езды по городу.

Выводы

Подводя итог, можно отметить, что разработка и внедрение в серийное производство секвентальных коробок переключения передач внесла определенный технический прогресс в развитие автомобилестроения.Секвентальный механизм: Как это работает: секвентальная коробка передач Широкое распространение такие КПП не получили вследствие наличия многочисленных недостатков.

Читайте про крутящий момент двигателя: что это такое и на что он влияет.

Толщиномеры лакокрасочного покрытия кузова автомобиля бывают различных видов и имеют различные принципы работы.

Об особенностях использования круиз-контроля https://voditeliauto.ru/poleznaya-informaciya/aksessuary-i-gadzhety-dlya-avto/kruiz-kontrol-na-mexanike.html на механической коробке передач.

Видео — секвентальная коробка переключения передач Samsonas на Mitsubishi Evolution:


Секвентальная коробка передач: устройство, преимущества и мифы

В обзоре на самый динамичный дорожный автомобиль от Lotus, представленный в конце июня 2015 года в Гудвуде, вы могли обратить внимание на наличие секвентальной коробки переключения передач, которая уже давно стала неотъемлемым атрибутом спорт- и суперкаров.Секвентальный механизм: Как это работает: секвентальная коробка передач Поскольку некоторые каракумники заинтересовались устройством и особенностями данного типа КПП, я расскажу вам о ней. Секвентальная КПП отличается возможностью только последовательного переключения между передачами. Иными словами, водитель может перейти только на одну передачу выше либо ниже используемой, не перескакивая через остальные, как это можно сделать в классической механической КПП с поисковым принципом переключения. Предлагаю более подробно ознакомится с этим типом коробок переключения и развеять пару заблуждений, связанных с секвентальными КПП.

Принцип работы секвентальной КПП
Как мы уже выяснили, передачи этого типа трансмиссии переключаются только поочерёдно, в строго заданной последовательности. И поскольку секвентальная КПП построена на базе механической, мы будем делать отсылки по принципу работы именно к МКПП.

Во-первых, для секвентальной КПП характерно отсутствие педали сцепления, что в первую очередь обрадует не умудренных опытом водителей.Секвентальный механизм: Как это работает: секвентальная коробка передач Это сильно облегчает управление автомобилем, ведь постоянные танцы левой ногой на педали сцепления, прямо скажем - дело на любителя. Сцеплением управляет не водитель, а электронный блок, который получает сигнал от сенсоров, считывающих нажатие на педаль газа и непосредственно включение конкретной передачи. Как говорится, дело техники. Когда коробка получает команду от электронного блока, с помощью специальных датчиков в прогрессивный блок передаётся новый сигнал об используемой скорости автомобиля. Прогрессивный блок является последней инстанцией, где корректируется скоростной режим на основе различных показателей: начиная от оборотов двигателя и заканчивая работой кондиционера.
Видео, демонстрирующее работу секвентальной коробки передач. Как стремительно переключаются скорости!

Во-вторых, в секвентальной КПП используются прямозубые шестерни.Секвентальный механизм: Как это работает: секвентальная коробка передач Они выдают больший коэффициент полезного действия, если сравнивать с косозубыми из МКПП. Это вызвано тем, что косозубые шестерни имеют больше потерь на трение. Но и крутящий момент прямозубые шестерни способны передавать меньший, поэтому в секвентальных КПП часто используют шестерни бОльшего размера для компенсации этого недостатка.

И наконец, третьей отличительной чертой секвентальной трансмиссии является наличие гидравлических сервоприводов, с помощью которых происходит переключение между передачами. В настоящее время гидравлические сервоприводы часто ассоциируют с роботизированной КПП, но это не так. В последней используются электрические.
Об одном из вариантов исполнения секвентальной коробки рассказывает в своём видео Евгений Травников:

Преимущества и недостатки секвентальной КПП
Теперь, когда мы имеем представление о принципе работы упомянутой трансмиссии, давайте разберёмся, чего же стоит от неё ожидать.Секвентальный механизм: Как это работает: секвентальная коробка передач

Преимущества:
1. Высокая скорость и удобство переключения между передачами. Благодаря наличию электронного блока управления и гидравлического механизма, временные затраты на переключение сокращаются до 150 миллисекунд, что играет весомую роль в профессиональном автоспорте. Более шустрым переключением передач не могут похвастаться ни одна из классических трансмиссий, причём как механических, так и автоматических. Кроме того, с секвентальной КПП вы не будете судорожно пытаться попасть в нужную скорость, мчась из всех лошадиных сил по кольцу, когда удержать автомобиль на правильной траектории мешает высокая нагрузка и тряска с вибрацией.

2. Нет потери скорости при переключении.

3. Экономичный расход топлива.
Последние два пункта являются скорее последствием первого, однако мы не можем не учесть этого, отдавая должное секвентальной КПП.

4. Возможность переключения подрулевыми лепестками. Да, эта технология, так полюбившаяся настоящим гонщикам, открылась благодаря секвентальному механизму переключения.Секвентальный механизм: Как это работает: секвентальная коробка передач
Кстати, геймерам этот механизм тоже полюбился. Некоторые даже сами берутся разрабатывать такие коробки =)

Пятым преимуществом можно было бы назвать выбор между двумя режимами –автоматическим и ручным переключением передач (так называемый спорт-режим). Но эта особенность характерна для автоматических КПП. А так как секвентальная трансмиссия может существовать самостоятельно, оставим это преимущество отдельным видам автоматических КПП.

Недостатки:
1. Неустойчивость к высоким нагрузкам и износу. Здесь речь идёт не только о тех нагрузках, которые испытывает коробка болидов Формулы 1 на гоночной трассе, но и о нагрузках, которые может испытывать гидравлический механизм при неправильном переключении на гражданских автомобилях. Как бы ни было просто переключать передачи на секвентальной КПП, делать это нужно своевременно. Агрегаты этой трансмиссии довольно чувствительны и быстро изнашиваются из-за особенностей конструкции.Секвентальный механизм: Как это работает: секвентальная коробка передач Ведь чем сложнее механизм, тем больше вероятность его поломки.

2. Дороговизна в обслуживании. Собственно, здесь тоже можно сослаться на конструктивные особенности секвентальной КПП, и без лишних комментариев.

Заблуждения и мифы, связанные с секвентальной КПП
1. Секвентальная КПП и роботизированная КПП – одно и то же.
Отнюдь, это не так. Несмотря на схожий принцип работы, в роботизированной КПП как минимум используются электрические сервоприводы для переключения между передачами. А в секвентальной КПП – гидравлические.

2. Секвентальная и автоматическая КПП неразлучны.
Ещё одно заблуждение, вызванное широким распространением автоматических КПП в паре со «спорт-режимом». Однако стоит вспомнить о КПП, используемых в автоспорте, и всё встаёт на свои места. Секвентальная КПП может существовать отдельно от автоматической трансмиссии.

3. Секвентальный механизм устанавливается только на болиды и другие спорткары, вместе с кулачковой коробкой.Секвентальный механизм: Как это работает: секвентальная коробка передач
Несомненно, дуэт этих двух технологий даёт огромное преимущество на трассе, но уже не один десяток лет секвентальная КПП используется на серийных авто, предназначенных для общественных дорог.

Применение секвентальной КПП

В настоящее время секвентальный механизм широко используется и даже успел стать классикой для некоторых мотоциклов и автомобилей. Например, этот тип трансмиссии характерен для старенького мотоцикла Минск – М1М. Но более популярным применением этой технологии прославились модели КПП SMG, устанавливаемые на автомобили BMW с 1996 года.

SMG 1 и SMG 2 длительное время устанавливались на BMW 3 серии.
Минутка ностальгии или как это было:

1-Световой индикатор переключения на повышенную передачу; 2-Индикатор включения передачи и программы;

3-Рычаг управления; 4-Индикатор положения рычага управления (в центральной консоли); 5-Переключатель программ движения (в центральной консоли).Секвентальный механизм: Как это работает: секвентальная коробка передач

Основные компоненты первого поколения SMG изображены на рисунке:

1 ЭБУ системы SMG; 2 ЭБУ системы ABS; 3 Индикатор включенной передачи и программы (в тахометре); 4 ЭБУ индикатора включенной передачи и программы
5 Переключатель программы движения (в центральной консоли); 6 Индикатор положения рычага управления (в центральной консоли); 7 Шестиступенчатая коробка передач SMG с исполнительным узлом; 8 Кронштейн механизма переключения передач SMG; 9 Приводной насос; 10 Исполнительный цилиндр гидропривода сцепления; 11 Сцепление; 12 Гидравлический блок; 13 Бачок главного цилиндра; 14 ЭБУ системы DME*
Сейчас SMG выпускается уже в третьем поколении и с 2005 года устанавливается на BMW E60 M5.

Если вам понравилась статья и вы хотите еще больше узнать об устройстве автомобилей, присоединяйтесь к нашему сообществу TECH. У нас интересно и полезно!

Подпишись на наш Telegram-канал

Секвентальный механизм выбора передач.

Секвентальный механизм: Как это работает: секвентальная коробка передач Секвентальная коробка передач. Секвентальная коробка передач: принцип работы

Автомобильная инженерия за время своего существования шагнула далеко вперед. Инновационные разработки в области трансмиссии – прямое тому доказательство. На автомобилях, существующих сегодня, можно встретить различные по типу КПП. Пример такого механизма – это секвентальная коробка передач.

Что такое секвентальная коробка передач

Широкое распространение новая технология в области трансмиссии получила в 1990-х годах. Такая КПП представляет из себя коробку передач, допускающую переключать скорости только последовательным способом. От известного всем обычного варианта отличается механизмом работы. Последовательное переключение было предусмотрено для тех случаев, когда действие на управленческую систему осуществляется с помощью ноги, как, например, на мотоциклах. Актуальна секвентальная коробка и в случаях со спортивными машинами, когда требуется быстрое переключение скоростей.Секвентальный механизм: Как это работает: секвентальная коробка передач Применение нашлось и в случае наличия у транспортного средства большого количества передач. При таком раскладе традиционное перемещение вызывает неудобство. Это характерно для грузовых автомобилей и тракторов.

Зачастую такие коробки имеют механический тип работы. Но с течением времени и развитием технологий все чаще встречается автоматическая секвентальная коробка передач. Отличие от обычного варианта заключается в том, что есть возможность для выбора между ручным и автоматическим режимом переключения передачи. Какой бы тип работы не использовался, главная особенность – строгая последовательность в переключении. Только вниз или вверх. Водитель либо повышает скорость, либо понижает. Такой подход в системе работы механизма облегчает процесс езды для водителя и увеличивает быстроту переходу от одной скорости к другой. Именно по этой причине автоматическая адаптивная секвентальная система приобрела популярность среди многих автолюбителей. Простота и удобство – две главные составляющие, взаимодополняющие друг друга.Секвентальный механизм: Как это работает: секвентальная коробка передач

Как устроена секвентальная коробка передач

Основанием для секвентальной коробки передач служит все та же привычная механическая трансмиссия. Только в данном случае она была усовершенствована: в конструкции используются прямые зубья шестеренок, вместо распространенных косозубых. Также в основу заложен сервопривод, строящийся на гидравлической системе. Именно благодаря этому скорости переключаются быстро. Схематически изобразить коробку такого типа можно следующим образом:

Внимание! Секвентальная коробка передач не дает возможность водителю осуществлять выбор передач независимо, то есть перескакивать с одной передачи на другую сразу через несколько.

У некоторых автолюбителей возникает отдельный вопрос по поводу секвентальной АКПП, а именно, что это такое. Ответ находится на поверхности: это автоматическая коробка передач, оснащенная только последовательным переключением скоростей (то есть секвентальным). Существенным отличием такого вида является отсутствия педали сцепления у автомобиля и способ переключения скорости (только вниз и вверх).Секвентальный механизм: Как это работает: секвентальная коробка передач

Разбираясь с вопросом устройства данных конструкций, стоит упомянуть и про кулачковую секвентальную коробку передач. В моментах конструирования оба варианта имеют сходные характеристики. Например, в обоих вариантах есть как прямозубые, так и длинные шестеренки. Они влияют на скорость переключения с одной передачи на другую. Определить, какая из этих КПП лучше, очень тяжело. Поэтому специалисты по этой области объединили два данных механизма в один.

Принцип работы секвентальной коробки передач

Как уже упоминалось ранее, для секвентальной коробки передач характерно отсутствие третьей педали – сцепления. Особенно актуальна такая особенность для тех водителей, которые имеют небольшой опыт в обращении с транспортом на дороге. Ведь постоянное отвлечение левой ноги на педаль сцепления для многих является проблемой. Но это далеко не означает, что данный механизм в коробке передач отсутствует. Он есть, только работает иначе. Следовательно, и сама работа секвентальной КПП отличается.Секвентальный механизм: Как это работает: секвентальная коробка передач Управление сцеплением осуществляется за счет специального электронного блока, который, в свою очередь, получает необходимые сигналы от сенсоров. Они определяют силу давления на педаль газа со стороны водителя и контролируют включение конкретной скорости. Коробка передач же получает сигнал от электронного блока, а та в свою очередь с помощью датчиков передает всю необходимую информацию об используемой скорости в прогрессивный блок. Именно тут протекает последний процесс – корректировка скоростного режима на основе следующих показателей:

  • количество оборотов двигателя;
  • работа кондиционера;
  • сила нажатия на педаль, а также ряд других.

Следующий принцип работы секвентального переключения передач заключается в используемых прямозубых шестеренках. Если сравнивать их с косозубыми, которые применяются в МКПП, они выдают более высокий коэффициент полезного действия. Это связано с тем, что первые из них оставляют большие потери во время трения.

И третья особенность работы устройства секвентальной коробки передач характеризуется наличием гидравлического сервопривода.Секвентальный механизм: Как это работает: секвентальная коробка передач Благодаря ему, происходит быстрое переключение с одной передачи на другую.

Важно! Гидравлические сервоприводы и роботизированные КПП – это не одно и то же. Различия заключаются в устройстве прибора: в последнем используется электрический сервопривод.

Более подробную и наглядную информацию о том, как работает секвентальная коробка передач, можно получить из следующего видео:

На каких машинах установлена секвентальная коробка передач

Наибольшее распространение секвентальная коробка передач получила для спортивных машин, участвующих в гонках. Например, такая система работы используется в автомобилях «Формулы-1». Среди моделей транспорта, на которых изначально используется такой вид КПП, выделяются следующие:

  • BMW M3;
  • BMW M5;
  • Mercedes Benz C-Class.

Но секвентальная коробка гораздо распространеннее, чем кажется на первый взгляд. Как упоминалось ранее, встретить устройство такого вида можно на сельскохозяйственном транспорте и на большегрузных автомобилях.Секвентальный механизм: Как это работает: секвентальная коробка передач При конструировании машин с секвентальной коробкой передач в данном случае получило даже большее распространение.

Каждый водитель хочет обеспечить свой автомобиль всем необходимым для комфортной и безопасной езды. Так что некоторые автолюбители устанавливают КПП с последовательным переключением скоростей на свои машины, специально произведя замену старой трансмиссии на новую. Поэтому встретить устройство можно совершенно у разного транспорта. Очень часто секвентальная КПП устанавливается на ВАЗ. Это обеспечивает водителю более облегченное вождение автомобилем. При этом отдается предпочтение именно кулачковой системе. Таким образом, установить данную трансмиссию можно на любой автомобиль, главное, подобрать нужную модель, подходящую по всем параметрам. Вариантов секвентальной коробки передач на ВАЗ существует большое количество. Поэтому проблем в выборе или поиске нужного устройства не возникнет. Тем более, что некоторые предлагают индивидуальную сборку для автомобиля специалистами высокого уровня.Секвентальный механизм: Как это работает: секвентальная коробка передач

Плюсы и минусы секвентальной трансмиссии

Для того чтобы разобраться, что ожидать от трансмиссии, нужно рассмотреть ее положительные и отрицательные стороны. Среди плюсов следует отметить следующие моменты:

  • Высокая скорость и удобство в вопросе переключения передач. Благодаря электронному блоку и гидравлическому механизму, скорость перехода с одной скорости на другую сводится к минимуму. Похвастаться такими показателями не может ни одна другая КПП: ни механическая, ни автоматическая. Ну а главное то, что с использованием секвентальной трансмиссии водителю не придется судорожно стараться найти нужную в данный момент передачу. Особенно это актуально при прохождении крутых поворотов или движению по кольцу, когда трудно удержать автомобиль на правильной траектории.
  • При переключении отсутствует потеря скорости. Такая особенность полюбилась в кругах гонщиков, ну и, конечно, обычные водители тоже высоко оценили наличие такой возможности в трансмиссии.
  • За счет хорошо продуманного устройства секвентальной коробки передач топливо расходуется экономично.Секвентальный механизм: Как это работает: секвентальная коробка передач
  • Переключение скоростей подрулевыми лепестками. Такая технология еще больше упрощает управление автомобилем во время движения.
  • Возможность выбора между автоматическим режимом переключения скоростей и ручным. Конечно, секвентальная трансмиссия может существовать и отдельно от данной функции. Но если все-таки она используется, то это однозначно относится к плюсам.
  • Отсутствует педаль сцепления. Особенно актуально это для начинающих водителей, которым в силу малого опыта сложно справиться с механической КПП.
  • Во время переключения рычага не приходится задумываться о том, какую именно передачу выбрать. Водитель просто либо понижает, либо повышает скорость.

Минусы секвентальной трансмиссии:

  • Чувствительность к высоким нагрузкам и износу. Речь идет не только о спортивных автомобилях, но и простых гражданских машинах.

    Внимание! Каким бы простым не было переключение скоростей на КПП, важно делать это своевременно. Если пренебрегать этим пунктом, то система быстро придет в негодность.Секвентальный механизм: Как это работает: секвентальная коробка передач

  • Высокая стоимость обслуживания. Принцип работы секвентальной коробки заключается в сложном механизме. Чем сложнее механизм, тем дороже его обслуживание.
  • Добиться увеличения мощности машины путем установки секвентальной коробки можно только в том случае, если вовремя переключаться с высших передач на низшие и наоборот. Так что водитель должен хорошо чувствовать свой автомобиль, что является не всегда простой задачей.

Заключение

Секвентальная коробка передач подарила автолюбителям новые возможности. Устройство и принцип работы заслуживают внимание со стороны водителей, а удобство использования приобретает все большее количество потребителей. Благодаря всему перечисленному, КПП такого типа с каждым годом получает все большое распространение. И, учитывая все положительные стороны коробки передач, это не спроста.

Автомобильная индустрия развивается крайне быстро. Каждый день появляются новые технологии, которые переворачивают сознание простых автомобилистов.Секвентальный механизм: Как это работает: секвентальная коробка передач Наглядным примером выступает эволюция трансмиссии.

Первой была изобретена механическая КПП, потом появился автомат и секвентальная коробка передач. Эти три этапа развития заняли приблизительно сто лет. Естественно, что в процессе появлялись ответвления и специфические изделия, которые имели узкий круг применения.

Внимание! В ряде источников секвентальная коробка называется роботизированной.

Секвентальные коробки устанавливаются на гоночных автомобилях, грузовиках и мотоциклах. Их главным отличием от стандартных МКПП является последовательное переключение скоростей. Проще говоря, водитель не тратит время на манипуляции с рычагом. К тому же система сама выбирает оптимальный момент для перехода. Благодаря этому производительность возрастает в несколько раз.

Внимание! Если в гонке будут принимать участие два автомобиля полностью одинаковые по техническим характеристикам, кроме коробки передач, то победит тот, у которого будет секвентальная система.

На видео показано на примере КПП на Хонде как работает коробка передач:

За период эволюции трансмиссии было выпущено множество машин, работающих за счёт автомата и механики.Секвентальный механизм: Как это работает: секвентальная коробка передач Каждая из этих систем имеет свои особенности, которые в той или иной мере отразились на секвентальной коробке.

Механическая коробка установлена практически на всех отечественных автомобилях. К её преимуществам можно причислить высокую надёжность и простоту в обслуживании. К тому же сама масса конструкции намного меньше, чем у АКПП.

Из-за простоты конструкции в производстве механическая коробка намного дешевле, чем АКПП. Также нельзя не отметить высокий КПД. Главным недостатком является высокая сложность эксплуатации для новичка.

В свою очередь, автоматическая коробка проста в управлении и не требует долгих тренировок для быстрого переключения. Также благодаря ей двигатель работает в оптимальном режиме. Из-за этого отсутствуют перегрузки.

Исторические сведения о секвентальной коробке

Секвентальная коробка часто применяется конструкторами компании BMW в своих автомобилях. Первое внедрение произошло в 1996 году. Тогда модель Е36 М3 обзавелась подобной системой.Секвентальный механизм: Как это работает: секвентальная коробка передач

Внимание! Модификация секвентальной коробки называлась SMG 1.

За пять лет водители сумели оценить все преимущества секвентальной коробки. В результате в 2001 году линейка пополняется системой SMG 2. Ею оснащаются автомобили Е46 М3.

Концепт Е46 М3 стал настоящим хитом. Мало того, отзывы автомобилистов были о нём более чем позитивными. Наконец, в 2005 году появляется SMG 3. В ней временные затраты, необходимые на переключение, стали ещё меньше.

Спортивный тип М

Последним инновационным решением считается именно эта секвентальная коробка. Она насчитывает 7 ступеней. До этого ни одному автомобильному концерну не удавалось достичь этой цифры.

Главным достоинством семиступенчатой секвентальной коробки SMG является то, что она позволяет водителю делать выбор между комфортным и спортивным режимом. Конечно же, такие устройства устанавливаются только на мощных автомобилях.

Принцип и устройство

Проще всего сравнить секвентальную коробку с механикой.Секвентальный механизм: Как это работает: секвентальная коробка передач Мало того, база у них практически одинаковая. Главное отличие заключается в шестернях. Здесь вместо косых зубьев идут прямые. В самой же конструкции отсутствует сцепление за ненадобностью.

Внимание! За переключение передач отвечает блок управления.

Само переключение происходит посредством гидравлики. Благодаря всем этим особенностям секвентальная коробка часто устанавливается на гоночные автомобили. Общим знаменателем всех этих модернизаций стало то, что КПП перестала зависеть от вибраций. Точнее, гонщику не нужно тратить время на поиск нужной передачи.

При сравнении обычной КПП и секвентальной коробки необходимо особое внимание уделить моменту переключения тяги. Как только это происходит, тяга привода подтягивается, поворачивается и нажимается. Так происходит в стандартной системе, но не в последовательной.

В секвентальной коробке при переключении одна тяга подтягивается, а другая отвечает за нажатие. Благодаря этому сокращается временной интервал. Это техническое новшество позволило выйти на новый уровень производительности.Секвентальный механизм: Как это работает: секвентальная коробка передач

Что такое секвентальная коробка передач:

Особенности функционирования

Рычаг переключения в машинах, на которых установлена секвентальная коробка, располагается на руле. В некоторых модификациях можно увидеть кнопки. При этом система функционирует в таких режимах:

  • спортивном;
  • стандартном;
  • автоматическом.

В первых двух вариантах используется механика. Неудивительно, что многие начинающие водители предпочитают ездить именно на такой коробке передач. Как только, они достигнут нужного уровня водительского навыка – для них откроется весь спектр возможностей системы.

Достоинства и недостатки

Каждая система имеет уникальные особенности, которые обуславливают её эксплуатацию. Не стала исключением и секвентальная коробка. К её главным достоинствам можно причислить:

  • простоту в управлении,
  • высокую скорость переключения передач,
  • экономичность,
  • несколько режимов работы.Секвентальный механизм: Как это работает: секвентальная коробка передач

Секвентальная коробка передач может быть как механической, так и автоматической. К сожалению, без недостатков обойтись не получилось, и к минусам устройства причисляют:

  • ненадёжную конструкцию;
  • быстрый износ всех деталей;
  • необходимость в постоянном обслуживании.

В качестве примера можно взять обычную гоночную машину с секвентальной коробкой передач. После каждого заезда её перебирают мастера. Это является обязательным условиям для допуска автомобиля к следующей гонке.

Секвентальную коробку можно назвать результатом долгой эволюции трансмиссии. Она сочетает в себе преимущества МКПП и АКПП. Как результат подобная система обеспечивает великолепный разгонный потенциал и минимизирует затраты топлива. Также нельзя не отметить простоту в эксплуатации.

Как показывает ситуация на автомобильных форумах, многих автолюбителей очень интересует вопрос, что такое секвентальная коробка передач. Сразу ответим, что зачастую это механическая коробка (хотя сегодня все чаще встречаются и автоматические варианты), основной особенностью которой является возможность переключать передачи только со строгой поочередностью вверх или вниз.Секвентальный механизм: Как это работает: секвентальная коробка передач

Благодаря этому водителю не приходится думать о том, какую именно передачу активировать – он просто ее повышает или понижает. Но есть у такого типа КПП и другие особенности, поэтому ниже мы более подробно разберемся, что значит секвентальная коробка передач.

Итак, главная особенность секвентальной КПП – это отсутствие возможности свободного выбора передач и перепрыгивания сразу через несколько. Необходимость в такой коробке передач возникла в связи с тем, что у водителя не всегда есть время для того, чтобы выбрать нужную передачу и затормозить для ее переключения. К слову, такие усовершенствованные механические КПП используются не только на автомобилях, но и на мототранспорте, где переключение между передачами зачастую осуществляется ногой.

Если же речь идет о секвентальных коробках, установленных на легковые автомобили, то здесь их будет отличать месторасположение центра управления. Рычаг (а иногда даже более удобные и отзывчивые кнопки) для удобства располагается на руле транспортного средства, при этом он будет обязательно обозначен специальной маркировкой «S», которая указывает на наличие на автомобиле секвентальной коробки передач.Секвентальный механизм: Как это работает: секвентальная коробка передач

Важно! На некоторых автомобилях с секвентальной КПП переключение между передачами может осуществляться не только вручную, но и автоматически.

Такая коробка передач имеет три основных режима работы, которые можно активировать параллельно с основными передачами:

Стандартный механический.

Механический спортивный.

Автоматический , когда водителю вообще не требуется переключать передачи.

Последняя особенность секвентальной КПП заключается в том, что при ее установке на автомобиль полностью отпадает необходимость в установке педали сцепления. Это не только облегчает вождение, но и позволяет эксплуатировать двигатель в стандартных условиях, не зависящих от стиля вождения и опыта водителя.

Где применяются секвентальные АКПП

Секвентальные автоматические коробки передач сегодня можно встретить преимущественно на гоночных автомобилях, так как они являются достаточно дорогим удовольствием, да и по своему предназначению полностью приспособлены под такие типы авто.Секвентальный механизм: Как это работает: секвентальная коробка передач Благодаря такой КПП водитель получает возможность увеличивать скорость и переключаться с передачи на передачу без малейшего замедления, что особенно важно для соревнований. Если же в дополнение такая коробка будет работать на основе гидравлики – это еще больше повысит отзывчивость автомобиля.

Что же касается обычных легковых авто, то устанавливаемые на них секвентальные КПП в народе именуются как «ручной» режим работы автоматической коробки передач. Тем не менее, даже в таком варианте управление автомобилем считается облегченным и не требует от водителя точного попадания в конкретную передачу. Среди серийных автомобилей, на которых были установлены такие коробки, стоит назвать:

BMW M3.

Mercedes Benz C-Class.

Но на самом деле секвентальная КПП является более распространенной, нежели это может показаться на первый взгляд. Как уже говорилось выше, такие коробки устанавливаются на мотоциклы, где обычно есть только две передачи. Что же касается нейтрального положения КПП, то на мотоциклах оно обычно фиксируется между первой и второй передачами.Секвентальный механизм: Как это работает: секвентальная коробка передач Еще больше распространения секвентальная коробка получила при конструировании и создании сельскохозяйственных тракторов, на которых кнопка или рычаг переключения передач могут располагаться как под ногами водителя, так и на рулевом колесе. Встречаются секвентальные коробки передач и на большегрузных автомобилях.

Устройство и принцип работы секвентальной коробки передач

Основа такой коробки передач – привычная механическая трансмиссия, которая была усовершенствована и оснащена прямозубыми шестернями вместо косозубых. Существенным конструктивным отличием секвентальной КПП является и отсутствие педали сцепления, что компенсируется благодаря установке электронного блока управления (он же в автоматическом режиме работы КПП и отвечает за переключение передач).

Переключение передач благодаря гидравлическому механизму получается максимально быстрым и не требует точности, как на обычных КПП. Все, что требуется от водителя во время управления автомобилем с такой коробкой, это оценка сложности дороги и нагрузки, которая передается на автомобильный двигатель.Секвентальный механизм: Как это работает: секвентальная коробка передач Чтобы облегчить ему работу, стоит постепенно повышать передачи. Если же требуется маневрирование на низкой скорости, передачи понижаются с учетом поведения автомобиля и отзыва двигателя.

Секвентальные или кулачковые КПП?

Стоит также упомянуть о существовании кулачковых коробок передач, которые в своих конструкционных особенностях имеют много общего с секвентальными. В частности, их объединяет наличие прямозубых и длинных шестерен с торцевыми выступами (за которые и цепляются кулачки), благодаря которым такие коробки передач позволяют максимально быстро переключаться с одной передачи на другую, не снижая скорости движения.

Однако определить, какая КПП лучше, практически невозможно. По этой причине конструкторы попросту объединили их в один механизм, который уже сегодня используется на гоночных болидах, которые принимают участие в «Формуле 1». Так что кулачковую коробку передач правильнее называть неплохой альтернативой секвентальной КПП.

Преимущества использования такой коробки на авто и других видах транспорта

Мы уже разобрались с тем, что такое секвентальная КПП.Секвентальный механизм: Как это работает: секвентальная коробка передач Однако давайте же подведем итог касательно всех достоинств использования такой коробки передач на разных видах транспорта:

1. Нет педали сцепления. Данная особенность больше всего актуальна для тех, кто только осваивает вождение и может путать педали. Помимо этого, отсутствие сцепления облегчает управление автомобилем в сложных условиях гонок, когда водителю важно концентрироваться не на силе натиска на педаль, а на трассе.

2. Передачи переключаются максимально быстро. В этом с секвентальными КПП не сможет сравниться ни один другой тип коробок передач. К этому достоинству также стоит отнести то, что при нажатии рычага передач вверх или вниз водителю не приходится задумываться над тем, в какую передачу перевести рычаг. Он просто повышает их или понижает.

3. Автомобильные конструкторы также отмечают, что отсутствие замедления во время перехода с одной передачи на другую также положительно отражается на экономии топлива.

4. Работа на двух режимах – автоматике и механике.Секвентальный механизм: Как это работает: секвентальная коробка передач Несмотря на то, что конструкторы и так упростили процесс управления автомобилем с механической секвентальной коробкой передач, перенеся кнопки на руль, в некоторых ситуациях водитель вообще может отказаться от управления трансмиссией и доверить эту задачу исключительно электронному блоку управления.

Недостатки секвентальной КПП

Секвентальная коробка передач не лишена и целого ряда недостатков, и связаны они в основном с конструкцией такой КПП. Первое, о чем необходимо подумать при покупке автомобиля с такой коробкой передач, – это ускоренный износ трансмиссии. Не стоит забывать, что в экстремальных и слишком суровых условиях эксплуатации гидравлический механизм быстро изнашивается и может выйти из строя в очень неподходящий момент. По этой причине гоночные болиды приходится полностью перебирать и менять запчасти буквально после каждой гонки.

Выше также упоминалось, что, благодаря установке секвентальных КПП на серийные автомобили, существенно увеличивается их мощность.Секвентальный механизм: Как это работает: секвентальная коробка передач Но есть здесь и свой подводный камень: добиться подобного можно только в том случае, если правильно и вовремя переключаться с низших на высшие передачи и обратно. Если же водитель плохо чувствует своей автомобиль и его потребности, это опять же может привести к выходу из строя всех элементов гидравлической трансмиссии. При этом восстановление такой системы обойдется автовладельцу очень дорого.

В связи с этим садиться за руль автомобиль с секвентальной КПП рекомендуется только водителям со стажем, которые отъездили свое и на механической коробке, и на автомате. Отсутствие опыта в вождении автомобиля может негативно отразиться на его состоянии.

В переводе с английского языка секвентальная переводится как последовательность. Стало быть, секвентальная коробка передач означает только последовательное переключение скоростей. Этот принцип работы заключается в воздействии на управление ногой (примером может служить мотоцикл), для быстрого переключения - спортивный автомобиль; в случае большого количества передач, выбор которых с помощью переключения рычага не очень удобен – это трактор, грузовые автомобили.Секвентальный механизм: Как это работает: секвентальная коробка передач Чаще всего происходит переключение за счет смещения органа управления от нейтрального положения. В то время как принцип работы классической КПП заключается в самостоятельном выборе передачи.

Секвентальная коробка передач

Развитие секвентальной коробки

Каких только коробок трансмиссии не было создано за всю историю автомобилестроения. Вот и создание секвентальной трансмиссии не прошло мимо. Чаще всего мы слышим, механическая коробка передач или автоматическая, но стоит понять, что этим дело не ограничивается, так как существует еще много вариантов для переключения скоростей.

Между этими КПП есть разница, которую стоит понять. Взять, к примеру, обычную машину с механической коробкой. В этом случае водитель самостоятельно делает выбор передачи скорости. То есть, разогнавшись, у него есть возможность переключиться с третьей скорости на пятую или же, наоборот – при торможении, перейти с пятой на третью. Этот механизм еще можно назвать поисковым, так как включение передачи скоростей полностью зависит от водителя.Секвентальный механизм: Как это работает: секвентальная коробка передач Еще раз хочется отметить, что передача может быть любой, самое главное, чтобы было соответствие режиму движения и нагрузкам на автомобиль.

Но то, что касается обладателей секвентальной коробки передач – они такой возможности свободного переключения лишены. Это действие может осуществляться только на одно значение либо вверх, либо вниз. То есть, переключение будет выглядеть следующим образом: два-три-четыре или семь-шесть-пять, что характерно для мотоциклов BMW и для мотоциклов М1-М. Другого переключения на такой коробке добиться невозможно.

Спортивный тип М

Сравнительно недавно была разработана семиступенчатая секвентальная коробка передач. Это первая модель 7-ступенчатой КПП SMG в мировом автомобилестроении. За счет своего сверхмалого времени для переключения скоростей в сочетании с мощностью силового агрегата она позволяет своему владельцу делать собственный выбор спортивного или комфортного стиля езды.

Исторические сведения

Такая коробка уже сумела стать традиционной для автомобилей BMW.Секвентальный механизм: Как это работает: секвентальная коробка передач Уже в 1996 году SMG 1 начала устанавливаться на модели Е36 М3. В 2001 году оснащение моделей Е46 М3 осуществлялось SMG 2. А уже в 2005 на модели Е60 М5 прошла установка коробки передач SMG 3. Что стало отличать эту коробку передач от предыдущих моделей, так это заметное сокращение временной затраты на переключение передачи.

Семиступенчатая секвентальная коробка передач для BMW

Эта модель трансмиссии третьего поколения оборудована индивидуальными тягами привода переключения, что позволило добиться ощутимого ослабления тяги в момент переключения. Как это могло получиться?

Как происходит процесс переключения

Сравнивая обычную коробку передач с секвентальной SMG 3, обращаешь внимание, что в обычной КПП в момент переключения тяга привода переключения передач подтягивается, после чего поворачивается и нажимается. В сравниваемом устройстве все происходит по-другому. Здесь получается так, что одна тяга в момент переключения подтягивается, а другая – нажимается.Секвентальный механизм: Как это работает: секвентальная коробка передач То есть, в момент подтягивания тяги переключения первой передачи тяга второй передачи нажимается. Это дало возможность значительно сократить временной интервал переключения в сравнении с обычной коробкой передач.

Работа секвентальной коробки передач

Итак, знакомая всем механическая коробка передач эволюционировала и позволила прийти к новому типу трансмиссии, которые должны упрощать управление водителем автомобилем. И таким важным изобретением стала автоматическая коробка передач, которая модернизировалась и совершенствовалась. И сегодня, она дает возможность водителю, вообще не задумываться о том какую и когда переключать скорость. Но и механическое оборудование никто не отбросил в сторону. Она также продолжала развиваться и вот результатом этих изысканий стала секвентальная коробка передач. Результатом такой трансмиссии стало включение скорости в строгой последовательности.

Принцип работы

Этот тип КПП разрабатывался на базе механики. Основное отличие этой трансмиссии заключается в том, что вместо косозубых здесь установлены шестерни с прямыми зубами, а также отсутствует педаль сцепления (эту роль на себя принял электронный блок управления).Секвентальный механизм: Как это работает: секвентальная коробка передач Переключение передач в коробке осуществляется с помощью гидравлического механизма, что и приводит к значительному сокращению переключения скоростей.

Гоночный болид с секвентальной коробкой передач

Особое распространение установка коробки передач с секвентальным механизмом нашла в гоночных болидах. Поняв, что такая секвентальная коробка передач будет особенно удобна водителям-гонщикам, значит, необходимо было выполнить такую установку на гоночные автокары. Это объясняется тем, что высокая скорость способствует сильной вибрации авто и в этом случае водителю сложно попасть в требуемую передачу, в то время как секвентальная КПП в состоянии справиться с такой задачей.

Достоинства и недостатки

Такая секвентальная трансмиссия имеет свои характерные особенности. Достоинствами этого агрегата можно выделить отсутствие педали сцепления, что особенно удобно для начинающих водителей. Следующее положительное качество, характеризующее эту модель устройства – скорость переключения скоростей, которая превышает классические автоматические и механические трансмиссии.Секвентальный механизм: Как это работает: секвентальная коробка передач Другое достоинство – экономичность, которая происходит за счет сокращенного переключения скоростей. Также предлагается возможность выбора режима – механика или автомат.

Недостатком этого устройства можно назвать его конструкцию. То есть, этот механизм не является устойчивым к износу и при большой нагрузке быстро выходит из строя. В качестве примера можно привести гоночные автокары. После каждого заезда, секвентальная коробка передач чаще всего подвергается обязательной переборке. В принципе если не соблюдать эксплуатационные правила, то и на серийных авто секветнальная КПП может выйти из строя, а это значит, повлечет за собой дорогостоящий ремонт.

Как это работает

Все мы знаем, что такое автоматическая или адаптивная и механическая коробка. В первом случае система все делает сама, опираясь на текущие нагрузки и скорость движения машины. То есть адаптируется под машину. В случае с механикой нужно самостоятельно переключать передачи.

В случае с секвентальной КПП важно заметить, что она отличается способностью переключать скорости последовательно.Секвентальный механизм: Как это работает: секвентальная коробка передач Грубо говоря, если на механике можно «перепрыгнуть» с 5 на 3 скорость, то секвенталка этого сделать не позволит. Есть последовательность переключений, нарушать которую СКПП не может.

Изначально СКПП создавались для гоночных авто, болидов Формулы 1 и машин, которые принимают участие в профессиональных гонках. Но идея понравилась автопроизводителям, из-за чего многие внедряют такие коробки в гражданские машины. И это радует.

Ошибка многих в том, что они считают СКПП аналогом АКПП. На деле источником вдохновения для создания секвенталки служила механика. Строили ее на базе МКПП.

Рассмотрим принцип работы этого устройства и ключевые особенности СКПП. Так вы поймете, что это и как работает вся система секвенталки.

  1. У СКПП нет педали сцепления. Это приятно радует тех, кто не имеет большого опыта вождения. Управление упрощается, не нужно постоянно выжимать сцепление. За него отвечает электроника, получающая сигналы от сенсоров при считывании нажатий на педаль газа и включении передачи.Секвентальный механизм: Как это работает: секвентальная коробка передач Коробка, получив от блока управления команду, датчиками передает сигнал о скорости, на которой движется сейчас машина. Прогрессивный блок - это последний этап, где происходит корректировка параметров движения. Он изучает буквально все, от оборотов мотора до включенного или выключенного кондиционера.
  2. В конструкции секвенталки используют шестерни прямозубного типа. Их КПД выше по сравнению с косозубыми конструкциями, стоящими на механике. Последние обладают внушительными потерями при трении. Хотя прямозубки передают меньший крутящий момент. Чтобы компенсировать это, шестерни ставят большого размера.
  3. Сервопривод гидравлического типа. Последняя отличительная черта. Такое устройство осуществляет переключение между скоростями. Сейчас многие уверены, что гидросервопривод - это достояние роботизированных коробок. Распространенная ошибка, ведь там используют электрические девайсы.

Работает секвенталка предельно просто. Вы можете использовать непосредственно рычаг КПП или подрулевые лепестки.Секвентальный механизм: Как это работает: секвентальная коробка передач Это заимствованная из гоночных болидов технология, которая очень хорошо прижилась в народе. Особенно в компании БМВ и Тойота.

Если взглянуть на коробку, на ней вы увидите рычаг, который перемещается вверх и вниз. Плюс есть дополнительные режимы, в зависимости от автопроизводителя.

Нажатие вверх (там где стоит +) поднимает на одну передачу вверх, а движение в сторону с «минусом» позволяет опустить коробку на 1 передачу.

Вот что значит комфортно и удобно. Не удивительно, что многие стремятся поставить СКПП себе на машину. Некоторые умельцы умудряются впихнуть коробку на ВАЗ 2108 и 2107. Есть и заводские модели, идущие в паре с секвентальной.

Но скажу честно. Это актуально для спортивных машин, от которых ждешь скорости и минимальных потерь при разгоне. Для автомобиля, под капотом которого менее 150-200 лошадиных сил, и которые служат для семейных поездок, в СКПП нет никакой потребности.

Принцип и устройство

Проще всего сравнить секвентальную коробку с механикой.Секвентальный механизм: Как это работает: секвентальная коробка передач Мало того, база у них практически одинаковая. Главное отличие заключается в шестернях. Здесь вместо косых зубьев идут прямые. В самой же конструкции отсутствует сцепление за ненадобностью.

Внимание! За переключение передач отвечает блок управления.

Само переключение происходит посредством гидравлики. Благодаря всем этим особенностям секвентальная коробка часто устанавливается на гоночные автомобили. Общим знаменателем всех этих модернизаций стало то, что КПП перестала зависеть от вибраций. Точнее, гонщику не нужно тратить время на поиск нужной передачи.

При сравнении обычной КПП и секвентальной коробки необходимо особое внимание уделить моменту переключения тяги. Как только это происходит, тяга привода подтягивается, поворачивается и нажимается. Так происходит в стандартной системе, но не в последовательной.

Это интересно: Топливный фильтр Mazda 3

В секвентальной коробке при переключении одна тяга подтягивается, а другая отвечает за нажатие. Благодаря этому сокращается временной интервал.Секвентальный механизм: Как это работает: секвентальная коробка передач Это техническое новшество позволило выйти на новый уровень производительности.

Что такое секвентальная коробка передач:

Особенности функционирования

Рычаг переключения в машинах, на которых установлена секвентальная коробка, располагается на руле. В некоторых модификациях можно увидеть кнопки. При этом система функционирует в таких режимах:

  • спортивном;
  • стандартном;
  • автоматическом.

В первых двух вариантах используется механика. Неудивительно, что многие начинающие водители предпочитают ездить именно на такой коробке передач. Как только, они достигнут нужного уровня водительского навыка – для них откроется весь спектр возможностей системы.

Секвентальная коробка передач

Секвентальная коробка передач автомобиля

Отличие секвентальной КПП от стандартной механической заключается в том, что такие коробки бывают только двухвальными, все шестеренки в них только прямозубые и нет никаких синхронизаторов.Секвентальный механизм: Как это работает: секвентальная коробка передач Их роль выполняют подвижные муфты, которые и включают передачи. Помимо конструктивных различий существуют еще и эксплуатационные: в механической КПП передача включается после выключения сцепления (опытные водители переключают передачи подбирая необходимые обороты и без сцепления), а в секвентальной же коробке при езде по прямой или в гору передачи переключать можно без выключения сцепления, что позволяет делать их конструкция. Также к преимуществам секвентальной КПП можно отнести:

  • меньшие габаритные размеры корпуса коробки;
  • возможность передавать больший крутящий момент;
  • выдерживает переменные нагрузки;
  • скорость переключения составляет 0,1-0,2 сек;
  • при смене передач не падают обороты двигателя;
  • не теряется мощность в трансмиссии, которая вызвана нагревом деталей;
  • простота обслуживания.

В секвентальной коробке при езде по прямой или в гору передачи переключать можно без выключения сцепления.

Стоит отметить, что принцип работы секвентальной КПП основывается только на последовательной смене передач как в обратном, так и в прямом порядке.Секвентальный механизм: Как это работает: секвентальная коробка передач Таким образом повышение передач осуществляется ступенчато, т.е. нельзя перескочить, например со второй на четвертую, потому что этому будет препятствовать конструкция коробки.

Также одной из особенностей устройства секвентальной коробки передач служит то, что первичный и вторичный вал в такой трансмиссии наборный, т.е. состоит из нескольких промежуточных взаимосвязанных между собой элементов. Такая особенность позволяет механикам оперативно менять шестеренки на спортивных автомобилях прямо во время гонок, чтобы подобрать оптимальные передаточные числовые соотношения зубчатых колес под текущие условия состязаний.

Плюсы и минусы

Теперь вы знаете, что такое СКПП и что значит секвентальность. Нет? Да это же последовательность в переводе. Тут вообще все становится на свои места.

Посмотрев видео и изучив особенности такой коробки, возникает вопрос - стоит ли брать машину с этой КПП. Немного вам помогу, рассказав про сильные и слабые стороны секвенталок.

Начнем с преимуществ.Секвентальный механизм: Как это работает: секвентальная коробка передач

  • Высокая скорость переключения. Автомат живет своей жизнью, потому иногда он откровенно тупит и не делает то, чего ждешь. Механику переключать сложнее. Оптимальную скорость выдает СКПП. Электронный блок и гидравлика обеспечивают минимальные затраты по времени на переход с передачи на передачу. Для профессионального автоспорта это крайне важно.
  • Удобство. Выжимать педаль сцепления, попадать в передачу, да еще и на скорости при плохой дороге - удовольствие сомнительное. СКПП гарантирует точность и комфорт при переключениях. Это бесспорный факт.

  • Отсутствие потери скорости. Да, секвентальная коробка переключает быстро, провалов между переходами нет, отсюда и размеренная езда, быстрый набор скорости.
  • Расход топлива. Все предыдущие пункты влияют на появление этого преимущества. СКПП бережно расходует топливо и помогает экономить.
  • Подрулевые лепестки. Дополнительная опция, позволяющая почувствовать себя гонщиком. Удобно и необычно.Секвентальный механизм: Как это работает: секвентальная коробка передач
  • Два режима. Но тут внесу поправку. Это у АКПП есть функция перехода на ручной режим с помощью секвентальной системы. Так что это скорее плюс автоматов.

Но не все так идеально. У СКПП есть два существенных недостатка.

  • Низкая устойчивость к нагрузкам и износам. Система сложная, состоит из множества элементов и требует аккуратного обращения. Нельзя просто наобум щелкать лепестками или рычагом. Следует правильно выбирать момент для переключения. Если этого не делать, механизмы быстро выйдут из строя. Не зря СКПП стоят на машинах профессиональных гонщиков.
  • Цена. Она высока на саму машину с СКПП и на обслуживание такой коробки. Хотя если у вас есть деньги на авто с секвенталкой, стоимость ее ремонта не должна быть проблемой.

Исторические сведения о секвентальной коробке

Секвентальная коробка часто применяется конструкторами компании BMW в своих автомобилях. Первое внедрение произошло в 1996 году. Тогда модель Е36 М3 обзавелась подобной системой.Секвентальный механизм: Как это работает: секвентальная коробка передач

Внимание! Модификация секвентальной коробки называлась SMG 1.

За пять лет водители сумели оценить все преимущества секвентальной коробки. В результате в 2001 году линейка пополняется системой SMG 2. Ею оснащаются автомобили Е46 М3.

Концепт Е46 М3 стал настоящим хитом. Мало того, отзывы автомобилистов были о нём более чем позитивными. Наконец, в 2005 году появляется SMG 3. В ней временные затраты, необходимые на переключение, стали ещё меньше.

Секвентальная коробка передач (от англ. sequence - последовательность, англ. sequential manual gearbox ) - коробка передач, допускающая только последовательное их переключение. От коробки передач классического типа отличается принципом работы механизма переключения передач. Последовательное переключение удобно в тех случаях, когда воздействие на орган управления осуществляется ногой (например, на мотоцикле), когда требуется быстрое переключение (например, на спортивном автомобиле) или при наличии большого количества передач, выбор которых традиционным способом перемещения рычага неудобен (на тракторах, грузовых автомобилях).Секвентальный механизм: Как это работает: секвентальная коробка передач Обычно переключение осуществляется смещением органа управления от нейтрального положения.

Механизм переключения может быть как прямого действия, например на мотоциклах, так и с сервоприводом (автоматизированным или неавтоматизированным).

На мотоциклах принята следующая схема управления коробкой передач:

  • перемещение рычага вверх - переход на передачу вверх;
  • перемещение рычага вниз - переход на передачу вниз;
  • нейтраль (выключение передачи) обычно находится между первой и второй передачами, причём включается не полным ходом рычага.

На автомобилях обычно управляется рычагом, одновременно выполняющим роль селектора режимов и переключения передач, но может управляться кнопками, расположенными на рулевом колесе. На тракторах управление секвентальной КПП может быть дублированным: рычагом и педалью.

Обозначается секвентальный режим латинской буквой "S".

В основу секвентальной коробки передач положена обычная механическая трансмиссия, только чуть-чуть модернизирована и "усложнена".Секвентальный механизм: Как это работает: секвентальная коробка передач Процесс переключения передач происходит с использованием гидравлики, это главное отличие этой коробки от роботизированной. Также переключения происходят последовательно, то есть не проскакивая скорости.

Использование гидравлики позволяет сократить время переключения передач секвентальной коробки до 150 миллисекунд. Так же позволяет уберечь коробку от "грубого" обращения с ней.

Рычаги переключения скоростей расположены обычно на руле. Существует как автоматическое переключение, так и ручное. Обычно это три режима:

1) стандартный механический;

2) спортивная механическая;

3) автоматическое переключение передач секвентальной коробкой без вмешательства водителя.

Например в моделях M 3 марки BMW скорость переключения передач снизилась до 80 миллисекунд. Это достигнуто благодаря использованию аэрокосмических технологий, технологий применяемых в "Формуле-1". Также секвентальные коробки имеют множество режимов, облегчающих жизнь водителю. Это режим подъёма в гору, снежная трасса и многие другие.Секвентальный механизм: Как это работает: секвентальная коробка передач

В обычных коробках в процессе переключения скоростей тяга привода подтягивается, поворачивается, нажимается, и "выбирается" нужная нам передача. В секвентальной же коробке создаётся давление в гидравлическом узле и наполняется гидроаккумулятор. Затем посредством работы гидравлической системы происходит процесс переключения передач.

К примеру, в секвентальной КПП. Переключать передачи можно двумя способами: с помощью рулевых переключателей, или используя рычаг переключения передач в центральной консоли, позволяющий мгновенно переходить с одной передачи на другую, не снижая скорость или мощность двигателя и не прибегая к помощи сцепления. Система Launch Control, использующая оптимальный диапазон оборотов для автоматического переключения передач, обеспечивает максимально быстрый разгон. При этом ногу с педали акселератора убирать не надо. Трогаться с места допустимо и на второй передаче (например, на льду).

Секвентальная коробка передач основана на обычной механической коробке передач.Секвентальный механизм: Как это работает: секвентальная коробка передач Среди важнейших инноваций - использование двух переключателей, расположенных на рулевом колесе, кроме обычного рычага селектора. Водитель может переключать передачи, не снимая руки с руля. Переключение передач строго последовательно – ни одну нельзя пропустить. Секвентальная коробка уменьшает риск неаккуратного переключения передач и перегрузку зубцов передачи.

Для составления публикации была использована информация с Википедии , bmw.ru , autoclub36.ru и cars-area.ru .

Как мы знаем, эволюция «коробок» переключения передач в автомобилях привела мир к изобретению автоматической трансмиссии, однако инженерный ум не стоял на месте, и механическую трансмиссию тоже не «убрали в шкаф» – инженеры модернизировали механизм переключения передач, и создали вариант секвентальной коробки. В ней передачи переключались только последовательно вверх или вниз.

Sequence - последовательность

Принцип работы данной КП прост как и в обычной механике, однако отличается она от обыкновенной, привычной нам трансмиссии, прямозубыми шестернями, которые установлены вместо косозубых, а роль педали сцепления выполняет гидравлический механизм.Секвентальный механизм: Как это работает: секвентальная коробка передач Этот механизм позволяет сокращать время переключения передач, что так важно в автомобильном спорте. Кроме скорости переключения такая коробка позволяет чётко переключать передачи в момент, когда автомобиль подвержен вибрациям и использование привычной коробки передач затруднено. Также одной из особенностей устройства секвентальной коробки передач служит то, что первичный и вторичный вал в такой трансмиссии наборный, то есть состоит из нескольких промежуточных взаимосвязанных между собой элементов. Такая особенность позволяет механикам оперативно менять шестеренки на спортивных автомобилях прямо во время гонок, чтобы подобрать оптимальные передаточные числовые соотношения зубчатых колес под текущие условия состязаний. Однако не только спортивные болиды могут похвастаться подобной «коробкой» – и на вашем «автомате» можно сдвинуть положение селектора в бок и получить секвентальную коробку передач. Её вы обычно называете «ручным» режимом.

У такой трансмиссии есть 3 возможных варианта работы в автомобиле:

  • обычный механический
  • механический спортивный
  • полностью автоматический
А рычаг селектора может находиться на рулевом колесе, в виде кнопки со специальной маркировкой.Секвентальный механизм: Как это работает: секвентальная коробка передач

И как с этим жить?

Как мы знаем, любая коробка передач может вызывать множество споров, иметь союзников и противников. Не обошло это стороной и секвентальную трансмиссию. Но давайте по порядку: если вы решились на автомобиль с подобной трансмиссией - вас обрадует отсутствие педали сцепления и скорость работы «коробки», помимо этого, как и любая «механика» секвентальная трансмиссия будет экономить вам топливо в сравнении с АКП. Второй несомненный плюс заключается в возможности ездить в нескольких режимах, про которые мы рассказали выше. Дополняет наш ряд плюсов переключение передач непосредственно на руле, при наличии лепестков.

Однако как мы все понимаем, не бывает идеальных механизмов, поэтому даже у такой, с виду идеальной коробки, бывают проблемы. Поскольку сцепление, как таковое, отсутствует - страдает гидравлический механизм переключения, ведь он изнашивается больше обычного из-за повышенных нагрузок. Посмотрите на соревнования в автоспорте, к примеру по дрифту, где практически после пары-тройки заездов механики уже готовы ремонтировать коробку передач.Секвентальный механизм: Как это работает: секвентальная коробка передач Серийные автомобили, конечно, позволяют вам наслаждаться ездой чуть дольше, ведь если вы не играете в спортивного водителя на дороге, ваша коробка передач будет жить долго и счастливо, но если вы решите поиграть в гонщика – готовьтесь к тому, что ремонтировать такие коробки передач очень и очень накладно, а заменить на новую ещё дороже.

Мифы и легенды

Вроде с технической и финансовой частями попытались разобраться, а теперь давайте пройдёмся по стереотипам, связанным с такими коробками:

  • «Секвенталка это робот.» А вот и нет! Пусть принципы работы у таких трансмиссий схожи, однако у роботизированной трансмисии сервоприводы электрические, против гидравлических у секвентальной.
  • «Секвенталка и автомат неразлучны.» - снова не угадали. Если бы не широкое распространение спортивных режимов на современных автоматических трансмиссиях, вы бы и не узнали о секвентальной коробке. Поэтому в гражданских версиях возможна смесь вариантов, а спортивных автомобилей с автоматический трансмиссией я не встречал.Секвентальный механизм: Как это работает: секвентальная коробка передач
  • «Только для спорткаров, только для болидов, только вместе с кулачковой КП.» – нет, безусловно если их использовать в паре, ваше преимущество будет космическим, но и на серийных автомобилях такие трансмиссии превосходно существуют не одно десятилетие.

Не отпугнуло?

Если перечисление всех плюсов и минусов не отпугнуло в желании завладеть таким типом трансмиссии – могу сказать только одно. Это наиболее перспективный вид «механики», который актуален для мощных автомобилей, а если такой коробкой ещё и заниматься, дорабатывать ее и совершенствовать – мы сможем вернуться в тот идеальный мир, в котором автомобилям на механической трансмиссии есть место в повседневном использовании, и в большинстве моделей у производителей.

Кулачковая коробка передач (кпп)

Для достижения высоких динамических и скоростных характеристик автомобиля мало улучшить мотор. Чтобы реализовать его возросшие возможности, нужна и соответствующая коробка передач. Такая коробка должна обладать высокой скоростью переключения, другими передаточными числами, способностью выдерживать высокие нагрузки.Секвентальный механизм: Как это работает: секвентальная коробка передач Этим требованиям в полной мере отвечают кулачковые КПП, применяемые на всех спортивных автомобилях.

Содержание статьи

Конструкция кулачковой КПП

Секвентальный механизм переключенияПятиступенчатый кулачковый рядВнутренний механизм кулачковой КППШестерня и муфта кулачковой КПП

На первый взгляд может показаться странным, но для того, чтобы изготовить «гоночную» коробку, потребовалось не усложнить, а, наоборот, упростить конструкцию обычной механической КПП. В первую очередь избавились от синхронизаторов. Элемент, облегчающий переключение передач, делает это, по спортивным меркам, недопустимо долго. Кроме того, он слишком хрупок.

Вместо синхронизаторов с множеством мелких зубьев зацепление шестерен и муфт обеспечивают имеющиеся на их торцах выступы – кулачки. Количество кулачков невелико – не более 7 на каждой шестерне (муфте), поэтому они входят в зацепление с большим «запасом» по ширине. При их соприкосновении раздается хорошо различимое «клацанье». Кулачки воспринимают всю ударную нагрузку, защищая зубья шестерен от поломок при жестких переключениях.Секвентальный механизм: Как это работает: секвентальная коробка передач

Сами шестерни по размеру значительно больше, чем в обычной КПП. Кроме того, применяются не косозубые, а прямозубые шестерни. Чем это вызвано? Прямозубые шестерни имеют меньше потерь на трение (что повышает КПД), проще в изготовлении и не создают осевых нагрузок на валы КПП. Однако они способны передавать меньший крутящий момент по сравнению с косозубыми шестернями такого же размера. Поэтому их и изготавливают большего диаметра.

Для более эффективного разгона в «спортивных» коробках применяют сближенные передаточные числа КПП и более длинную первую передачу. В стандартных коробках первая передача выбирается «короткой» из расчета движения в тяжелых дорожных условиях, а не для динамичного разгона.

Механизм переключения у кулачковых КПП бывает поисковый или секвентальный (последовательный). Первый практически ничем не отличается от стандартного. Секвентальный позволяет переключать передачи только последовательно, ступень за ступенью, вверх или вниз. В гоночных условиях он намного удобнее и быстрее поискового.Секвентальный механизм: Как это работает: секвентальная коробка передач Секвентальный механизм в управлении проще, но технически значительно сложнее.

Для переключения достаточно сдвинуть рычаг вперед или назад, а номер включенной в данный момент передачи отображается на дисплее. Вилки передач двигает специальный вал, имеющий борозды волнообразной формы. С каждым толчком рычага он прокручивается на определённый градус, при этом вилка, продвигаясь по борозде, включает передачу или «нейтралку». Другой вариант – при «толчке» рычага происходит поворот специальной оси с кулачками на определенный угол. Один из кулачков сдвигает вилку и выключает передачу, а другой сдвигает другую вилку, которая вводит в зацепление муфту с шестерней следующей передачи.

Рычаг переключения делают максимально длинным, чтобы приблизить его к рулю – это позволяет водителю дополнительно сократить время на переключение. Рычаг снабжают механической блокировкой, предохраняющей от случайного включения нейтрали или заднего хода. Для ее отключения необходимо нажать кнопку или скобу.Секвентальный механизм: Как это работает: секвентальная коробка передач Добиться еще большего выигрыша времени позволяют подрулевые переключатели и гидропривод включения передач. При таком варианте время переключения сокращается до 150 миллисекунд и, кроме того, «гидравлика» делает это более «нежно», продлевая жизнь шестерням.

На высшей ступени в иерархии «секвенталок» находятся полуавтоматические КПП. Задача водителя – только вовремя задать момент перехода на другую передачу, а самим процессом переключения управляет автоматика – включает и выключает сцепление, добавляет или сбрасывает «газ» и двигает нужные вилки.

Особенности вождения автомобиля с кулачковой КПП

В автомобилях с кулачковой КПП педаль сцепления используется в ходе гонки только для трогания с места. При езде переключение передач производится либо вообще без выжима сцепления, либо с неполным выжимом. Пилот при этом лишь немного отпускает педаль «газа». Вообще, спортсмены пользуются педалями совершенно по-другому, чем обычные водители: правая нога у них постоянно управляет акселератором, а левая – попеременно сцеплением или тормозами.Секвентальный механизм: Как это работает: секвентальная коробка передач

В автомобилях с секвентальной КПП, оборудованной гидроприводом переключения, и полуавтоматической КПП, педали сцепления вообще нет. Водителю нужно только выбрать передачу, толкнув рычаг (или подрулевой лепесток) и в нужный момент резко нажать или отпустить педаль акселератора – таким образом автоматике подается команда на переключение. Если же водитель не выбирал передачу, то рост оборотов двигателя не приводит к автоматическому переключению вверх. Автоматически включается только первая передача – для трогания с места достаточно нажать на акселератор.

Преимущества и недостатки кулачковой КПП

Основное преимущество кулачковых КПП, ради чего, собственно, они и создавались – высокая скорость переключения передач (в три раза быстрее, чем в обычной МКПП). Из этого следует и еще одно преимущество – обороты двигателя за время переключения не успевают упасть, следовательно, разгон происходит намного интенсивнее. Это особенно важно для моторов с турбонаддувом, рабочий диапазон у которых сравнительно узок.Секвентальный механизм: Как это работает: секвентальная коробка передач

Кулачковые КПП выдерживают значительно большие нагрузки по сравнению с синхронизированными, имеют меньший вес и способны передавать намного больший крутящий момент. Механизм переключения работает четко, не допуская «вылета» передач.

К недостаткам кулачковых КПП относят небольшой ресурс (как правило, после каждой гонки ее перебирают), высокую цену и повышенную шумность при работе. Дотошный читатель, возможно, спросит: «А как же сочетается сказанное о высокой надежности и маленьком ресурсе?» Дело в том, что стандартная коробка в условиях гонки не выдержала бы и половины дистанции, и в этом смысле кулачковая КПП намного надежнее. А вот ресурс, в обычном понимании, когда узлы служат без ремонта годами, у кулачковой КПП существенно меньше. Жесткие переключения приводят к быстрому износу кулачков и загрязнению масла металлическими частицами.

Использование кулачковой КПП в тюнинге

У начинающих «тюнингеров» часто возникает вопрос: можно ли кулачковую коробку установить на обычный автомобиль? Ответ однозначный – нет.Секвентальный механизм: Как это работает: секвентальная коробка передач То есть, с технической точки зрения это возможно, но вот с практической – не имеет смысла.

При обычной (не гоночной) езде для продления срока службы коробки необходимо будет пользоваться педалью сцепления при переключениях. А так как кулачковая коробка не имеет синхронизаторов, то переключаться нужно с перегазовкой при переходе на нижнюю передачу, и с двойным выжимом сцепления при переходе на высшую. Это требует тренировки и чувства двигателя – наверняка сломаете зубья не одной шестерне, пока не приобретете прочные навыки. Но даже и имея их, такая езда будет весьма утомительной, особенно в городе.

Еще больше неудобств доставляет в обычных дорожных условиях КПП с секвентальным механизмом переключения. Ведь чтобы переключиться, например, на несколько ступеней вниз, нужно будет соответственно сделать несколько перегазовок. А установка полуавтоматической секвентальной коробки на обычный автомобиль вряд ли будет оправдана с экономической точки зрения.

Из всего сказанного делаем вывод: установка кулачковой КПП (или кулачкового ряда на стандартную КПП) на ваш автомобиль будет оправдана лишь в том случае, если вы готовите его к серьезным соревнованиям.Секвентальный механизм: Как это работает: секвентальная коробка передач Если же вы хотите улучшить динамические характеристики для обычной езды, проще установить «спортивные» ряды КПП и главную пару дифференциала.

Как устроена секвентальная коробка передач?

Как показывает ситуация на автомобильных форумах, многих автолюбителей очень интересует вопрос, что такое секвентальная коробка передач. Сразу ответим, что зачастую это механическая коробка (хотя сегодня все чаще встречаются и автоматические варианты), основной особенностью которой является возможность переключать передачи только со строгой поочередностью вверх или вниз. Благодаря этому водителю не приходится думать о том, какую именно передачу активировать – он просто ее повышает или понижает. Но есть у такого типа КПП и другие особенности, поэтому ниже мы более подробно разберемся, что значит секвентальная коробка передач.

Разбираемся, что такое секвентальная КПП и в чем ее особенности

Итак, главная особенность секвентальной КПП – это отсутствие возможности свободного выбора передач и перепрыгивания сразу через несколько.Секвентальный механизм: Как это работает: секвентальная коробка передач Необходимость в такой коробке передач возникла в связи с тем, что у водителя не всегда есть время для того, чтобы выбрать нужную передачу и затормозить для ее переключения. К слову, такие усовершенствованные механические КПП используются не только на автомобилях, но и на мототранспорте, где переключение между передачами зачастую осуществляется ногой.

Если же речь идет о секвентальных коробках, установленных на легковые автомобили, то здесь их будет отличать месторасположение центра управления. Рычаг (а иногда даже более удобные и отзывчивые кнопки) для удобства располагается на руле транспортного средства, при этом он будет обязательно обозначен специальной маркировкой «S», которая указывает на наличие на автомобиле секвентальной коробки передач.

Важно! На некоторых автомобилях с секвентальной КПП переключение между передачами может осуществляться не только вручную, но и автоматически.

Такая коробка передач имеет три основных режима работы, которые можно активировать параллельно с основными передачами:

Стандартный механический.Секвентальный механизм: Как это работает: секвентальная коробка передач

Механический спортивный.

Автоматический, когда водителю вообще не требуется переключать передачи.

Последняя особенность секвентальной КПП заключается в том, что при ее установке на автомобиль полностью отпадает необходимость в установке педали сцепления. Это не только облегчает вождение, но и позволяет эксплуатировать двигатель в стандартных условиях, не зависящих от стиля вождения и опыта водителя.

Где применяются секвентальные АКПП

Секвентальные автоматические коробки передач сегодня можно встретить преимущественно на гоночных автомобилях, так как они являются достаточно дорогим удовольствием, да и по своему предназначению полностью приспособлены под такие типы авто. Благодаря такой КПП водитель получает возможность увеличивать скорость и переключаться с передачи на передачу без малейшего замедления, что особенно важно для соревнований. Если же в дополнение такая коробка будет работать на основе гидравлики – это еще больше повысит отзывчивость автомобиля.Секвентальный механизм: Как это работает: секвентальная коробка передач

Что же касается обычных легковых авто, то устанавливаемые на них секвентальные КПП в народе именуются как «ручной» режим работы автоматической коробки передач. Тем не менее, даже в таком варианте управление автомобилем считается облегченным и не требует от водителя точного попадания в конкретную передачу. Среди серийных автомобилей, на которых были установлены такие коробки, стоит назвать:

• BMW M3.

• BMW M5.

• Mercedes Benz C-Class.

Но на самом деле секвентальная КПП является более распространенной, нежели это может показаться на первый взгляд. Как уже говорилось выше, такие коробки устанавливаются на мотоциклы, где обычно есть только две передачи. Что же касается нейтрального положения КПП, то на мотоциклах оно обычно фиксируется между первой и второй передачами. Еще больше распространения секвентальная коробка получила при конструировании и создании сельскохозяйственных тракторов, на которых кнопка или рычаг переключения передач могут располагаться как под ногами водителя, так и на рулевом колесе.Секвентальный механизм: Как это работает: секвентальная коробка передач Встречаются секвентальные коробки передач и на большегрузных автомобилях.

Устройство и принцип работы секвентальной коробки передач

Основа такой коробки передач – привычная механическая трансмиссия, которая была усовершенствована и оснащена прямозубыми шестернями вместо косозубых. Существенным конструктивным отличием секвентальной КПП является и отсутствие педали сцепления, что компенсируется благодаря установке электронного блока управления (он же в автоматическом режиме работы КПП и отвечает за переключение передач).

Переключение передач благодаря гидравлическому механизму получается максимально быстрым и не требует точности, как на обычных КПП. Все, что требуется от водителя во время управления автомобилем с такой коробкой, это оценка сложности дороги и нагрузки, которая передается на автомобильный двигатель. Чтобы облегчить ему работу, стоит постепенно повышать передачи. Если же требуется маневрирование на низкой скорости, передачи понижаются с учетом поведения автомобиля и отзыва двигателя.Секвентальный механизм: Как это работает: секвентальная коробка передач

Секвентальные или кулачковые КПП?

Стоит также упомянуть о существовании кулачковых коробок передач, которые в своих конструкционных особенностях имеют много общего с секвентальными. В частности, их объединяет наличие прямозубых и длинных шестерен с торцевыми выступами (за которые и цепляются кулачки), благодаря которым такие коробки передач позволяют максимально быстро переключаться с одной передачи на другую, не снижая скорости движения.

Однако определить, какая КПП лучше, практически невозможно. По этой причине конструкторы попросту объединили их в один механизм, который уже сегодня используется на гоночных болидах, которые принимают участие в «Формуле 1». Так что кулачковую коробку передач правильнее называть неплохой альтернативой секвентальной КПП.

Преимущества использования такой коробки на авто и других видах транспорта

Мы уже разобрались с тем, что такое секвентальная КПП. Однако давайте же подведем итог касательно всех достоинств использования такой коробки передач на разных видах транспорта:

1.Секвентальный механизм: Как это работает: секвентальная коробка передач Нет педали сцепления. Данная особенность больше всего актуальна для тех, кто только осваивает вождение и может путать педали. Помимо этого, отсутствие сцепления облегчает управление автомобилем в сложных условиях гонок, когда водителю важно концентрироваться не на силе натиска на педаль, а на трассе.

2. Передачи переключаются максимально быстро. В этом с секвентальными КПП не сможет сравниться ни один другой тип коробок передач. К этому достоинству также стоит отнести то, что при нажатии рычага передач вверх или вниз водителю не приходится задумываться над тем, в какую передачу перевести рычаг. Он просто повышает их или понижает.

3. Автомобильные конструкторы также отмечают, что отсутствие замедления во время перехода с одной передачи на другую также положительно отражается на экономии топлива.

4. Работа на двух режимах – автоматике и механике. Несмотря на то, что конструкторы и так упростили процесс управления автомобилем с механической секвентальной коробкой передач, перенеся кнопки на руль, в некоторых ситуациях водитель вообще может отказаться от управления трансмиссией и доверить эту задачу исключительно электронному блоку управления.Секвентальный механизм: Как это работает: секвентальная коробка передач

Недостатки секвентальной КПП

Секвентальная коробка передач не лишена и целого ряда недостатков, и связаны они в основном с конструкцией такой КПП. Первое, о чем необходимо подумать при покупке автомобиля с такой коробкой передач, – это ускоренный износ трансмиссии. Не стоит забывать, что в экстремальных и слишком суровых условиях эксплуатации гидравлический механизм быстро изнашивается и может выйти из строя в очень неподходящий момент. По этой причине гоночные болиды приходится полностью перебирать и менять запчасти буквально после каждой гонки.

Выше также упоминалось, что, благодаря установке секвентальных КПП на серийные автомобили, существенно увеличивается их мощность. Но есть здесь и свой подводный камень: добиться подобного можно только в том случае, если правильно и вовремя переключаться с низших на высшие передачи и обратно. Если же водитель плохо чувствует своей автомобиль и его потребности, это опять же может привести к выходу из строя всех элементов гидравлической трансмиссии.Секвентальный механизм: Как это работает: секвентальная коробка передач При этом восстановление такой системы обойдется автовладельцу очень дорого.

В связи с этим садиться за руль автомобиль с секвентальной КПП рекомендуется только водителям со стажем, которые отъездили свое и на механической коробке, и на автомате. Отсутствие опыта в вождении автомобиля может негативно отразиться на его состоянии.

Исходя из всего вышесказанного, определить рациональность покупки автомобиля или установки на него секвентальной коробки передач довольно сложно. Хотя в целом она дает целый ряд преимуществ, необходимость в ней есть далеко не у всех водителей. Да и перестроиться с привычной КПП с рычагом справа от водительского сидения не так уж и просто.

Подписывайтесь на наши ленты в таких социальных сетях как, Facebook, Вконтакте, Instagram, Pinterest, Yandex Zen, Twitter и Telegram: все самые интересные автомобильные события собранные в одном месте.Секвентальный механизм: Как это работает: секвентальная коробка передач

Секвентальная коробка передач на ваз 2107 – АвтоТоп


Автомобильная инженерная мысль за прошедшие десятилетия продвинулась далеко вперед, о чем свидетельствуют новые разработки в области конструирования трансмиссий. На данный момент на разных моделях как гражданских, так и спортивных автомобилей можно встретить различные по своему типу КПП, которые предназначены для передачи больших по величине крутящих моментов. Современные механические коробки отличаются друг от друга по конструкции, и примером этому служат секвентальные КПП, которые получили широкое распространение. Стоит отметить, что полноценные коробки секвентального типа остались в неизменном виде только на мотоциклах. Однако в последнее время очень популярными стали автоматические коробки, в которых реализована опция ручного выбора передач. Такая функция получила название типтроник или стептроник.

Типы коробок передач автомобиля

Коробка передач автомобиля в разрезе

Основная задача любой трансмиссии заключается в плавной передаче мощности от силовой установки на ведущие колеса.Секвентальный механизм: Как это работает: секвентальная коробка передач По своей конструкции КПП разделяются на следующие виды:

  1. Механические КПП. Классифицируются по количеству ведущих, ведомых и промежуточных валов, по числу передач вперед и назад.
  2. Автоматические КПП. Основное отличие сводится к конструкции коробки.
  3. Гидротрансформатор. В основу конструкции положен планетарный ряд Фурье (планетарная передача).
  4. Вариатор. В конструкцию входит два шкива, которые изменяют свой диаметр под действием центробежной силы, что влечет изменение передаточных чисел. Между шкивами располагается цепная или ременная передача. Связь между двигателем и коробкой осуществляется посредством гидротрансформатора.
  5. Роботизированные. Механическая КПП с электронным управлением процесса смены передач.

Что лучше вариатор или автомат прочитать можно здесь

Выше представлены одни из наиболее распространенных видов трансмиссий, которые широко популяризованы на современных транспортных средствах.Секвентальный механизм: Как это работает: секвентальная коробка передач Современные механические трансмиссии состоят из двух или трех валов (в зависимости от типа привода: 2 — для переднего или заднего, 3 — для заднего и полного), на которых установлены косозубые шестеренки. Именно через косозубое зацепление происходит передача крутящего момента. Между шестернями установлены сепараторы, в которые входят вилки включения передач. На внутренней стороне сепараторов и косозубых шестеренок нарезано больше число зубцов, посредством которых обеспечивается их зацепление друг с другом. В механических коробках валы изготавливаются из цельной металлической заготовки и они не разбираются. В такой трансмиссии можно включить первую передачу, а затем, например, третью и автомобиль будет продолжаться двигаться. Если же трогаться на скользком покрытии без каких-либо межосевых и межколесных блокировок, то можно стартовать с четвертой и двигатель не заглохнет.

Конструкция кулачковой КПП


Секвентальный механизм переключения


Пятиступенчатый кулачковый ряд


Внутренний механизм кулачковой КПП


Шестерня и муфта кулачковой КПП
На первый взгляд может показаться странным, но для того, чтобы изготовить «гоночную» коробку, потребовалось не усложнить, а, наоборот, упростить конструкцию обычной механической КПП.Секвентальный механизм: Как это работает: секвентальная коробка передач В первую очередь избавились от синхронизаторов. Элемент, облегчающий переключение передач, делает это, по спортивным меркам, недопустимо долго. Кроме того, он слишком хрупок.

Вместо синхронизаторов с множеством мелких зубьев зацепление шестерен и муфт обеспечивают имеющиеся на их торцах выступы – кулачки. Количество кулачков невелико – не более 7 на каждой шестерне (муфте), поэтому они входят в зацепление с большим «запасом» по ширине. При их соприкосновении раздается хорошо различимое «клацанье». Кулачки воспринимают всю ударную нагрузку, защищая зубья шестерен от поломок при жестких переключениях.

Сами шестерни по размеру значительно больше, чем в обычной КПП. Кроме того, применяются не косозубые, а прямозубые шестерни. Чем это вызвано? Прямозубые шестерни имеют меньше потерь на трение (что повышает КПД), проще в изготовлении и не создают осевых нагрузок на валы КПП. Однако они способны передавать меньший крутящий момент по сравнению с косозубыми шестернями такого же размера.Секвентальный механизм: Как это работает: секвентальная коробка передач Поэтому их и изготавливают большего диаметра.

Для более эффективного разгона в «спортивных» коробках применяют сближенные передаточные числа КПП и более длинную первую передачу. В стандартных коробках первая передача выбирается «короткой» из расчета движения в тяжелых дорожных условиях, а не для динамичного разгона.

Механизм переключения у кулачковых КПП бывает поисковый или секвентальный (последовательный). Первый практически ничем не отличается от стандартного. Секвентальный позволяет переключать передачи только последовательно, ступень за ступенью, вверх или вниз. В гоночных условиях он намного удобнее и быстрее поискового. Секвентальный механизм в управлении проще, но технически значительно сложнее.

Для переключения достаточно сдвинуть рычаг вперед или назад, а номер включенной в данный момент передачи отображается на дисплее. Вилки передач двигает специальный вал, имеющий борозды волнообразной формы. С каждым толчком рычага он прокручивается на определённый градус, при этом вилка, продвигаясь по борозде, включает передачу или «нейтралку».Секвентальный механизм: Как это работает: секвентальная коробка передач Другой вариант – при «толчке» рычага происходит поворот специальной оси с кулачками на определенный угол. Один из кулачков сдвигает вилку и выключает передачу, а другой сдвигает другую вилку, которая вводит в зацепление муфту с шестерней следующей передачи.

Рычаг переключения делают максимально длинным, чтобы приблизить его к рулю – это позволяет водителю дополнительно сократить время на переключение. Рычаг снабжают механической блокировкой, предохраняющей от случайного включения нейтрали или заднего хода. Для ее отключения необходимо нажать кнопку или скобу. Добиться еще большего выигрыша времени позволяют подрулевые переключатели и гидропривод включения передач. При таком варианте время переключения сокращается до 150 миллисекунд и, кроме того, «гидравлика» делает это более «нежно», продлевая жизнь шестерням.

На высшей ступени в иерархии «секвенталок» находятся полуавтоматические КПП. Задача водителя – только вовремя задать момент перехода на другую передачу, а самим процессом переключения управляет автоматика – включает и выключает сцепление, добавляет или сбрасывает «газ» и двигает нужные вилки.Секвентальный механизм: Как это работает: секвентальная коробка передач

Секвентальная коробка передач

Секвентальная коробка передач автомобиля

Отличие секвентальной КПП от стандартной механической заключается в том, что такие коробки бывают только двухвальными, все шестеренки в них только прямозубые и нет никаких синхронизаторов. Их роль выполняют подвижные муфты, которые и включают передачи. Помимо конструктивных различий существуют еще и эксплуатационные: в механической КПП передача включается после выключения сцепления (опытные водители переключают передачи подбирая необходимые обороты и без сцепления), а в секвентальной же коробке при езде по прямой или в гору передачи переключать можно без выключения сцепления, что позволяет делать их конструкция. Также к преимуществам секвентальной КПП можно отнести:

  • меньшие габаритные размеры корпуса коробки;
  • возможность передавать больший крутящий момент;
  • выдерживает переменные нагрузки;
  • скорость переключения составляет 0,1-0,2 сек;
  • при смене передач не падают обороты двигателя;
  • не теряется мощность в трансмиссии, которая вызвана нагревом деталей;
  • меньшая нагрузка на подшипники валов;
  • простота обслуживания.

В секвентальной коробке при езде по прямой или в гору передачи переключать можно без выключения сцепления.

Стоит отметить, что принцип работы секвентальной КПП основывается только на последовательной смене передач как в обратном, так и в прямом порядке. Таким образом повышение передач осуществляется ступенчато, т.е. нельзя перескочить, например со второй на четвертую, потому что этому будет препятствовать конструкция коробки. Также одной из особенностей устройства секвентальной коробки передач служит то, что первичный и вторичный вал в такой трансмиссии наборный, т.е. состоит из нескольких промежуточных взаимосвязанных между собой элементов. Такая особенность позволяет механикам оперативно менять шестеренки на спортивных автомобилях прямо во время гонок, чтобы подобрать оптимальные передаточные числовые соотношения зубчатых колес под текущие условия состязаний.

Применение кулачковых агрегатов

Использование таких коробок для не гоночных авто практически возможно. Однако это не имеет смысла, если говорить о практичности. Отсутствие синхронизаторов, при повседневной езде, требует от водителя совсем другой системы переключения передач. Для увеличения срока службы элементов коробки, необходимо выжимать сцепление при переключениях, перегазовывать. Конструкторы ВАЗ проделали огромную работу, разработав такую коробку передач и воплотив в жизнь своё изобретение. Кулачковая коробка подняла показатели гоночных автомобилей на высший уровень.

Коробка передач типтроник

Для реализации гоночного потенциала своих автомобилей, компания Porsche совместно с концерном Volkswagen и производителем автомобильных комплектующих компанией ZF Friedrichshafen спроектировали автоматические КПП с возможностью ручного переключения, но это не классическая секвентальная коробка передач. Такой принцип управления получил собственный товарный знак и стал называться Tiptronic. Стоит отметить, что данную технологию взяли на вооружение большое число автоконцернов, однако каждый представитель мирового авторитейла адаптировал типтроник под свои конструкции КПП. В автомобилестроении такой принцип получил название стептроник. Стоит отметить, что имитация передач в автоматической трансмиссии осуществляется блоком управления КПП, т.е. в конструкции «автомата» нет никакого секвентального механизма, потому что и так немаленькая по своим размерам коробка достигала бы размеров, сопоставимых с габаритами двигателя. Именно поэтому некорректно называть такие коробки секвентальными!

В чем разница между типтроником и автоматом

Рычаг переключения Типтроника
В первую очередь разница заключается в режиме эксплуатации автомобиля. Когда водитель передвигается в режиме «автомат», то он переводит селектор выбора передач в режим D и движется, нажимая на педаль газа. В этот момент блок управления двигателем принимает сигнал от датчика положения акселератора и подает больше топлива в цилиндры двигателя, потому что дроссельной заслонкой, которая предназначена для подачи воздуха в те же цилиндры, управляет сам водитель. Такие действия приводят к повышению оборотов коленчатого вала и как следствие растут обороты турбинного и роторного колеса гидротрансформатора, что вызывает переход от низшей на последующие передачи. С уменьшением числа оборотов двигателя и скорости автомобиля коробка понижает передачу.

Разница типтроника и автомата заключается в режиме эксплуатации автомобиля.

При переводе селектора в режим S или M (типтроник или стептроник) водитель самостоятельно подбирает передачу, которая будет отвечать его режиму движения. Для этого он ориентируется на скорость автомобиля и на обороты коленчатого вала. Однако в каждой коробке реализована защитная функция, которая заключается в том, что стрелка тахометра никогда не дойдет до красной зоны или так называемой отсечки, потому что это повысит нагрузку на коробку. Если одной фразой описать разницу, то можно уверенно сказать, что эксплуатация в режиме типтроника и автомата идентична, только отличается число оборотов, на которых переключаются передачи. Теперь вы поняли, как пользоваться типтроником на своем авто. Стоит отметить, что при переключении на пониженную передачу может ощущаться небольшой удар по кузову. Это не свидетельствует о какой-либо поломке, а лишь говорит о том, что водитель выбрал для такой задачи неправильный скоростной режим.

Коробка типтроник: плюсы и минусы

К преимуществам коробки можно отнести:

  • адаптация под любые условия вождения;
  • возможность самостоятельного выбора передач;
  • полноценная реализация тягово-динамического потенциала мотора;
  • пониженная или повышенная передача стептроника выбирается автоматически.

К недостаткам можно отнести:

  • более сложные прошивки блока коробки;
  • сложная конструкция рычага управления трансмиссией;
  • увеличенный расход топлива;
  • сложность управления.

Любой технически сложный механизма имеет как свои достоинства, так и недостатки.

И как показывает практика эксплуатации коробок передач, режимом типтроник водитель пользуется только 5-10 % времени. Такая тенденция начинает прослеживаться уже при покупке автомобиля. В этот момент менеджер по продажам объясняется покупателю как ездить на типтронике, но зачастую слышит ответ, что водителю это не нужно. На некоторых европейских моделях автомобилей встречаются автоматические адаптивные секвентальные коробки передач. Основное их отличие от классических в том, что адаптивный «автомат» подстраиваются под манеру управления водителем и под ритм передвижения. Если вы ездите на автомобиле в городе на невысокой скорости, то такая КПП будет быстро переходить на повышающую передачу, чтобы достигалась топливная экономичность. Если же вы передвигаетесь по трассе, то переключаться передачи будут немного с запозданием, чтобы автомобиль эффективно набирал скорость и быстро выходил на режим движения на повышенной передаче.

Что выбрать?

Выбор трансмиссии должен основываться на целом ряде факторов. Прежде всего – опыт водителя. Если опыта нет, то все преимущества МКПП сводятся к нулю. Лучше все доверить автоматике.

Второй фактор – динамика эксплуатации транспортного средства. Если водитель считает что 150 км/ч и выше это нормальная крейсерская скорость для автомобиля, то выбор стоит остановить на механике или секвентальной коробке.

Третий фактор – тип транспортного средства и условия эксплуатации. В городе для автомобилей класса А, В, С, D более предпочтительны автоматы. Для внедорожников и кроссоверов, автомобилей с полным приводом, которые буксируют грузы, эксплуатируются на бездорожье, оптимальный выбор – механика.

Четвертый фактор – цена КПП, стоимость ремонта. Самые дешевые и простые МКПП, за ними РКПП, АКПП, РКПП с двойным сцеплением и вариаторы.

Пятый фактор – экономичность. Наиболее экономичны вариаторы, МКПП надо уметь пользоваться, у АКПП с гидротрансформатором все зависит от конструкции и программного обеспечения.

Основные тенденции таковы. Лучшая коробка передач в плане комфортности, несомненно, вариатор, но дорогой по стоимости, в обслуживании, с низким ресурсом узлов, деталей, на мощные двигатели не поставишь. Над ними еще работать и работать. Механика простая, дешевая, но для опытных водителей, она уходит в прошлое. Встретить ее можно лишь на автомобилях бюджетных марок, спортивных версиях моделей ведущих производителей. АКПП с гидротрансформатором будут следующими на выход, пока самый ходовой вариант, распространенный – тяжелые, дорогие, не эффективные, хотя блокировка спасает положение, но конструкционные возможности этой схемы практически исчерпаны. Роботы с одним сцеплением это тупиковая ветвь, им нужна плавная динамика, невысокие скорости, ровные дороги. Хотя сочетают в себе преимущества автомата и механики. Роботы с двойным сцеплением наиболее перспективное направление на сегодняшний день. Но нужно подождать еще немного. Во-первых, чтобы исправили все ошибки роста, а во-вторых, чтобы они широко стали устанавливаться на бюджетные модели. Пока что это удел премиальных брендов. Современные бюджетники стали получать этот тип коробки только несколько лет назад.

Механизм «Пинг-понг» - Chemistry LibreTexts

  1. Последнее обновление
  2. Сохранить как PDF
  1. Механизм
  2. Дополнительная литература
  3. Примеры вопросов
  4. Ответы
  5. Ссылки
  6. Авторы и авторства

Простейший из ферментов предполагает связывание одного субстрата с ферментом и производство продукта плюс фермент.Однако большинство ферментов более сложные и катализируют реакции с участием нескольких субстратов. Связывание двух субстратов может происходить посредством двух механизмов: последовательного механизма и непоследовательного механизма. В последовательных механизмах оба субстрата связывают фермент, и реакция продолжается с образованием продуктов, которые затем высвобождаются из фермента. Этот механизм можно подразделить на случайные и упорядоченные реакции. Для случайных реакций порядок связывания субстратов не имеет значения.В упорядоченных реакциях один субстрат должен связать фермент, прежде чем второй субстрат сможет связываться. Непоследовательный механизм не требует связывания обоих субстратов перед высвобождением первого продукта. Эта страница будет посвящена непоследовательному механизму, который также известен как механизм «пинг-понг». Это называется так, потому что фермент подпрыгивает из промежуточного состояния в стандартное. Фермент действует как мяч для пинг-понга, переходя из одного состояния в другое.

Механизм

Механизм пинг-понга, также называемый реакцией двойного вытеснения, характеризуется превращением фермента в промежуточную форму, когда происходит реакция первого субстрата на продукт.Важно отметить термин «промежуточный», указывающий на то, что эта форма носит временный характер. По окончании реакции фермент ДОЛЖЕН быть найден в исходной форме. Фермент определяется тем фактом, что он участвует в реакции и не расходуется. Другой ключевой характеристикой механизма пинг-понга является то, что один продукт образуется и высвобождается до связывания второй подложки. Рисунок ниже объясняет механизм пинг-понга посредством ферментативной реакции.

Это изображение показывает, что когда субстрат А связывается с ферментом, образуется комплекс фермент-субстрат EA.В этот момент образуется промежуточное состояние E *. P высвобождается из E *, затем B связывается с E *. B преобразуется в Q, который выпускается как второй продукт. E * становится E, и процесс можно повторить. Часто E * содержит фрагмент исходного субстрата A. Этот фрагмент может изменять функцию фермента, присоединяется к субстрату B или к тому и другому.

Вот еще одна диаграмма, показывающая ту же реакцию:

Пример \ (\ PageIndex {1} \): Химотрипсин

Примером механизма пинг-понга может быть действие химотрипсина.При взаимодействии с п-нитрофенилацетатом (A) реакция химотрипсина, как видно, протекает в две стадии. На первом этапе субстрат очень быстро реагирует с ферментом, что приводит к образованию небольшого количества п-нитрофенолята (P). На втором этапе взаимодействие субстрат-фермент приводит к образованию иона ацетата (Q). Действие химотрипсина - это реакция пинг-понга, потому что связывание двух субстратов заставляет фермент переключаться между двумя состояниями. Пожалуйста, обратитесь к разделу Химотрипсин и кинетика ферментов в предустановленном состоянии для получения более подробной информации о действии химотрипсина.

Пример \ (\ PageIndex {2} \): пируваткарбоксилаза

Другим примером фермента, который проявляет механизм пинг-понга, является пируваткарбоксилаза. Этот фермент катализирует добавление диоксида углерода к пирувату с образованием оксалоацетата. (приводит к глюконеогенезу) Этот биотинсодержащий фермент работает путем связывания CO 2 (A) с образованием карбоксибиотина (EA). Биотин поворачивается к пирувату (E * P) и высвобождает CO 2. (P, из-за того, что он был перемещен из своего исходного сайта связывания) Пируват (B), в непосредственной близости от CO 2 , атакует частичный позитив углерода в CO 2 (E * B).Оксалоацетат образуется внутри фермента (EQ) и высвобождается (Q). Пока происходит эта атака, биотин возвращается в исходное положение (E * -> E) и готов связать другой CO 2 .

Дополнительная литература

Важным фактором для понимания механизма пинг-понга является то, что при построении графиков 1 / v и 1 / [A] при различных концентрациях B видна серия параллельных линий. В этом случае A - это первая подложка, а B - вторая подложка.

Обратитесь к этим разделам, посвященным кинетике ферментов и кинетике michaelis-menten, чтобы лучше понять, что означает этот тип графика.

Примеры вопросов

  1. Какой тип механизма связывания «пинг-понг» связан с субстратами?
  2. Каковы две характеристики фермента, катализирующего реакцию по механизму пинг-понга?
  3. Следующая диаграмма показывает механизм глутамат-аспартатаминотрансферазы: Можно ли считать этот механизм реакцией пинг-понга / двойного вытеснения? Почему или почему нет?

Ответы

  1. Механизм для настольного тенниса - непоследовательный механизм.Продукт высвобождается после связывания первого субстрата.
  2. Во-первых, продукт виден до связывания второго субстрата. Во-вторых, связывание первого субстрата заставляет фермент переходить в промежуточную форму, которая будет связывать второй субстрат. В-третьих, график зависимости 1 / v от 1 / [A] при изменении [B] будет параллельными линиями.
  3. Да! Это определенно можно считать механизмом для пинг-понга. Во-первых, мы можем видеть, что есть состояние E ', которое указывает на механизм пинг-понга.Пиридоксаль - это кофермент, связанный с глутамат-аспартатаминотрансферазой, который принимает аминогруппу из глутамата и становится пиридоксамином, высвобождая альфа-кетоглутарат. Пиридоксамин, связанный с ферментом, затем отдает свою аминогруппу оксалоацетату для регенерации пиридоксаля, а также аспартата.

Список литературы

  1. Чанг, Раймонд. 2005. Физическая химия для биологических наук. Саусалито (Калифорния): Университетские научные книги. п. 372-377.
  2. Клеланд, Уоллес.«Вывод уравнений скорости для многоузловых механизмов пинг-понга с реакциями пинг-понга на одном или нескольких участках». Журнал биологической химии 248,24 (1973): 8353-355. Распечатать.
  3. Гаррет Р. и Чарльз М. Гришем. «Глюконеогенез, метаболизм гликогена и пентозофосфатный путь». Биохимия . Бельмонт, Калифорния: Брукс / Коул, Cengage Learning, 2010. 664-66. Распечатать.

  4. Гарретт, Реджинальд и Чарльз М.Гришем. «Ферменты-кинетика и специфичность». Биохимия, четвертое издание. Белмонт, Калифорния: Брукс / Коул, Cengage Learning, 2010. стр. 406-407.

Авторы и авторство

  • Мелисса Хилл, Лаура Лан, Эндрю Джилван

5.6: Последовательные механизмы нескольких субстратов - Химия LibreTexts

Модель кинетики ферментов Михаэлиса – Ментена была получена для реакций с одним субстратом .Ферментативные реакции, требующие нескольких субстратов и приводящие к множеству продуктов, более распространены, чем реакция с одним субстратом. В этих типах реакций все задействованные субстраты связываются с ферментом до того, как произойдет катализ реакции с высвобождением продуктов. Последовательные реакции могут быть как упорядоченными, так и случайными. В отличие от кинетики Michealis-Menton, где бинарный комплекс фермент-субстрат генерируется в механизме ([ES], в реакциях с двумя субстратами фермента генерируется тройной комплекс фермента и двух субстратов:

\ [\ ce {A + B <=> [E] P + Q} \]

Бисубстратные реакции составляют ~ 60% известных ферментативных реакций.Реакции с несколькими субстратами подчиняются сложным уравнениям скорости, которые описывают, как субстраты связываются и в какой последовательности. Анализ этих реакций намного проще, если концентрация субстрата A поддерживается постоянной, а субстрат B варьируется. В этих условиях фермент ведет себя так же, как фермент с одним субстратом, и график v на [S] дает очевидные константы KM и Vmax для субстрата B .Если набор этих измерений выполняется при различных фиксированных концентрациях A , эти данные можно использовать для выяснения механизма реакции. Для фермента, который берет два субстрата A и B и превращает их в два продукта: P и Q, , существует два типа механизмов: тройной комплекс и пинг-понг.

Как решить кинетику ферментов этих более сложных систем? Ответ довольно прост.Вы сохраняете одну из подложек (например, B ) фиксированной и меняете другую подложку ( A ) и получаете серию гиперболических графиков v o vs A при различных фиксированных B концентрациях. Это также дало бы серию линейных 1/ v против 1/ A двусторонних графиков (графики Лайнуивера-Берка). Схема графиков Лайнуивера-Берка зависит от того, как реагенты и продукты взаимодействуют с ферментом.

Последовательный механизм

В этом механизме оба субстрата должны связываться с ферментом до того, как будут произведены и выпущены какие-либо продукты. Субстраты могут связываться с ферментом случайным образом (сначала A , затем B или наоборот) или упорядоченным образом ( A сначала следует B ). Для обоих механизмов графики Лайнуивера-Берка при изменении A и различных фиксированных значениях B дают серию пересекающихся линий.Производные кривые могут быть решены для получения подходящих кинетических констант. В упорядоченных последовательных реакциях все субстраты сначала связываются с ферментом в определенном порядке или последовательности . Продукты также высвобождаются после катализа в определенном порядке или последовательности.

Примером может служить фермент лактатдегидрогеназа, который представляет собой белок, катализирующий метаболизм глюкозы. В этом упорядоченном механизме кофермент НАДН всегда связывается первым, а затем связывается пируват.Во время реакции пируват восстанавливается до лактата, а НАДН окисляется ферментом до НАД + . Затем сначала высвобождается лактат, а затем высвобождается NAD + .

Рисунок 5.6.1 : Реакция лактатдегидрогеназы: пируват (слева) окисляется до лактата (справа) за счет НАДН Рисунок 5.6.2 : Упорядоченный последовательный механизм фермента лактатдегидрогеназы

Это характеристика тройного комплекса, который состоит из трех связанных вместе молекул.Перед катализом субстраты и кофермент связываются с ферментом. После катализа комплекс состоит из фермента и продуктов NAD + и лактата.

В случайных последовательных реакциях субстраты и продукты связываются, а затем высвобождаются в произвольном или «случайном» порядке (рис. 3.4.1). Примером может служить фермент креатинкиназа, который катализирует креатин и АТФ (два субстрата) с образованием фосфокреатина и АДФ (продукты) на рис. 3.4.4. В этом случае либо , субстраты могут связываться первыми, и любой из продуктов может высвобождаться первыми.Тройной комплекс все еще наблюдается для случайных последовательных реакций. Перед катализом образуется комплекс, который включает фермент, АТФ и креатин. После катализа комплекс состоит из фермента, АДФ и фосфокреатина.

Рисунок 5.6.3: Метаболизм креатинкиназы следует случайному последовательному механизму.

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.


Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

  • В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
  • Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
  • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
  • Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
  • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.


Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файлах cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

Разрешение согласованного и последовательного механизмов в фотоиндуцированной реакции переноса двойного протона в 7-азаиндольном димере с Н-связью

Abstract

Представлены экспериментальные и теоретические основы синхронного или согласованного переноса двух протонов в центросимметричных электронно-возбужденных молекулярных димерах с водородной связью.Модель-прототип - димер 7-азаиндола. Новое исследование предлагает подтверждение согласованного механизма бипротонного переноса возбужденного состояния. Недавние методы фемтосекундной фотоионизации и кулоновского взрыва привели к наблюдениям за времяпролетным МС, предполагающим последовательный двухступенчатый бипротонный перенос для одного и того же димера. Мы интерпретируем общие виды, наблюдаемые в экспериментах по времени пролета, как объяснимые, не противоречащие согласованному механизму переноса протона.

Димер с двойной Н-связью 7-азаиндола (7-AI) был исчерпывающе изучен в качестве модельного прототипа таутомеризации пар оснований ДНК, поскольку признано, что он претерпевает бипротонный перенос (1) при фотовозбуждении.Центральным вопросом в реакциях двойного протонного переноса (ПП) является то, применим ли последовательный (ступенчатый) или согласованный механизм к двум протонодонорным и протоноакцепторным сайтам (2). Пошаговый механизм требует, чтобы кривая потенциальной энергии реакции имела промежуточный минимум между потенциальным минимумом для нормальных таутомеров и PT-таутомеров, чтобы можно было наблюдать конечное время жизни переходных промежуточных частиц (3). Недавние результаты фемтосекундной масс-спектрометрии димера 7-AI, образующегося при адиабатическом расширении (4, 5), были опубликованы в переохлажденных молекулярных пучках, образованных адиабатическим расширением струи, с утверждением, что с помощью быстрой переходной кинетики был установлен двухступенчатый механизм ФП для фотовозбужденных 7. -AI, с очевидным подтверждением теоретических расчетов (6).Другая лаборатория (7) заявила об аресте промежуточного продукта, включающего один ФТ в димере 7-AI, с помощью техники кулоновского взрыва, также в экспериментах с переохлажденными молекулярными пучками. Мы считаем, что эти результаты были неверно истолкованы, и поскольку они уже принимаются в некоторых кругах (2, 8) как доказанные, мы представляем уточненные расчеты и экспериментальные результаты для проверки согласованного механизма бипротонного переноса для 7-AI. В обоих экспериментах по расширению струи на молекулярном пучке используются жесткие инвазивные методы (фотоионизация, кулоновский взрыв) для получения катионных частиц, необходимых для обнаружения с помощью времяпролетного (TOF) -MS.Мы показываем, что эти процедуры лазерной фотоионизации вносят серьезное возмущение в электронные состояния вовлеченных молекулярных систем и, по сути, создают катионные молекулярные частицы, которые считаются промежуточными.

Развитие фемтосекундных лазерных технологий теперь позволяет синхронизировать динамические химические события в пикосекундной и субпикосекундной шкале времени. Следовательно, возникла новая двойственность критериев механизмов молекулярных реакций: ( a ) классическое требование с демонстрацией промежуточной впадины на кривой потенциальной энергии реакции или ( b ) (суб) пикосекундное наблюдение за переход через промежуточную молекулярную конфигурацию.Оба они могут удовлетворять операционному критерию Бриджмена (9) для физической реальности, если характеристика промежуточного продукта может быть установлена, а динамика реакции находится в пределах, налагаемых реальной системой. Мы сравним две возможности для случая бипротонной фототаутомерии.

Ключевой рассматриваемой молекулой является 7-AI (рис. 1 B ), выбранная (1) в качестве прототипа модели для молекулы с парой оснований, чей димер с двойной H-связью (рис. 1 D ) может служить для имитации пар оснований ДНК.

Было опубликовано много исследований быстрой динамики двойного ФП в димерах 7-AI, начиная с новаторского исследования пикосекундной области, проведенного Хетерингтоном, Майклсом и Эйзенталем (10). Окончательное фемтосекундное спектроскопическое исследование Takeuchi и Tahara (11, 12) двойного ФП димеров 7-AI в растворе и всестороннее спектроскопическое исследование Fuke et al. (13, 14) о спектрах высокого разрешения 7-AI в переохлажденных струйных (газообразных) нейтральных молекулярных пучках предлагает подробный обзор фотофизики явлений возбуждения в этой молекуле и ее димере с водородной связью.

Первоначальное исследование (1) 7-AI установило склонность молекулы к димеризации в углеводородном растворе, проявляя (зависящую от концентрации) зеленую вторую полосу флуоресценции (λ макс. 475 нм), которая заменяет УФ- фиолетовая полоса флуоресценции (λ max 330 нм) мономера. Отнесение зеленой флуоресценции к таутомеру PT димера 7-AI (пирроло-H, переведенное в аза-N, рис. 1 D ) было установлено путем сравнения со спектроскопией стабилизированного метилом PT N- . разновидности таутомера (7-метил-7-H-пирроло [2,3-b] пиридин) 7-AI (15).

Требование одновременности

Движущей силой для PT возбужденного состояния в 7-AI является перестройка электронов, которая происходит при возбуждении основного состояния (S 0 ) в первое возбужденное состояние π-электронов (S 1 ) 7-AI. . Расчетный дипольный момент изменяется от 1,61 D до 2,66 D соответственно (J.C., неопубликованная работа), демонстрируя сдвиг электронной плотности от пирроло к пиридиновому кольцу. Этот сдвиг ясно виден (рис. 2) в электронном распределении первой возбужденной молекулярной орбитали (теперь заселенная самая низкая незанятая молекулярная орбиталь конфигурации основного состояния) по сравнению с электронным распределением самой высокой занятой молекулярной орбитали.Это изменение электронного распределения приводит к увеличению кислотности пирроло-N и одновременному увеличению основности пиридино-N. В димере 7-AI с двойной водородной связью (рис. 1 D ) два протона, таким образом, заставляют обмениваться своей ковалентной связью с ранее присоединенным водородным атомом азота синхронно или согласованно. Характеристика согласованно применима только в случае, когда обе молекулы возбуждаются одновременно до состояния S 1 . Молекулярные орбитали для основного состояния рассчитаны на уровнях B3LYP / 6–31G ** с оптимизацией молекулярной геометрии.Полное представление расчета распределения заряда в различных электронных состояниях 7-AI и результирующего дипольного момента, момента перехода и связанных свойств будет предоставлено в другом месте.

Рисунок 2

Молекулярные орбитали для электронного перехода S 0 → S 1a димера 7-AI с водородными связями [от самой высокой занятой молекулярной орбитали (ВЗМО) до возбуждения нижней незанятой молекулярной орбитали (НСМО)], демонстрируя большое увеличение пиридиновой -N электронная плотность.Затенение темным и светлым соответствует разным знакам волновых функций. Большое увеличение электронной плотности пиридино-N при возбуждении также наблюдается во втором переходе S 0 → S 1b димера 7-AI.

Возможность одновременного возбуждения двух оснований в их состояния S 1 обсуждалась при первом введении 7-AI в качестве модельной молекулы для спаривания оснований ДНК (1). Одновременное или когерентное возбуждение двух соседних молекул рассматривается в рамках теории молекулярных экситонов (16, 17).При расщеплении молекулярного экситона можно использовать векторную модель для диполь-дипольного взаимодействия возбужденного состояния, при этом два антипараллельных диполя перехода (притягивающая матрица) представляют нижнее экситонное состояние для димера и два параллельных диполя перехода (отталкивающая матрица) для верхнего экситонное состояние. Нижнее состояние (S 1a , 2A g ) в геометрии C 2h центросимметричного плоского димера с водородными связями является строго электродипольным, запрещенным для поглощения фотонов из основного состояния (S 0 , 1А г ).Верхний расщепленный уровень экситона - S 1b , B u и разрешен как электрическое дипольное поглощение фотонов. Ключевыми наблюдениями реальности молекулярных экситонных состояний были окончательные наблюдения Fuke et al. (13, 14), что действительно существует двухфотонное разрешенное 1A g → 2A g (S 0 → S 1a ) электронное возбуждение в димере 7-AI с Н-связями (супер- охлажденный молекулярный пучок), за которым следует однофотонно-разрешенное 1A g → 1B u (S 0 → S 1b ) электронное возбуждение.Это наблюдение бифотонного низшего электронного перехода в димере 7-AI, за которым следует нормальный однофотонно-разрешенный переход, доказывает существование электронно-связанных состояний в димере, т. Е. Что мономеры 7-AI одновременно возбуждаются в димере . Как следствие, все волновые функции должны быть центросимметричными для димера, а движущая сила для согласованного ФП также должна быть центросимметричной. Это наблюдение бифотонного поглощения является спектроскопической основой согласованного бипротонного механизма в фотовозбужденном димере с Н-связями 7-AI.Во второй статье Фук и Кая (14) также обнаружили слабое однофотонное поглощение с той же полосой происхождения O, O в спектре возбуждения флуоресценции, что и двухфотонное поглощение. Эти авторы не осознавали важность своих двойных наблюдений как бифотонного, так и однофотонного возбуждения. Бифотонное поглощение сильное и однозначное; слабое однофотонное поглощение представляет собой типичное небольшое ослабление строгих правил отбора экситонов, возникающее из-за небольшого геометрического искажения димера.Основная компонента остается бифотонной для низшего перехода S 0 → S 1a .

Спектроскопические условия, необходимые для пошагового или последовательного двойного ФП, будут следующими: Для молекулярного димера 7-AI A 1 A 2 в основном состоянии сначала необходимо возбудить A 1 пары A * 1 A 2 , так что пирроло-H в A 2 будет притягиваться к молекуле A * 1 ; затем на втором этапе необходимо возбудить A 2 A * 1 A * 2 так, чтобы пирроло-H из A 1 был привлечен к молекуле A * 2 .Такому электронному механизму прямо противоречат принципы возбуждения соседних молекул димера и обширные эмпирические наблюдения.

Бипротонный перенос в растворе

Общие экситонные правила преобладают и в спектроскопии растворов (см. Ниже). Необходимость синхронного двойного ФП проявляется также в таутомеризации 7-AI путем катализа протонными растворителями. Было отмечено, что простые спирты катализируют таутомеризацию (1) 7-AI, а жидкая вода - нет.Спирты (например, метанол, этанол) легко образуют циклический сольват с двойной Н-связью (1) с 7-AI, облегчая синхронный или согласованный бипротонный перенос за счет сверхбыстрых эффектов взаимной индукции связанного протонодонорного, протоноакцепторного сайта. . В жидкой воде водородно-связанные цепи и кластеры будут предлагать множество протоноакцепторных и протонодонорных участков, но в жидкой воде мономерный H 2 O не существует, и синхронность протонодонорного, протоноакцепторного действий отсутствует. Однако, если мономерный H 2 O образуется путем микродобавления воды к непротонному растворителю, такому как этиловый эфир, циклический комплекс моногидрата с 7-AI легко проявляет зеленую флуоресценцию димера PT (18–20).Этот и связанные с ним эксперименты подтверждают требование одновременности согласованного двухпротонного ФП в возбужденном состоянии S 1 7-AI. Ab initio расчеты акво-комплексов 7-AI были выполнены Шуклой и Мишрой (21) и независимо Чабаном и Гордоном (22).

Расчет теоретической кривой потенциальной энергии

Для квантово-теоретических расчетов сложных многоатомных молекул доступен ряд приближенных методов с возрастающим уточнением.Для 7-AI использовались четыре уровня приближения. Сущность и методы учета эффектов электронной корреляции подробно рассмотрены Рагвачари и Андерсоном (23).

Ранний полуэмпирический расчет для всех валентных электронов для реакционного потенциала PT для 7-AI был выполнен (24) с использованием CNDO / 2 для геометрии состояния S 0 с последующим определением конфигурационного взаимодействия S 1 Энергия перехода Франка-Кондона в состояние (CI-CNDO / 2) на основе молекулярных орбиталей S 0 -CNDO / 2.Этот расчет не выявил ни промежуточного минимума потенциала между минимумами таутомера основного состояния S 0 и S ' 0 (нормальный таутомер и таутомер 7-H PT 7-AI, соответственно), ни соответствующего возбужденного состояния (S 1 -S ' 1 ) PT потенциал реакции.

Douhal et al. (6) использовали два независимых ab initio (неэмпирических) квантово-механических методов для исследования кривой потенциальной энергии для реакций PT в 7-AI.( a ) В первых расчетах использовался ограниченный метод самосогласованного поля Хартри-Фока (RHF) для основного электронного состояния. Электронная корреляция исключается по определению в процедуре HF, причем энергия корреляции определяется количественно как разность энергий между энергией HF и истинной энергией системы. Расчет HF из-за его ограниченного характера не может считаться достаточным для изучения систем, имеющих водородные связи в своей молекулярной структуре. Известно, что молекулярные структуры, участвующие в процессе реакции ПК, нельзя адекватно описать без учета электронной корреляции (25).Douhal et al. (6) рассчитал потенциал реакции первого возбужденного синглетного состояния для таутомеризации димера 7-AI, используя простой расчет конфигурационного взаимодействия по молекулярной структуре RHF. ( b ) Во втором вычислении Douhal et al. (6), поправка на корреляционную энергию была включена с использованием CIS-MP2, теория возмущений Мёллера-Плессета во втором порядке. В расчетах использовался базисный набор 4–31G с программами Gaussian-94. Модель CIS-MP2 ограничена в своем подходе к полной энергии корреляции электронов и оказалась ненадежной в связанных расчетах поверхности потенциальной энергии для реакций переноса атома водорода (26).Усеченный базисный набор 4–31G также является основным ограничением достоверности расчетов, представленных Douhal et al. (6).

Расчетные профили потенциальной энергии реакции, опубликованные качественно (без каких-либо координатных масштабов) как их рисунок 2, Douhal et al. (6) представлены здесь (наш рис. 3) в исправленном виде. Показано, что в исходном виде потенциальные кривые имеют промежуточный минимум. В таком качественном виде кривые были взяты в качестве подтверждения (например.г., рисунок 1 в исх. 5) экспериментальных результатов и поддержал предположение (7) о двухступенчатом механизме ФП в димере 7-AI. Однако кривые, построенные Douhal et al. Номер (6) не соответствуют полученным ими расчетным числам. Если ввести шкалу энергии на ординате (наш рис. 3) [на основе 0–14,78 ккал / моль (мин / макс)] для потенциала S 1 / S ′ 1 (наши обозначения), очевидно, что для этого расчета нет промежуточного минимума возбужденного состояния.Douhal et al. Профиль потенциала реакции (не обозначенный на рисунке 2), по-видимому, предназначен для расчета RHF, поскольку авторы отмечают далее в тексте, что расчеты Møller-Plesset (CIS-MP-2) не показывают промежуточного минимума. Вызывает недоумение то, что Douhal et al. (6) решил отобразить результаты неадекватного расчета RHF, тогда как улучшенные расчеты CIS-MP-2 приблизились бы к более реалистичной кривой потенциальной энергии. Переходное состояние «горбится» TS1 'и TS2', показанное Douhal et al. (6) могут не существовать, поскольку они кажутся зависимыми от произвольного внесения геометрического искажения или от очень сложной теоретической оптимизации геометрии.

Рисунок 3

Кривые реакционного потенциала PT для димера 7-AI. Сплошные кривые, данные Douhal et al. (6) без калибровки шкалы. Пунктирные кривые скорректированы для соответствия опубликованным значениям энергии Douhal et al.

Расчеты по теории гибридного функционала плотности (HDF) были выполнены для основного электронного состояния в настоящем исследовании с использованием конфигурационного взаимодействия для кривой потенциальной энергии возбужденного состояния, CIS-6–31G ** / B3LYP / 6–31G ** , с оптимизацией геометрии состояния S 0 .Рассчитанный согласованный двойной PT потенциал фототаутомерии 7-AI представлен на рис. 4. Из начального минимума возбужденного состояния S 1 (S 1a и S 1b , обозначенных 2A g и 1B ). u ) до минимума S ′ 1 (S ′ 1b и S ′ 1a , 1B u и 2A g ) для пары PT таутомеров (H-связанный димер таутомера 7-H ) существует единственный потенциальный барьер ( около 8,5 ккал / моль для состояния 2A g и 7.8 ккал / моль для 1В и ). Эти теоретические потенциалы подтверждают отсутствие промежуточного минимума и усиливают механизм бипротонного переноса в 7-AI как согласованный механизм для одновременного двухсайтового би-ПТ. Надежность метода HDF подкрепляется демонстрацией надежности расчета потенциала реакции переноса H-атома (26), при этом результаты HDF были сохранены в более точном расчете квадратичного конфигурационного взаимодействия (QCISD).

Рисунок 4 Кривая PT реакции потенциальной энергии PT в возбужденном состоянии Франка-Кондона (S 1 -S ' 1 ) для димера 7-AI (рис.1 D ), построенная на основе расчета HDF для согласованного процесса двойного PT димера 7-AI с двойной Н-связью (C 2h ).

Симметрии A g и B u (рис. 4) относятся к центросимметричному димеру C 2h с Н-связями, соответствующему расщепленной экситонной полосе (1) вырожденных электронных экситонных состояний нулевого порядка. пары димеров, как обсуждалось ранее. Аналогично, рассчитанные HDF потенциалы для предполагаемого одиночного ФП в димерах 7-AI показывают монотонный рост первого потенциала ФП от минимума реакции S 1 (рис.5, слева, ), и монотонный спуск для второго PT-потенциала до минимума реакции S ' 1 (рис. 5, справа ). Расчет HDF дает те же симметрии и упорядочение компонентов электронного состояния S 1 и S ' 1 , что и теория молекулярных экситонов, без приближения точечного диполя и других ограничений простой теории молекулярных экситонов Давыдова.

Рисунок 5

Ступенчатые реакционные потенциалы PT (возбужденные состояния S 1 -S ' 1 ) для димера 7-AI, построенные из расчета HDF.( Левый ) Перенос первого протона от пирроло-N 1 нижнего 7-AI на рис. 1 D в пиридино-N 7 верхнего 7-AI. ( Правый ) Перенос второго пирроло-H верхнего 7-AI в пиридино-N 7 нижнего 7-AI рис. 1 D .

В стабильных нормальных таутомерах 7-AI пирроло-N имеет pK ассоциации протонов (рис. 1 B ), по крайней мере, на шесть единиц pK больше, чем у пиридино-N, тогда как для возбужденного состояния PT Для таутомера соотношение pK обратное, с таутомером 7-H (рис.1 T ) стабилизируется (как кратковременный переходный режим). Однако в растворе метиловый спирт / HCl катион (рис. 1 C ) легко получить и измерить его спектры поглощения и флуоресценции (λ max 445 нм). Аналогичным образом аналогичные спектры аниона (рис. 1 A ) наблюдаются для раствора ДМСО / NaOH.

Наблюдение спектров катионной (и анионной) флуоресценции 7-AI, лежащих между полосами флуоресценции нейтрального основания 7-AI (рис.1 B ), а также для PT-таутомера (рис. 1 T ) может указывать на то, что, например, катион 7-AI (рис. 1 C ) может быть промежуточным однократным PT в бипротонном передача. Этот вывод обманчив, как показывает расчет HDF. Катионная и анионная (рис. 1 A ) формы 7-AI теперь имеют электронные состояния, основанные на электронно возмущенных молекулярных скелетах, что оказывается очень большим возмущением. На рис.6 представлены сдвиги энергии в ккал⋅моле −1 для катиона и аниона в зависимости отнейтральная база 7-AI. Хотя расчет HDF можно рассматривать, как и все квантово-теоретические расчеты возбужденного состояния на больших многоатомных системах, с ограниченной точностью, рис.6 определенно иллюстрирует, что основное состояние катиона (в присутствии избытка кислоты или H + ) является настолько сильно понижена (≈29000 см -1 ) по энергии относительно основного состояния нейтральной молекулы, что образование катионов действовало бы как ловушка для двойного ФП, если бы он был промежуточным. Из этого результата мы должны были бы заключить, что образование катиона в качестве промежуточного соединения в двойном ФП в возбужденном состоянии исключено в случае 7-AI.

Рисунок 6

Скелетное электростатическое возмущение π-электронных состояний 7-AI. HDF рассчитал энергии состояний S 0 и S 1 для нейтрального основания 7-AI (рис. 1 B ), депротонированного аниона (рис. 1 A ) и протонированного катиона (рис. 1 C ). ).

Фемтосекундные исследования на 7-AI PT

Переходим к рассмотрению экспериментальных исследований группы Zewail по 7-AI. В первой статье (4) адиабатическое расширение сопла с образованием переохлажденного (<1 K) газообразного молекулярного пучка используется в следующей последовательности шагов: ( - ) адиабатическое расширение сопла пара 7-AI в инертный газ-носитель, ( ii ) УФ (305–310 нм) возбуждение фемтосекундным лазерным импульсом, ( iii ) второй фемтосекундный лазерный импульс с временной задержкой ( ок. 620 нм), что дает фотоионизацию мономеров и «димеров» 7-AI с заключительной стадией (4) масс-спектрометрического разрешения TOF. Этот метод сразу вызывает два вопроса: ( a ) какова природа получаемых димеров и ( b ) какие молекулярные формы остаются после фотоионизации? В аналогичных исследованиях адиабатического расширения, проведенных группой Кастлмана (7), второй этап включает значительно увеличенную интенсивность лазерного импульса с длиной волны 624 нм, что приводит к кулоновскому взрыву частиц в возбужденной зоне молекулярного пучка 7-AI.

Мы кратко обсудим сложности, присущие технике TOF. При сверхбыстром адиабатическом расширении в результате эксперимента с соплом со свободной струей мономерные молекулы сначала термически улетучиваются в присутствии инертного газа-носителя в первичной камере, а затем выходят через сопло расширения. Среди димерных структур, которые могут образовываться в переохлажденном (<1 K) выходящем газе, будут димеры Ван-дер-Ваальса в картонной упаковке в дополнение к дважды H-связанным, копланарным, центросимметричным (C 2h ) димерам в случае 7-AI, дополнительное статистическое ограничение, возникающее из-за строгих геометрических требований для последнего в столкновительном подходе.Во-вторых, используемый метод TOF (4, 5, 7) обнаруживает только (+) - заряженные ионы. Таким образом, детектируются мономеры (7-AI) + и (7-AI) (7-AI) + электронно-асимметричных димеров, оба как ион-радикальные разновидности.

Выдающимся результатом исследования группы Кастлмана (7) было наблюдение пика ионного тока для массы-119 в виде переходного катиона (7-AI) (H + ) (рис. 1 C ), Помимо катиона нормальной молекулы с массой 118, 7-AI π (+) , последний возникает в результате ионизации π-электроном (рис.1π -C ) молекулы-компаньона димера с водородной связью . Эффектный результат эксперимента по кулоновскому взрыву - крайняя молекулярная фрагментация большей части присутствующих частиц 7-AI: H + или H 2 + , C + и многочисленных ионно-радикальных промежуточных фрагментов. наблюдаются. Наблюдение просто ионизированного 7-AI и просто ионизированного (7-AI) 2 димеров (одиночный выброс π-электрона) указывает на то, что эти частицы благополучно избежали интенсивного поля кулоновского взрыва.Чистая разница, очевидная между результатами исследований группы Castleman и Zewail, на самом деле заключается в гораздо большем количестве простых π-электронных ионизаций в Castleman et al. (7) исследования; кулоновский взрыв выглядит как деструктивная интерференция как побочный эффект.

Появление вида 7-AI (H + ) mass-119 (рис. 1 C ) в отчете Castleman и др. . (7) будет результатом однозначной π-электронной ионизации присутствующих компланарных димеров 7-AI с Н-связями.Эта асимметричная ионизация димера будет локализовать возбуждение на нейтральном 7-AI пары, при этом Н-связь будет отталкиваться частицами 7-AI π (+) (рис. 1π -C ), и в то же время пирроло-H 7-AI π (+) из-за своей повышенной кислотности будет легко высвобождаться в пиридино-N возбужденной нейтральной молекулы. Тогда существует необходимость для катиона 7-AI (H + ) отщепиться, что приведет к обнаружению частиц с массой-119, 7-AI (H + ), как указано (7), исключая вторую PT.Этот вид будет нестабильным переходным организмом с очень короткой жизнью. Оставшаяся разновидность 7-AI mass-117 теперь представляет собой цвиттер-ион: π-электронная ионизация оставляет (+) заряд, а диссоциация пиррола-H - локализованный (-) заряд; частицы масс-117 не могут появляться в масс-спектрах катионов. Таким образом, кажется реалистичным утверждать, что наблюдаемый катион с массой 119 непосредственно создается этапом фотоионизационного детектирования, требуемым методом TOF.

Отметим, что ионизация частиц 7-AI (H + ) электронами π приведет к образованию двойного катиона 7-AI π (+) (H + ) (рис.1π -D ), также не обнаруживаемых в диапазоне эксперимента. Castleman et al. (7) действительно установил тот факт, что источником катиона 7-AI (H + ) был димер 7-AI. Однако мы хотели бы указать, что различные димеры ван-дер-ваальсовых карт-упаковок могут быть стабилизированы ионизацией димера (7-AI π (+) ) (7-AI) посредством ион-дипольного взаимодействия; это должны быть катионы с массой 236, обнаруженные в масс-спектрах TOF. Мы представим подробный анализ спектроскопии димеров Ван-дер-Ваальса в другом месте.

Таким образом, эксперименты TOF групп Zewail (4) и Castleman (7) не предлагают четких доказательств наличия промежуточных одиночных PT анион-катионных форм 7-AI в реакции PT.

Охлаждаемые сверхзвуковой струей мономеры и димеры 7-AI как нейтральные молекулярные частицы были всесторонне изучены с помощью электронной спектроскопии высокого разрешения Fuke et al. (13, 14). Их очень подробное спектральное исследование флуоресценции и возбуждения установило ( a ) строгую потребность в компланарности для двойного PT в димере 7-AI с водородной связью, ( b ) драматическое влияние на PT водородной связи. режим растяжения и ( c ) электронное требование для двойного PT.Наблюдение за тем, что скорость двойного ФП в возбужденном состоянии S 1 в димере 7-AI в три раза превышала скорость гетеродимера с водородной связью (7-AI) (7-азакарбазол), подтверждает взаимную плотность π-электронов. требование усиления на сайте акцептора протона 7-H. Это последнее наблюдение дополняет аргумент в пользу согласованного двойного ПК. Кроме того, представленная экспериментально определенная поверхность реакционного потенциала ФП не предполагает промежуточного минимума. Теоретическое исследование двойного ФП в центросимметричном димере формамида с двойной Н-связью проводится параллельно с демонстрацией электронного базиса согласованного бипротонного переноса (27).

Предварительное исследование фемтосекундной динамики возбуждения димера 7-AI в фазе раствора показало, что время нарастания образования таутомера с бипротонным переносом составляет 1,4 пс (28). Фемтосекундная динамика возбуждения двойных ФП в димерах 7-AI с водородной связью в углеводородном растворе при 298 К была изучена в окончательных спектроскопических исследованиях Такеучи и Тахара (11, 12). Их наблюдаемые времена перехода и отнесения: τ 1 , 0,2 ± 0,1 пс, S 2 → S 1 , внутреннее преобразование, не зависит от дейтерия; τ 2 , 1.1 пс, S 1 → S ' 1 , время нарастания PT-таутомера, 1,6 пс в димере N-D, N-D; и τ ′ 2 , 12 пс, S ′ 1 (v) → S ′ 1 (0), время колебательного охлаждения, внутримолекулярная колебательная релаксация.

Группа Zewail (5) наблюдала для димеров 7-AI в растворе аналогичный диапазон скоростей сверхбыстрого (0,6–0,2 пс) и быстрого 1 пс (1,4–1,6 пс для дейтерированных димеров N-D, N-D 7-AI). Кроме того, обе группы наблюдали небольшую составляющую более медленного темпа на 12 пс.Такеучи и Тахара (12) приписали эту скорость колебательному охлаждению [внутримолекулярная колебательная релаксация (IVR)] по аналогии с установленными скоростями IVR для аналогичных молекул углеводорода. Группа Zewail (5) приняла недостающие результаты расчета RHF (6) за промежуточный минимум потенциала реакции (преувеличено на рисунке 1) и соответствующим образом интерпретировала все свои динамические данные. Такеучи и Тахара (12) полностью учли точные задействованные самые низкие молекулярные электронные состояния 7-AI, аналогичные состояниям изоэлектронных состояний S 1 (L b ) и S 2 (L a ). нафталин.Такеучи и Тахара (12) опускают нижнее экситонное состояние A g , сохраняя расщепленные компоненты верхнего B и (1) (рис. 3) S 1a и S 1b , поскольку S 0 (1A g ) → S 1a (2A g ) переход является электрически дипольным запрещенным и наблюдается как бифотонный переход (13, 14), как мы обсуждали выше. Поскольку дипольные моменты повернуты в плоскости в возбужденном состоянии PT-таутомера, компоненты A g и B u меняют порядок (ср. Рис.4). Метастабильность состояния S 1a (2A g ) вносит вклад в динамику таутомеризации и является состоянием, из которого происходит таутомеризация в димере (13, 14).

Заключение

Процесс бипротонного переноса в возбужденном состоянии имеет фундаментально спектроскопическое происхождение, и мы предложили схему принципов и соответствующих спектроскопических наблюдений. Кинетические наблюдения, проводимые в настоящее время сверхбыстрыми методами, берут свое начало на множестве молекулярных частиц, образующихся при различных условиях возбуждения, и сложности получаемых спектроскопических состояний.Перед тем, как результаты кинетических изотопов можно было должным образом сопоставить, было важно выяснить несколько видов, образовавшихся в эксперименте по адиабатическому охлаждению и фотоионизации.

Таким образом, мы наблюдаем, что ( i ) анионные и катионные электронные состояния 7-AI сильно сдвинуты по энергии из-за возмущения скелетного заряда, что выводит их за пределы допустимого диапазона в качестве промежуточных продуктов для реакции двойного PT в нейтральных молекулах таутомеров. ( ii ) Высокоуровневые квантово-теоретические расчеты указывают на низкий барьер для двойного PT в 7-AI без указания промежуточного минимума.( iii ) Фемтосекундная динамика и спектроскопические исследования PT-реакций в возбужденном состоянии с определенными H-связанными центросимметричными копланарными димерами 7-AI полностью интерпретируются без предположения о ионном промежуточном продукте с помощью одинарных PT-стадий.

Наконец, если фемтосекундный / пикосекундный промежуточный продукт действительно был обнаружен как естественный промежуточный продукт, он должен был бы выживать достаточно долго, чтобы иметь генетическое значение как событие мутации в паре оснований ДНК. Максимальная скорость диффузии нуклеотидов к ДНК-полимеразе оценивается (29) в 6000 секунд -1 , а исследования скоростей репликации в реальных биологических системах (30, 31) настолько далеки от пикосекундной временной шкалы переходных процессов, что сверхбыстрое динамическое событие, не имеющее генетической применимости.

Благодарности

Мы в долгу перед Генеральным директором научных исследований Испании за финансовую поддержку. J.-C.V. находится в отпуске из Автономного университета Мадрида и благодарит Государственный университет Флориды за финансовую поддержку.

СОКРАЩЕНИЯ

7-AI,
7-азаиндол;
PT,
перенос протона;
RHF,
ограниченный Hartree-Fock;
HDF,
гибридный функционал плотности;
TOF,
время полета
  • Copyright © 1999, Национальная академия наук

F 1 -ATPase вращается по асимметричному последовательному механизму с использованием всех трех каталитических субъединиц

  • 1

    Boyer, P.D. АТФ-синтаза - великолепная молекулярная машина. Annu. Rev. Biochem. 66 , 717–749 (1997).

    CAS Статья Google Scholar

  • 2

    Киносита, К., мл., Адачи, К. и Ито, Х. Вращение F1-АТФазы: как может работать молекулярная машина, управляемая АТФ. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 33 , 245–268 (2004).

    CAS Статья Google Scholar

  • 3

    Каялар, К., Розинг, Дж. И Бойер, П.Д. Последовательность чередующихся сайтов для окислительного фосфорилирования, предложенная путем измерения паттернов связывания субстрата и ингибирования обменных реакций. J. Biol. Chem. 252 , 2486–2491 (1977).

    CAS PubMed Google Scholar

  • 4

    Gresser, M.J., Myers, J.A. И Бойер, П. Кооперативность каталитического сайта митохондриальной F1 аденозинтрифосфатазы говяжьего сердца. Корреляция измерений начальной скорости, связанного промежуточного продукта и кислородного обмена с чередующейся трехузельной моделью. J. Biol. Chem. 257 , 12030–12038 (1982).

    CAS PubMed Google Scholar

  • 5

    Grubmeyer, C., Cross, R.L. & Penefsky, H.S. Механизм гидролиза АТФ митохондриальной АТФазой сердца говядины. Константы скорости для элементарных стадий катализа на одном сайте. J. Biol. Chem. 257 , 12092–12100 (1982).

    CAS PubMed Google Scholar

  • 6

    Крест, р.Л., Грубмейер, К., Пенефски, Х.С. Механизм гидролиза АТФ митохондриальной АТФазой сердца говядины. Повышение скорости в результате кооперативного взаимодействия между несколькими каталитическими центрами. J. Biol. Chem. 257 , 12101–12105 (1982).

    CAS PubMed Google Scholar

  • 7

    Boyer, P.D. Механизм изменения связывания АТФ-синтазы - некоторые вероятности и возможности. Biochim. Биофиз. Acta 1140 , 215–250 (1993).

    CAS Статья Google Scholar

  • 8

    Abrahams, J.P., Leslie, A.G., Lutter, R. & Walker, J.E. Структура F1-АТФазы из митохондрий сердца крупного рогатого скота при разрешении 2,8 Å. Nature 370 , 621–628 (1994).

    CAS Статья Google Scholar

  • 9

    Bowler, M.W., Montgomery, M.G., Leslie, A.G. & Walker, J.E. Как азид ингибирует гидролиз АТФ с помощью F-АТФаз. Proc. Natl. Акад. Sci. США 103 , 8646–8649 (2006).

    CAS Статья Google Scholar

  • 10

    Bowler, M.W., Montgomery, M.G., Leslie, A.G. & Walker, J.E. Структура основного состояния F1-АТФазы из митохондрий бычьего сердца с разрешением 1,9 Å. J. Biol. Chem. 282 , 14238–14242 (2007).

    CAS Статья Google Scholar

  • 11

    Вебер, Дж., Wilke-Mounts, S., Lee, RS, Grell, E. & Senior, AE. Специфическое размещение триптофана в каталитических сайтах F1-АТФазы Escherichia coli обеспечивает прямое определение связывания нуклеотидов: максимальный гидролиз АТФ происходит с тремя сайты заняты. J. Biol. Chem. 268 , 20126–20133 (1993).

    CAS PubMed Google Scholar

  • 12

    Ren, H., Bandyopadhyay, S. & Allison, W.S. Субкомплекс α3 (βMet222Ser / Tyr345Trp) 3γ TF1-АТФазы не гидролизует АТФ со значительной скоростью до тех пор, пока субстрат не свяжется с каталитическим сайтом с наименьшим сродством. Биохимия 45 , 6222–6230 (2006).

    CAS Статья Google Scholar

  • 13

    Senior, A.E., Nadanaciva, S. & Weber, J. Молекулярный механизм синтеза АТФ с помощью F1F0-АТФ-синтазы. Biochim. Биофиз. Acta 1553 , 188–211 (2002).

    CAS Статья Google Scholar

  • 14

    Ноджи, Х., Ясуда, Р., Йошида, М. и Киносита, К., младший. Прямое наблюдение за вращением F1-АТФазы. Nature 386 , 299–302 (1997).

    CAS Статья Google Scholar

  • 15

    Ясуда, Р., Ноджи, Х., Киносита, К., младший и Йошида, М. F1-АТФаза - это высокоэффективный молекулярный двигатель, который вращается с дискретными шагами в 120 °. Cell 93 , 1117–1124 (1998).

    CAS Статья Google Scholar

  • 16

    Ясуда, р., Noji, H., Yoshida, M., Kinosita, K., Jr. & Itoh, H. Разрешение отдельных вращательных подшагов с помощью субмиллисекундного кинетического анализа F1-АТФазы. Nature 410 , 898–904 (2001).

    CAS Статья Google Scholar

  • 17

    Shimabukuro, K. et al. Катализ и вращение мотора F1: расщепление АТФ на каталитическом сайте происходит за 1 мс перед подшаговым вращением на 40 °. Proc. Natl. Акад. Sci. США 100 , 14731–14736 (2003).

    CAS Статья Google Scholar

  • 18

    Xing, J., Liao, J.C. & Oster, G. Создание АТФ. Proc. Natl. Акад. Sci. США 102 , 16539–16546 (2005).

    CAS Статья Google Scholar

  • 19

    Gao, Y.Q., Yang, W. & Karplus, M. Структурная модель синтеза и гидролиза АТФ F1-АТФазой. Cell 123 , 195–205 (2005).

    CAS Статья Google Scholar

  • 20

    Ariga, T., Masaike, T., Noji, H. & Yoshida, M. Пошаговое вращение F1-АТФазы с одним, двумя или тремя измененными каталитическими сайтами, которые связывают АТФ очень медленно. J. Biol. Chem. 277 , 24870–24874 (2002).

    CAS Статья Google Scholar

  • 21

    Амано, Т., Тозава, К., Йошида, М., Мураками, Х.Пространственная точность каталитического карбоксилата бета-субъединицы F1-АТФазы, исследованная путем введения различных карбоксилатсодержащих боковых цепей. FEBS Lett. 348 , 93–98 (1994).

    CAS Статья Google Scholar

  • 22

    Диттрих, М., Хаяши, С. и Шультен, К. О механизме гидролиза АТФ в F1-АТФазе. Biophys. J. 85 , 2253–2266 (2003).

    CAS Статья Google Scholar

  • 23

    Диттрих, М., Hayashi, S. & Schulten, K. Гидролиз АТФ в каталитических сайтах βTP и βDP F1-ATPase. Biophys. J. 87 , 2954–2967 (2004).

    CAS Статья Google Scholar

  • 24

    Nishizaka, T. et al. Хемомеханическое связывание в F1-АТФазе выявлено одновременным наблюдением кинетики нуклеотидов и вращения. Нац. Struct. Мол. Биол. 11 , 142–148 (2004).

    CAS Статья Google Scholar

  • 25

    Старший, А.Э. и Вебер, Дж. Счастливый автомобиль с АТФ-синтазой. Нац. Struct. Мол. Биол. 11 , 110–112 (2004).

    CAS Статья Google Scholar

  • 26

    Weber, J., Bowman, C. & Senior, A.E. Специфическая замена триптофана в каталитических сайтах F1-АТФазы Escherichia coli позволяет дифференцировать связанный субстрат АТФ и продукт АДФ в стационарном катализе. J. Biol. Chem. 271 , 18711–18718 (1996).

    CAS Статья Google Scholar

  • 27

    Weber, J. & Senior, A.E. Влияние ингибиторов азида, дициклогексилкарбодиимида и ауровертина на связывание нуклеотидов с тремя каталитическими сайтами F1-АТФазы, измеренное с использованием специфических триптофановых зондов. J. Biol. Chem. 273 , 33210–33215 (1998).

    CAS Статья Google Scholar

  • 28

    Schlichting, I.и другие. Рентгеноструктурное исследование с временным разрешением конформационных изменений белка Ha-Ras p21 при гидролизе GTP. Nature 345 , 309–315 (1990).

    CAS Статья Google Scholar

  • 29

    Antes, I., Chandler, D., Wang, H. & Oster, G. Отключение АТФ от F1-АТФазы. Biophys. J. 85 , 695–706 (2003).

    CAS Статья Google Scholar

  • 30

    Розинг, Дж., Kayalar, C. & Boyer, P.D. Доказательства энергозависимого изменения связывания фосфата для окислительного фосфорилирования митохондрий на основе измерений среднего и промежуточного обмена фосфат-вода. J. Biol. Chem. 252 , 2478–2485 (1977).

    CAS PubMed Google Scholar

  • 31

    Masaike, T., Muneyuki, E., Noji, H., Kinosita, K., Jr. & Yoshida, M. F1-АТФаза изменяет свои конформации при высвобождении фосфата. J. Biol. Chem. 277 , 21643–21649 (2002).

    CAS Статья Google Scholar

  • 32

    Моно, Дж., Вайман, Дж. И Ченжакс, Дж. П. О природе аллостерических переходов: правдоподобная модель. J. Mol. Биол. 12 , 88–118 (1965).

    CAS Статья Google Scholar

  • 33

    Koshland, D.E., Jr., Nemethy, G. & Filmer, D.Сравнение экспериментальных данных по связыванию и теоретических моделей в белках, содержащих субъединицы. Биохимия 5 , 365–385 (1966).

    CAS Статья Google Scholar

  • 34

    Itoh, H. et al. Механически управляемый синтез АТФ F1-АТФазой. Nature 427 , 465–468 (2004).

    CAS Статья Google Scholar

  • 35

    Ронделез, Ю.и другие. Синтез высокосвязанного АТФ одиночными молекулами F1-АТФазы. Nature 433 , 773–777 (2005).

    CAS Статья Google Scholar

  • 36

    Каседа, К., Хигучи, Х. и Хиросе, К. Чередование быстрых и медленных шагов гетеродимерной молекулы кинезина. Нац. Cell Biol. 5 , 1079–1082 (2003).

    CAS Статья Google Scholar

  • 37

    Эсбери, К.Л., Фер, А. И Блок, С. Кинезин движется за счет асимметричного ручного механизма. Наука 302 , 2130–2134 (2003).

    CAS Статья Google Scholar

  • 38

    Yildiz, A. et al. Миозин V передается из рук в руки: визуализация с помощью одного флуорофора с локализацией 1,5 нм. Наука 300 , 2061–2065 (2003).

    CAS Статья Google Scholar

  • 39

    Парк, ул.и другие. Полноразмерный миозин VI димеризуется и процессивно перемещается по актиновым филаментам при кластеризации мономеров. Мол. Ячейка 21 , 331–336 (2006).

    CAS Статья Google Scholar

  • 40

    Tomishige, M., Klopfenstein, D.R. И Вэйл Р.Д. Превращение кинезина Unc104 / KIF1A в процессивный мотор после димеризации. Наука 297 , 2263–2267 (2002).

    CAS Статья Google Scholar

  • 41

    Китамура, К., Tokunaga, M., Esaki, S., Iwane, A.H. & Yanagida, T. Механизм мышечного сокращения, основанный на стохастических свойствах одиночных актомиозиновых моторов, наблюдался in vitro . Биофизика 1 , 1–19 (2005).

    CAS Статья Google Scholar

  • 42

    Press, W.H., Teukolsky, S.A., Vetterling, W.T. & Flannery, B.P. Числовые рецепты в C (Издательство Кембриджского университета, Нью-Йорк, 1992).

    Google Scholar

  • Последовательный механизм транспорта электронов в резонансном туннельном диоде с толстыми барьерами

  • 1.

    C. W. J. Berenakker и H. van Houten, Solid State Phys. 44 , 1 (1991).

    Артикул Google Scholar

  • 2.

    R. Tsu, L. Esaki, Appl. Phys. Lett. 22 , 562 (1973).

    Артикул ОБЪЯВЛЕНИЯ Google Scholar

  • 3.

    Дорожная карта технологий для наноэлектроники , Программа IST Европейской комиссии «Будущее и новые технологии», 2-е изд. (2000).

  • 4.

    W. R. Frensley, Appl. Phys. Lett. 51, , 448 (1987).

    Артикул ОБЪЯВЛЕНИЯ Google Scholar

  • 5.

    С. Лурый, заявл. Phys. Lett. 47, , 490 (1985).

    Артикул ОБЪЯВЛЕНИЯ Google Scholar

  • 6.

    А.С. Тагер, Электрон. Тех., Сер. 1: Электрон. СВЧ, № 9 (403), 21 (1987).

  • 7.

    G. Iannaccone, B. Pellegrini, Phys. Ред. B 52 , 17 406 (1995).

    Google Scholar

  • 8.

    Y. Hu, S. Stapleton, J. Appl. Phys. 73 , 8633 (1993).

    Артикул ОБЪЯВЛЕНИЯ Google Scholar

  • 9.

    T. Weil, B. Vinter, Appl.Phys. Lett. 50, , 1281 (1987).

    Артикул ОБЪЯВЛЕНИЯ Google Scholar

  • 10.

    В.Я. Алешкин, Л. Реджиани, Н. В. Алкеев и др., Phys. Ред. B 70 , 115 321 (2004).

  • 11.

    Я. M. Blanter, M. Büttiker, Phys. Реп. 336 , 1 (2000).

    Артикул ОБЪЯВЛЕНИЯ Google Scholar

  • 12.

    Н. В. Алкеев, В. Э.Любченко, П. Веллинг и др., Radiotekh. Élektron. (Москва) 49 , 886 (2004) [Дж. Commun. Technol. Электрон. 49 , 833 (2004)].

    Google Scholar

  • 13.

    Дж. М. Геринг, Д. А. Крим, Д. Г. Морган и П. Д. Коулман, J. Appl. Phys. 61, , 271 (1987).

    Артикул ОБЪЯВЛЕНИЯ Google Scholar

  • 14.

    Э. Р. Браун, К. Д. Паркер, Т.C. L. G. Solner, Appl. Phys. Lett. 54 , 934 (1989).

    Артикул ОБЪЯВЛЕНИЯ Google Scholar

  • 15.

    М. Н. Фейгинов, Заявл. Phys. Lett. 78 , 3301 (2001).

    Артикул ОБЪЯВЛЕНИЯ Google Scholar

  • 16.

    F. W. Sheard, G. Toombs, Solid-State Electron. 32 , 1443 (1989).

    Артикул ОБЪЯВЛЕНИЯ Google Scholar

  • 17.

    Дж. Джено, С. Стэплтон, О. Бероло, IEEE Trans. Электронные устройства 38 , 2006 (1991).

    Артикул ОБЪЯВЛЕНИЯ Google Scholar

  • 18.

    J. P. Mattia, A. L. McWhorter, R. J. Aggarwal, et al., J. Appl. Phys. 84 , 1140 (1998).

    Артикул ОБЪЯВЛЕНИЯ Google Scholar

  • 19.

    Х. П. Йостен, Х. Дж. М. Ф. Нотеборн, К. Каски, Д. Ленстра, J.Прил. Phys. 70, , 3141 (1991).

    Артикул ОБЪЯВЛЕНИЯ Google Scholar

  • 20.

    В. Фуско, СВЧ-схемы: анализ и компьютерное проектирование (Прентис-Холл, Энглвуд Клиффс, Нью-Джерси, 1987; Радио и Связь, Москва, 1990).

    Google Scholar

  • 21.

    С. Л. Ахназарова, В. В. Кафаров, Оптимизация экспериментов в химии и химической технологии (Высшая школа, Москва, 1978).

    Google Scholar

  • Механизмы получения спейсера последовательной сборкой адаптационного модуля у Synechocystis | Исследование нуклеиновых кислот

    Аннотация

    CRISPR – Cas иммунные системы обрабатывают и интегрируют короткие фрагменты ДНК от новых захватчиков в качестве спейсеров в локус CRISPR хозяина, чтобы установить молекулярную память о предшествующей инфекции, что также известно как адаптация в полевых условиях. Некоторые системы CRISPR – Cas полагаются на Cas1 и Cas2 для завершения процесса адаптации, который был охарактеризован в нескольких системах.Напротив, многие другие системы CRISPR – Cas требуют дополнительного фактора Cas4 для эффективной адаптации, механизм которой остается менее понятным. Здесь мы представляем биохимическую реконструкцию Synechocystis sp. Система адаптации типа I-D PCC6803, рентгеновские кристаллические структуры комплексов Cas1 – Cas2 – преспейсер и структура комплекса Cas4 – Cas1, полученная с помощью электронной микроскопии с отрицательным окрашиванием. Cas4 и Cas2 конкурируют друг с другом за взаимодействие с Cas1. В отсутствие пре-спейсера Cas4, но не Cas2, собирается с Cas1 в очень стабильный комплекс для обработки пре-спейсера.Поразительно, что комплекс Cas1-prespacer вырабатывает более высокое сродство связывания с Cas2 с образованием тройного комплекса Cas1-Cas2-prespacer для интеграции. Вместе мы показываем двухступенчатый механизм последовательной сборки для модуля адаптации типа I-D Synechocystis , в котором Cas4-Cas1 и Cas1-Cas2 функционируют как два эксклюзивных комплекса для обработки, захвата и интеграции преспейсеров.

    ВВЕДЕНИЕ

    Бактерии и археи развили адаптивную иммунную систему, известную как система CRISPR – Cas [кластеризованные с регулярными промежутками короткие палиндромные повторы (CRISPR) –CRISPR-ассоциированные гены (Cas)] (1).Этот адаптивный иммунитет приобретается с помощью трехступенчатого механизма: (i) короткая чужеродная ДНК включается в локус CRISPR как новый спейсер, процесс, известный как адаптация; (ii) локус CRISPR транскрибируется и процессируется в РНК CRISPR (crRNA) для сборки с белками Cas, а именно экспрессии, созревания и сборки; (iii) управляемые крРНК, белки Cas нацелены на вторгающуюся нуклеиновую кислоту и устраняют ее, что называется интерференцией. Стадия экспрессии и созревания, а также стадия интерференции широко изучались за последнее десятилетие.Однако многие молекулярные детали процесса адаптации остаются неуловимыми (2).

    Системы CRISPR – Cas можно разделить на два класса, шесть типов и> 30 подтипов в зависимости от состава и расположения локусов гена cas (3). Несмотря на разнообразие систем CRISPR – Cas, они разделяют универсальный механизм интеграции спейсера, в котором консервативный комплекс Cas1 – Cas2 захватывает и интегрирует короткие сегменты чужеродной ДНК в массивы CRISPR хозяина (3).Предыдущие биохимические и структурные исследования показали, что комплекс Cas1-Cas2 несет prespacper с 3'-выступом и интегрирует prespacper в лидер-проксимальный повтор посредством прямой нуклеофильной атаки (4-7).

    Хотя Cas1 и Cas2 повсеместно используются для катализирования реакции интеграции, было установлено, что в процессе адаптации участвуют многие другие типоспецифичные факторы (8-11). Одним из хорошо охарактеризованных примеров является фактор хозяина интеграции (IHF). в системе типа IE.Было показано, что IHF индуцирует изгиб лидерного повтора и обеспечивает дополнительную специфичность последовательности для Cas1-Cas2 (6,8). В последнее время гены cas4 и некоторых подтипов в системах типа I участвуют в адаптации (12–14). Во многих случаях гены cas4 расположены рядом с cas1 и cas2 , а иногда даже сливаются с cas1 . Биохимические функции Cas4 в адаптации появились совсем недавно (13-17). Биохимические и генетические исследования показали, что Cas4 распознает последовательности Protospacer Adjacent Motif (PAM) и обрабатывает преспейсер посредством сайт-специфического эндонуклеолитического расщепления, чтобы гарантировать интеграцию функциональных спейсеров в массив CRISPR (13-17).Недавние исследования системы адаптации Bacillus halodurans обнаружили, что Cas4 вместе с Cas1 и Cas2 собираются в тройной комплекс и соединяют процесс преспейсера и интеграцию, предлагая первый взгляд на системы адаптации Cas4-Cas1-Cas2 (13).

    Несмотря на недавний вдохновляющий прогресс в этой области, системы адаптации Cas4-Cas1-Cas2 остаются плохо изученными на механистическом уровне. Здесь мы обеспечиваем понимание механизма адаптации Cas4-Cas1-Cas2 типа I-D у Synechocystis sp.PCC6803 посредством биохимических и структурных исследований. В отличие от того, что было обнаружено в Bacillus halodurans , система адаптации Synechocystis действует посредством двухэтапных последовательных событий сборки, разъединяя процессы предварительной обработки и интеграции. Cas4 и Cas1 собираются в стабильный бинарный комплекс из-за более высокой аффинности связывания, который отвечает за обработку преспейсера перед интеграцией. Комплекс Cas4-Cas1 обрабатывает пре-спейсер PAM-зависимым образом.После процессинга с предварительным спейсером комплекс Cas1-пре-спейсер развивает более высокое сродство к Cas2 и диссоциирует от Cas4, чтобы собираться в тройной комплекс Cas1-Cas2-пре-спейсер для интеграции.

    МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

    Белковый препарат

    Последовательности ДНК cas4 , cas1 и cas2 генов Synechocystis sp. Система CRISPR – Cas с идентификатором типа PCC6803 была синтезирована и клонирована в вектор, полученный из pET-28a (+) (Novagen), который содержит N-концевую метку His6-MBP (мальтозосвязывающий белок), за которой следует вирус травления табака (TEV). сайт узнавания протеазы и линкер (ASGSGTGSGS).Все белки были сверхэкспрессированы в штамме Escherichia coli Rosetta (DE3) (Novagen) при 18 ° C в течение 18 часов. Клетки собирали центрифугированием и осадки клеток ресуспендировали в связывающем буфере (20 мМ Трис-HCl pH 8,0, 250 мМ NaCl, 10% глицерин). Клетки лизировали в гомогенизаторе сверхвысокого давления и центрифугировали для удаления клеточного дебриса. Полученный супернатант собирали и инкубировали с 1 мл магнитных шариков IDA-Nickel (BeaverBeads ™, Beaverbio), предварительно уравновешенных связывающим буфером.После промывания связывающим буфером с добавлением 20 мМ имидазола для удаления неспецифически связанных белков целевой белок элюировали с использованием связывающего буфера с добавлением 250 мМ имидазола. Элюированный целевой белок инкубировали с протеазой TEV (100: 1) для удаления N-концевой метки His6-MBP. Расщепленный белок пропускали через колонку для обессоливания для удаления имидазола, а затем через колонку Ni-NTA (GE Healthcare) для удаления свободной метки His-MBP, нерасщепленного белка и протеазы TEV. Проходящий поток собирали и дополнительно очищали через колонку с гепарином (GE Healthcare) и колонку для гель-фильтрации (Superdex 75 10/300 GL, GE Healthcare).Очищенные белки концентрировали до 10 мг / мл -1 и хранили при -80 ° C до использования.

    Препарат ДНК-субстрата

    Все олигонуклеотиды были синтезированы Sangon Biotech. 5 '- (Cy3) TGTGCCCCTGGCGGTCGCTTTCTTTTT-3' отдельно и отожженный с 5'-AAAAAGAAAGCGACCGCCAGGGGCACA-3 'использовали в качестве субстратов оцДНК и дцДНК для анализа сдвига электрофоретической подвижности соответственно. 5 ′ - (Cy3) TTGTGCCCCTGGCGGTCGCTTTCAATTTTTAACTTTTTTT-3 ′ или 5 ′ - (Cy3) TTGTGCCCCTGGCGGTCGCTTTCAATTTTTTTTTTTTTTTT-3 ′ использовали для анализов активности нуклеазы Cas4.Двухветвистый пре-спейсер 22-7-7 (дуплекс из 22 п.н. с выступами 7 нт) получали отжигом 5'-TTTTTTTTGTGCCCCTGGCGGTCGCTTTCTTTTTTT-3 'и 5'-TTTTTTTGAAATT-3' и 5'-TTTTTTTGAAATT-3 'TACCGCCAGGGGCACCGCCAGGGGCAC. 26-5-5 двухветвистый пре-спейсер (дуплекс из 26 п.н. с выступами 5 нуклеотидов) получали отжигом 5'-TTTTTTTGTGCCCCTGGCGGTCGCTTTCAAGTTTTT-3 'и 5'-TTTTTCTTGAAAGCGACCGCCAGGGGCAC. Отжиг выполняли путем нагревания олигонуклеотидов ДНК до 95 ° C в течение 5 минут и градиентного охлаждения (0,1 ° C / 8 с) от 95 ° C до 25 ° C в буфере для отжига (20 мМ HEPES pH 7.5, 100 мМ NaCl и 10% глицерин).

    MBP Pull-down анализ

    MBP или белок, меченный MBP (2 мг), инкубировали со 100 мкл аффинной смолы MBP (NEB) при 16 ° C в течение 30 минут в буфере для гель-фильтрации. Белки промывали 5 мл буфера с последующей инкубацией с 4 мг немеченых белков Cas при 16 ° C в течение 30 мин. После промывания 5 мл буфера белки элюировали элюирующим буфером (20 мМ Трис-HCl pH 7,4, 250 мМ NaCl, 10% глицерин, 1 мМ EDTA и 10 мМ мальтоза).Образцы разделяли 15% SDS-PAGE. Каждый эксперимент повторялся трижды, и в рукописи был показан один репрезентативный результат.

    Калориметрия изотермического титрования

    Эксперименты

    ITC проводили при 25 ° C с использованием ITC200 (Microcal). Очищенные белки Cas1, Cas2 и Cas4 обессоливали в буфере (20 мМ HEPES pH 7,4, 100 мМ NaCl, 10% глицерин и 5 мМ β-меркаптоэтанол). 650 мкМ Cas2 титровали 20 последовательными 4 мкл в ячейку, содержащую 150 мкМ Cas1 или Cas1-Cas4.Данные титрования ITC анализировали с помощью программного обеспечения Origin (OriginLab).

    Анализ сдвига электрофоретической подвижности

    ОцДНК или дцДНК 0,2 мкМ инкубировали с различными концентрациями белков Cas (0, 0,2, 0,4, 1 и 4 мкМ) в буфере для отжига (20 мМ HEPES pH 7,4, 100 мМ NaCl и 10% глицерин) в течение 30 мин при 4 ° С соответственно. Реакции связывания анализировали на 6% природном полиакриламидном геле с 0,5 × TBE-буфером (45 мМ Трис-HCl, pH 8,3, 45 мМ борная кислота и 1 мМ EDTA).Флуоресцентные сигналы ДНК, меченной 5 'Cy3, регистрировали с использованием системы химической визуализации (Bio-Rad).

    Анализ поверхностного плазмонного резонанса (ППР)

    Связывание белков Cas оценивали с помощью SPR на Biacore X100 (GE Healthcare) при комнатной температуре. Очищенный белок Cas2 или Cas4 был ковалентно иммобилизован на поверхности сенсорного чипа CM5 с использованием набора для связывания аминов (GE Healthcare). Очищенный белок Cas1 пропускали через сенсорный чип в рабочем буфере [10 мМ HEPES, pH 7.4, 150 мМ NaCl, 3 мМ ЭДТА, 0,05% (об. / Об.) Поверхностно-активного вещества Р20] при скорости потока 10 мкл мин -1 . Поверхность чипа регенерировали 10 мМ глицин-HCl, pH 1,7.

    Одночастичная электронная микроскопия с отрицательным окрашиванием

    Комплекс

    Cas4 – Cas1 разбавляли до 10 мкг мл -1 и наносили 3 мкл образца на медные сетки, покрытые тлеющим разрядом, покрытые углеродом. После 30-секундной адсорбции сетки окрашивали 3% -ным (мас. / Об.) Раствором уранилацетата. Сетки наблюдали с помощью электронного микроскопа TF20 (FEI Company), работающего при 120 кэВ.Изображения были получены при номинальном увеличении 67 000 × (размер пикселя 1,8 Å). Всего на камеру Gatan CCD 895 было записано 100 микрографий с отрицательным окрашиванием.

    Всего было автоматически извлечено 48 355 частиц с использованием блока размером 128 пикселей, а стопка была объединена в два раза для двухмерного выравнивания без ссылки РЕЛИОН 3.0 (18). После двух раундов итераций 2D-классификаций частицы, принадлежащие к хорошим классам, были объединены для последующих 3D-классификаций.

    Модель ab initio была создана в RELION 3.0 (19) подвергается фильтрации нижних частот до 60 Å и используется в качестве начальной модели для трехмерного уточнения. Затем было обработано в общей сложности 8866 частиц, чтобы получить трехмерную реконструкцию с расчетным разрешением 19,2 Å.

    Анализ активности нуклеаз

    Для анализа нуклеазной активности 100 пмоль белка Cas4 инкубировали с 1 пмоль 5'-Cy3-меченой оцДНК при 38 ° C в 10 мкл реакциях, содержащих 20 мМ HEPES, pH 7,5, 100 мМ KCl-буфер. Различные двухвалентные ионы (Mg 2+ , Mn 2+ , Zn 2+ или Ca 2+ ) с конечной концентрацией 10 мМ использовали в реакциях, чтобы найти оптимальные условия для нуклеазной активности.Время инкубации составляло 20 мин для анализа активности эндонуклеаз. Реакцию гасили равным объемом буфера для загрузки геля II (Thermofisher) и 25 мМ EDTA. Затем образцы кипятили 10 мин и разделяли денатурирующим гелем 8 М мочевины и 15% полиакриламида. ДНК визуализировали системой FluorChem.

    Кристаллизация и определение структуры

    Комплекс Cas1-Cas2-предспейсер получали смешиванием Cas1, Cas2 и предспейсера в молярном соотношении 2: 1: 0,6 и дополнительно очищали гель-фильтрацией.Кристаллы Cas1 – Cas2 в комплексе с предварительным спейсером 22–7–7 или 26–5–5 выращивали методом паровой диффузии висячей капли при 20 ° C в буфере, состоящем из 30% MPD, 0,1 М имидазола, pH 6,5. , 0,2 M (Nh5) 2 SO 4 и 10% (мас. / Об.) ПЭГ3350. Кристаллы Se-Met Cas1 были выращены методом диффузии паров висячей капли при 20 ° C в буфере, состоящем из 25% PEG MME5000, 0,1 M MES pH6,5, 0,2 M (Nh5) 2 SO 4 и 20% глицерина.

    Кристаллы мгновенно замораживали в жидком азоте непосредственно из растворов-осадителей.Дифракционные данные были собраны на канале BL19U1 Национального центра белковых исследований Шанхая (NFPS) в Шанхайском центре синхротронного излучения. Собранные данные обрабатывались с помощью пакета программ HKL-3000 (20). Подробная информация о статистике обработки и уточнения данных представлена ​​в дополнительной таблице S1. Структуры определяли путем молекулярного замещения с использованием структур SeMet – Cas1 и Thermus thermophilus Cas2 (PDB ID: 1ZPW) в качестве поисковых моделей. Уточнение структуры и построение модели были выполнены с помощью PHENIX (21) и Coot (22).Все модели были проверены с помощью MolProbity (23). Все структурные рисунки были подготовлены с помощью ChimeraX (24).

    РЕЗУЛЬТАТЫ

    Биохимическое восстановление механизмов адаптации

    Synechocystis sp. Геном PCC6803 кодирует систему CRISPR-Cas типа I-D, а его модуль адаптации состоит из трех генов: cas4 , cas1 и cas2 (рисунок 1A). Чтобы выяснить молекулярный механизм процесса адаптации типа I-D у Synechocystis , мы биохимически воссоздали механизм адаптации in vitro.Сначала мы экспрессировали и очищали Cas1, Cas2 и Cas4 по отдельности. Затем мы идентифицировали и охарактеризовали пары взаимодействия этих трех белков с помощью анализов с понижением. Белок, связывающий мальтозу (MBP), не связывался с Cas1, Cas2 или Cas4 без меток (дополнительный рисунок S1). Используя MBP, помеченный Cas2, в качестве приманки, мы ясно показали, что Cas2 напрямую взаимодействует с Cas1, но не с Cas4 (рис. 1B). Соответственно, MBP, меченный Cas4, не смог опустить Cas2, но эффективно задействовал Cas1 (Рисунок 1C). Что еще интереснее, наш конкурентный анализ показал, что Cas2 слабо взаимодействует с Cas1 в присутствии Cas4, в то время как Cas4 может взаимодействовать с Cas1 в присутствии Cas2 (рис. 1B и C), предполагая, что Cas4 и Cas1 собираются в гораздо более стабильный комплекс, чем что Cas1 и Cas2.Однако в присутствии ДНК-преспейсера Cas1 рекрутируется в комплекс Cas2-ДНК (рис. 1С), указывая тем самым, что ДНК-пре-спейсер усиливает стабильность комплексов Cas1 и Cas2 (также см. Ниже).

    Рисунок 1.

    Воссоздание адаптационного модуля типа I-D в Synechocystis . ( A ) Архитектура геномного локуса для системы CRISPR – Cas типа I-D из Synechocystis . Гены спейсера, повтора и cas показаны прямоугольником, ромбиком и стрелкой соответственно.( B, C ) Анализы MBP для оценки взаимодействий между очищенными Cas1, Cas2 и Cas4. Комплекс Cas1-Cas2-пре-спейсер обозначен как 1/2 / DNA для краткости. ( D ) Аффинность связывания между Cas1 и Cas2, а также между Cas2 и комплексом Cas4-Cas1, измеренная с помощью ITC. Используются непомеченные белки Cas. Инструментальный отклик, скорректированный по базовой линии, показан на верхней панели, а интегрированные данные (квадраты) вместе с наилучшим соответствием (сплошные линии) показаны на нижней панели.Данные представляют из трех независимых экспериментов. ( E ) Аффинность связывания между адаптационными белками Cas, измеренная с помощью SPR. Используются непомеченные белки Cas. Cas2 или Cas4 иммобилизованы на сенсорном чипе, а Cas1 используется в качестве аналита. Аналит вводят серией 2-кратных серийных разведений. Данные представляют из трех независимых экспериментов. ( F ) ДНК-связывающая способность Ca1, Cas2 и Cas4. EMSA выполняется с использованием 5'-меченной Cy3 36-нуклеотидной оцДНК или 36-нуклеотидной дцДНК.Различные концентрации белков Cas (0, 0,2, 0,4, 1 и 4 мкМ) инкубировали с 0,2 мкМ оцДНК или дцДНК. Процент свободной ДНК рассчитывается на основе анализа серого сканирования. ( G, H ) Сборка белковых комплексов Cas на гель-фильтрации. Два пика Cas1 / Cas2 / Cas4 / Spacer оценивают с помощью SDS-PAGE.

    Рисунок 1.

    Воссоздание адаптационного модуля типа I-D в Synechocystis . ( A ) Архитектура геномного локуса для системы CRISPR – Cas типа I-D из Synechocystis .Гены спейсера, повтора и cas показаны прямоугольником, ромбиком и стрелкой соответственно. ( B, C ) Анализы MBP для оценки взаимодействий между очищенными Cas1, Cas2 и Cas4. Комплекс Cas1-Cas2-пре-спейсер обозначен как 1/2 / DNA для краткости. ( D ) Аффинность связывания между Cas1 и Cas2, а также между Cas2 и комплексом Cas4-Cas1, измеренная с помощью ITC. Используются непомеченные белки Cas. Инструментальный отклик, скорректированный по базовой линии, показан на верхней панели, а интегрированные данные (квадраты) вместе с наилучшим соответствием (сплошные линии) показаны на нижней панели.Данные представляют из трех независимых экспериментов. ( E ) Аффинность связывания между адаптационными белками Cas, измеренная с помощью SPR. Используются непомеченные белки Cas. Cas2 или Cas4 иммобилизованы на сенсорном чипе, а Cas1 используется в качестве аналита. Аналит вводят серией 2-кратных серийных разведений. Данные представляют из трех независимых экспериментов. ( F ) ДНК-связывающая способность Ca1, Cas2 и Cas4. EMSA выполняется с использованием 5'-меченной Cy3 36-нуклеотидной оцДНК или 36-нуклеотидной дцДНК.Различные концентрации белков Cas (0, 0,2, 0,4, 1 и 4 мкМ) инкубировали с 0,2 мкМ оцДНК или дцДНК. Процент свободной ДНК рассчитывается на основе анализа серого сканирования. ( G, H ) Сборка белковых комплексов Cas на гель-фильтрации. Два пика Cas1 / Cas2 / Cas4 / Spacer оценивают с помощью SDS-PAGE.

    Для дальнейшего подтверждения нашего вывода мы выполнили изотермическую калориметрию титрования (ITC) и эксперименты с поверхностным плазмонным резонансом (SPR) для количественной оценки сродства связывания Cas1 и Cas2, а также Cas1 и Cas4.В то время как Cas2 связывается с Cas1, нет никакого детектируемого связывания между Cas2 и комплексом Cas1-Cas4 с помощью ITC (Рисунок 1D), что также согласуется с нашим методом pull-down (Рисунок 1C). В соответствии с нашим методом «выпадающего» анализа, измеренное с помощью SPR K D для Cas1 и Cas4 составляет около 1 нМ по сравнению с K D , составляющим ~ 100 нМ для Cas1 и Cas2 (рис. 1E). Вместе эти данные подтверждают, что Cas4 связывает Cas1 намного сильнее, чем Cas2, указывая тем самым, что Cas4 может преимущественно собираться с Cas1 в клетках.

    Поскольку механизм адаптации функционирует для обработки и интеграции преспейсера в локус CRISPR хозяина, мы затем оценили субстратную специфичность для отдельных белков Cas, а также собранных комплексов Cas с использованием анализа сдвига электрофоретической подвижности (EMSA). Cas1 был способен связывать как одноцепочечную ДНК (оцДНК), так и двухцепочечную ДНК (дцДНК) с небольшим предпочтением с оцДНК (рис. 1F). Только Cas2 не смог связать оцДНК и показал слабую аффинность связывания с дцДНК (рис. 1F).Напротив, комплекс Cas1 и Cas2 показал гораздо более сильную аффинность связывания с дцДНК, чем каждый из них по отдельности, что позволяет предположить, что Cas1 и Cas2 кооперативно связывают преспейсерную дцДНК.

    Как показано ранее, Cas4 функционирует как нуклеаза для обработки ДНК захватчика для генерации преспейсеров перед интеграцией (13,15,25). Неожиданно, только Cas4 не смог связываться с оцДНК и дцДНК (рис. 1F). Поскольку Cas4 был способен образовывать стабильный комплекс с Cas1, возможно, что Cas4 может полагаться на Cas1 для распознавания субстрата в клетках.Комплекс Cas4-Cas1 обнаруживает несколько более слабое связывание с оцДНК или дцДНК по сравнению с одним только Cas1 (рис. 1F). Кроме того, мы также измерили аффинность связывания между комплексом Cas4-Cas1 и расширенной ДНК препсапсера (дуплекс из 22 пар оснований с выступами из 7 нуклеотидов, см. Ниже). Как и ожидалось, аффинность связывания Cas4-Cas1 для расширенной ДНК ниже, чем для оцДНК, но выше, чем для дцДНК (дополнительный рисунок S2), что указывает на то, что Cas4-Cas1 в комплексе со зрелым пре-спейсером менее стабильны, чем с нестабильным -обработанная перпайзер.

    Вместе наши анализы связывания побудили нас предположить, что Cas4 и Cas1 собираются преимущественно для генерации преспейсера, присутствие которого переключает предпочтение связывания Cas1 с Cas4 на Cas2, что приводит к сборке Cas1-Cas2-prespacer для интеграции. Чтобы еще больше подтвердить эту гипотезу, мы повторили этот процесс сборки с помощью гель-фильтрации. В соответствии с нашими анализами связывания, Cas1 и Cas4 собираются в стабильный комплекс при гель-фильтрации, в то время как Cas1 и Cas2 не могут образовать стабильный комплекс (рис. 1G и H).В присутствии пре-спейсерной ДНК Cas1, Cas2 и пре-спейсер собираются в стабильный тройной комплекс (рис. 1G). Более поразительно то, что добавление Cas2 и предспейсера к комплексу Cas1-Cas4 привело к диссоциации Cas4 и сборке тройного комплекса Cas1-Cas2-ДНК (Figure 1G). Эти данные предоставили убедительные доказательства в поддержку нашей гипотезы, что адаптация типа I-D в Synechocystis может включать два последовательных события сборки для обработки и интеграции преспейсера, соответственно.

    Структура комплекса Cas1 – Cas2 – предспейсер

    Подобно системе типа IE E. coli и системе типа II-A E. faecalis (5,7,26), Synechocystis Система CRISPR – Cas также использует комплекс Cas1 – Cas2 для переноса и включение преспейсера в его локус CRISPR. Чтобы выяснить молекулярный механизм захвата и интеграции преспейсера комплексом Cas1-Cas2, мы собрали тройной комплекс Cas1-Cas2-пре-спейсер для определения структуры.Для сбора данных мы получили кристаллы Cas1 – Cas2 в комплексе с пре-спейсером, содержащим дуплекс длиной 22 п.о. и выступы длиной 7 н. Первоначально мы пытались определить тройной комплекс путем молекулярной замены с использованием опубликованного комплекса Cas1 – Cas2 или тройного комплекса Cas1 – Cas2 – ДНК, но не смогли получить разумную фазу. Поэтому мы приготовили кристаллы селенометионинсодержащего Cas1 и определили его кристаллическую структуру с помощью аномальной дифракции на одной длине волны (дополнительный рисунок S3). Мы успешно построили структурную модель Cas1 и использовали эту структуру и кристаллическую структуру Thermus thermophilus Cas2 (PDB ID: 1ZPW) в качестве шаблонов для решения структуры комплекса Cas1-Cas2-prespacer путем молекулярной замены (дополнительная таблица S1) .

    Общая архитектура комплекса Cas1-Cas2-prespacer Synechocystis напоминает гантель, в которой димер Cas2 находится посередине с двумя димерами Cas1, фланкирующими с каждой стороны (Figure 2A). Дуплекс предварительной спейсера ДНК проходит по центральному димеру Cas2 с 3'-выступами, вставленными в дистальные субъединицы Cas1 (рис. 2А). Сравнение структур показало, что Cas1 похожи друг на друга, все из которых состоят из N-концевого β-листового домена и C-концевого α-спирального домена (дополнительные рисунки S4a и b).Напротив, Cas2 Synechocystis и E. faecalis имеют сходную складку с одной β-цепью на самом С-конце, что отличается от структуры E. coli Cas2, которая состоит из двух β-цепей в С-концевой домен (дополнительные рисунки S4c и d). Различия мономерного Cas2 у разных видов обеспечивают структурную основу для их разной димерной сборки, приводя к различиям в рекрутировании Cas1 в комплекс Cas1-Cas2 (5,7). И Synechocystis , и E.faecalis использует только один протомер Cas2 для взаимодействия с соседней субъединицей Cas1 для сборки комплекса Cas1-Cas2, тогда как в E. coli комплекс Cas1-Cas2 два протомера Cas2 взаимодействуют с соседней субъединицей Cas1 (Figure 2B). Несмотря на общую сходную архитектуру с комплексами Cas1-Cas2-prespacer E. coli и E. faecalis , Synechocystis Cas1-Cas2-prespacer обнаруживают несколько уникальных особенностей. Во-первых, граница раздела Cas1 – Cas2 в Synechocystis скрывает площадь поверхности ∼1656 Å 2 , что намного меньше, чем у E.coli (∼2852 Å 2 ) и E. faecalis (∼2249 Å 2 ). Меньший интерфейс взаимодействия между Synechocystis, Cas1 и Cas2 объясняет, почему Cas1-Cas2, возможно, не смогли собраться в стабильный комплекс в отсутствие преспейсера (Figure 1G). Во-вторых, комплексы Cas1-Cas2 разных видов собираются под разными углами (дополнительный рисунок S5). Если наложить один протомер димера Synechocystis Cas2 на димер E.coli и E. faecalis , другой протомер Cas2 отличался на ∼137 ° от такового из E. coli и на ∼23 ° от такового из E. faecalis (рис. 2С). По сравнению с димером Cas2, более драматические отклонения вращения наблюдались для субъединиц Cas1 среди трех различных видов (рис. 2D). Эти различия в сборке вносят вклад в разные расстояния между двумя активными сайтами Cas1, дополнительно определяя предпочтительную длину повторов у разных видов (Figure 2E).Длина повтора у Synechocystis составляет 37 п.н., что больше, чем у E. coli (28 п.н.) и E. faecalis (36 п.н.). Соответственно, расстояние между активными центрами двух каталитических объединений Cas1 в Synechocystis составляет ∼117 Å по сравнению с ∼90 Å в E. coli и ∼115 Å в E. faecalis (рис. 2E). В-третьих, Synechocystis Cas1-Cas2 комплекс обнаруживает несколько новых особенностей в координации преспейсера (см. Следующие два раздела).

    Рис. 2.

    Кристаллическая структура комплекса Synechocystis I-D Cas1 – Cas2 – преспейсер и структурное сравнение. ( A ) Ленточная диаграмма структуры комплекса Synechocystis I-D Cas1 – Cas2 – преспейсер. Cas1a и Cas1c окрашены в голубой цвет, Cas1b и Cas1d окрашены в голубой цвет, а два мономера Cas2 окрашены в желтый и коричневый цвета соответственно. Предрасположенная ДНК окрашена в красный и синий цвета. ( B ) Детали взаимодействия Cas1 и Cas2 в различных типах (тип I-D: Synechocystis , тип I-E: E.coli , тип II-A: E. faecalis ). Обозначены скрытые области интерфейсов взаимодействия. ( C ) Сравнение димеров Cas2 различных типов. Один протомер димера Cas2 был выровнен, другой демонстрировал очевидное вращение, как показано. ( D ) Сравнение комплексов Cas1 – Cas2 различных типов с наложенным димером Cas2. ( E ) Сравнение архитектуры связывания ДНК комплекса Cas1 – Cas2 разных типов. Обозначены длина дуплекса предварительного спейсера и расстояние между активными центрами двух каталитических блоков Cas1.Активные центры Cas1 обозначены красными кружками.

    Рис. 2.

    Кристаллическая структура комплекса Synechocystis I-D Cas1 – Cas2 – преспейсер и структурное сравнение. ( A ) Ленточная диаграмма структуры комплекса Synechocystis I-D Cas1 – Cas2 – преспейсер. Cas1a и Cas1c окрашены в голубой цвет, Cas1b и Cas1d окрашены в голубой цвет, а два мономера Cas2 окрашены в желтый и коричневый цвета соответственно. Предрасположенная ДНК окрашена в красный и синий цвета.( B ) Детали взаимодействия Cas1 и Cas2 в различных типах (тип I-D: Synechocystis , тип I-E: E. coli , тип II-A: E. faecalis ). Обозначены скрытые области интерфейсов взаимодействия. ( C ) Сравнение димеров Cas2 различных типов. Один протомер димера Cas2 был выровнен, другой демонстрировал очевидное вращение, как показано. ( D ) Сравнение комплексов Cas1 – Cas2 различных типов с наложенным димером Cas2. ( E ) Сравнение архитектуры связывания ДНК комплекса Cas1 – Cas2 разных типов.Обозначены длина дуплекса предварительного спейсера и расстояние между активными центрами двух каталитических блоков Cas1. Активные центры Cas1 обозначены красными кружками.

    Преспейсерная координация комплексом Cas1 – Cas2

    Взаимодействия между Cas1-Cas2 и prespacer ДНК происходят из-за координации фосфатного остова скорее, чем из-за специфичных для оснований контактов, в соответствии с неспецифическим выбором последовательности prespacer, который является критическим для иммунной устойчивости к разнообразным захватывающим ДНК.Ранние исследования системы адаптации E. coli type I-E определили две положительно заряженные области комплекса Cas1-Cas2 для координации преспейсера, которые были придуманы как Arginine Clamp и Arginine Channel (5). Две аналогичные положительно заряженные области наблюдались также в комплексе Synechocystis Cas1 – Cas2. В отличие от E. coli Cas1 – Cas2, который использовал остатки аргинина для координации фосфата в обеих областях, Cas1 – Cas2 в основном использовал остатки лизина в области зажима, в то время как остатки аргинина в области канала сохраняли для взаимодействия с основной цепью. фосфат предварительного спейсера (рис. 3А).Поэтому мы назвали эти две области взаимодействия лизиновым зажимом и аргининовым каналом соответственно (рис. 3A и B). Лизиновый зажим отвечает за координацию дуплекса и состоит из двух лизиновых пальцев, которые представлены остатками Cas1 K15, K16, h27, K32 и K33 и остатками Cas2 K13, K17, R19 и R21, соответственно (рис. 3C и E). . Мутации с обращением заряда этих остатков значительно снижают аффинность связывания между комплексом Cas1-Cas2 и дцДНК (рис. 3D и F).Выстилка в канале аргинина, остатки Cas1 K75, R179, R180, R198 и R222 направляют 3'-выступ преспейсера для проникновения в активный сайт (рис. 3G). Мы генерировали мутации для всех этих положительно заряженных остатков в аргининовом канале Cas1, чтобы оценить их аффинность связывания с оцДНК. Четыре мутанта (K75D, R180D, R198D и R222D) значительно ослабили способность Cas1 связывать оцДНК; мутант R179D умеренно снижает способность связывания оцДНК Cas1 (рис. 3H). Все эти мутации были очищены до гомогенности и элюированы с тем же временем удерживания, что и мутации дикого типа, что указывает на то, что эти мутации не влияют на укладку белка (дополнительный рисунок S6).

    Рис. 3.

    Координация пре-спейсера комплексом Cas1 – Cas2. ( A ) Поверхностное представление электростатического потенциала комплекса Cas1 – Cas2 с предварительным спейсером, окрашенным в зеленый и желтый цвета. Синий и красный (± 5 кТл / э) указывают на положительно и отрицательно заряженные области, соответственно, белкового комплекса. Лизиновый зажим и аргининовый канал, отвечающий за координацию пре-спейсера, выделены пунктирной линией. ( B ) Схема предварительного спейсера и остатков, координирующих предварительный спейсер.( C ) Подробная информация о преспейсере, координированном остатками лизинового зажима Cas2. Окраска такая же, как в (б). ( D ) Анализ EMSA для оценки эффекта мутации обратного заряда остатков Cas2, участвующих в координации преспейсеров. Концентрации белка и ДНК такие же, как на рисунке 1F. Процент свободной ДНК рассчитывается на основе анализа серого сканирования. ( E ) Крупным планом - координация предварительного спейсера с помощью остатков лизинового зажима Cas1. Окраска такая же, как в (B). ( F ) Мутация обратного заряда зажимных остатков лизина Cas1 ослабляет аффинность связывания между комплексом Cas1-Cas2 и пре-спейсером, как показано с помощью EMSA.Концентрации белка и ДНК такие же, как на рисунке 1F. ( G ) Подробный вид аргининового канала, который стабилизирует 3'-выступ пре-спейсера. ( H ) Мутация ключевых остатков аргининового канала нарушает способность Cas1 связывать оцДНК.

    Рисунок 3.

    Координация пре-спейсера комплексом Cas1 – Cas2. ( A ) Поверхностное представление электростатического потенциала комплекса Cas1 – Cas2 с предварительным спейсером, окрашенным в зеленый и желтый цвета. Синий и красный (± 5 кТл / э) указывают на положительно и отрицательно заряженные области, соответственно, белкового комплекса.Лизиновый зажим и аргининовый канал, отвечающий за координацию пре-спейсера, выделены пунктирной линией. ( B ) Схема предварительного спейсера и остатков, координирующих предварительный спейсер. ( C ) Подробная информация о преспейсере, координированном остатками лизинового зажима Cas2. Окраска такая же, как в (б). ( D ) Анализ EMSA для оценки эффекта мутации обратного заряда остатков Cas2, участвующих в координации преспейсеров. Концентрации белка и ДНК такие же, как на рисунке 1F.Процент свободной ДНК рассчитывается на основе анализа серого сканирования. ( E ) Крупным планом - координация предварительного спейсера с помощью остатков лизинового зажима Cas1. Окраска такая же, как в (B). ( F ) Мутация обратного заряда зажимных остатков лизина Cas1 ослабляет аффинность связывания между комплексом Cas1-Cas2 и пре-спейсером, как показано с помощью EMSA. Концентрации белка и ДНК такие же, как на рисунке 1F. ( G ) Подробный вид аргининового канала, который стабилизирует 3'-выступ пре-спейсера.( H ) Мутация ключевых остатков аргининового канала нарушает способность Cas1 связывать оцДНК.

    Механизмы раскрытия и определения длины предспейсера

    Другой интригующий вопрос - как длина спейсера определялась комплексом Cas1-Cas2, который функционирует как молекулярный правитель. Структурный анализ показал, что остаток D10 на петле, соединяющей β1 и β2 Cas1, функционирует как клин, завершающий дуплексную область пре-спейсера. Остаток D10 на этой петле помог раскрутить дуплекс ДНК и направил каждый одноцепочечный 3'-выступ опускаться вниз в аргининовый канал и каждый одноцепочечный 5'-выступ опускаться вверх по направлению к некаталитическому Cas1 (рис. 4A).Следовательно, расстояние между двумя симметричными остатками Asp на петле Cas1 определяет длину дуплекса ДНК. Точно так же в E. coli и E. faecalis два остатка тирозина и два остатка гистидина из связанного с симметрией Cas1 служат штангенциркулем для измерения дуплекса длиной 23 и 22 п.о. соответственно (7, 26). Более того, структурное сравнение позволило нам идентифицировать консервативный мотив «Grabber», который захватил и загнул одноцепочечный 3'-выступ в активный канал сразу после раскручивания дуплексной ДНК.Grabber образован Q72 и F73 на петле, соединяющей β6 и β7 Cas1 (Рисунок 4B), тогда как E. coli Grabber и E. faecalis Grabber состоят из Y86 и R84, D69 и R71, соответственно (дополнительный рисунок). S7a и b). Несмотря на вариацию остатков Граббера, все они имеют общие боковые цепи в объеме и интенсивно взаимодействуют с 3'-выступом, изгибая его на ~ 90 ° от дуплекса.

    Рисунок 4.

    Механизм раскрытия и определения длины предспейсера.( A ) D10 функционирует как клин, чтобы ограничить дуплексную область предварительного спейсера. Мотив Grabber Q72 и F73 изгибает и направляет одноцепочечный 3'-выступ к активному сайту Cas1. ( B ) Крупный план расширенного препсапсера, на котором виден остаток клина D10 и мотив Граббера. ( C ) Дуплекс из 26–5–5 пре-спейсера из 26 п.н. развязан остатком D10 Cas1, что приводит к дуплексу из 22 п.о. ( D ) Смещенный 5'-выступ препсапсера взаимодействует с N-концевым доменом Cas1.

    Рисунок 4.

    Механизм раскрытия и определения длины предспейсера. ( A ) D10 функционирует как клин, чтобы ограничить дуплексную область предварительного спейсера. Мотив Grabber Q72 и F73 изгибает и направляет одноцепочечный 3'-выступ к активному сайту Cas1. ( B ) Крупный план расширенного препсапсера, на котором виден остаток клина D10 и мотив Граббера. ( C ) Дуплекс из 26–5–5 пре-спейсера из 26 п.н. развязан остатком D10 Cas1, что приводит к дуплексу из 22 п.о.( D ) Смещенный 5'-выступ препсапсера взаимодействует с N-концевым доменом Cas1.

    Для дальнейшего изучения того, ограничена ли длина дуплекса 22 п.н. комплексом Cas1-Cas2, мы дополнительно определили кристаллическую структуру Cas1-Cas2 в комплексе с пре-спейсером, содержащим более длинный дуплекс (26 п.н.) и более короткие выступы. (5 нуклеотидов), которые мы назвали Cas1 – Cas2–26 п.н. (дополнительная таблица S1). Как и ожидалось, дуплекс не был поврежден остатком D10 Cas1, что привело к дуплексу из 22 пар оснований (рис. 4C).После расширения конца 5 'выступ наклонился вверх в направлении, противоположном направлению выступа 3'. Первые три нуклеотида смещенного 5'-выступа устанавливают значительные взаимодействия с N-концевым доменом каталитической субъединицы Cas1 (Рис. 4D). После первых трех нуклеотидов мы не смогли наблюдать четкую электронную плотность для остальных нуклеотидов смещенной цепи, вероятно, из-за отсутствия координации белковых субъединиц.

    Сборка комплекса Cas4 – Cas1

    Чтобы понять механизм процессинга чужеродной ДНК с помощью комплекса Cas4-Cas1, мы сначала воссоздали Cas4-Cas1 комплекс in vitro .Мы очищали Cas1 и Cas4 по отдельности, а затем инкубировали их вместе, чтобы собрать комплекс. Cas1 (37,5 кДа), собранный с Cas4 (22,7 кДа) в стабильный комплекс с молекулярной массой 98 кДа, по оценке с помощью анализа эксклюзионной хроматографии / многоуглового рассеяния (SEC / MALS) (рис. 5A), который может содержать два Cas1 и одна молекула Cas4.

    Рисунок 5.

    Сборка комплекса Cas4 – Cas1. ( A ) Анализ SEC / MALS для измерения молекулярной массы комплекса Cas4-Cas1.Молекулярная масса составила 99,8 кДа с погрешностью 1%. ( B ) ЭМ-оболочка комплекса Cas4 – Ca1, соответствующая кристаллической структуре Cas1 и структурной модели Cas4. N-концевой домен Cas1, C-концевой домен Cas1 и Cas4 окрашены в красный, желтый и синий цвета соответственно. ( C ) Анализ MBP «pull-down» на взаимодействие между очищенным полноразмерным Cas1 (Cas1-FL), C-концевым доменом Cas1 (Cas1-C) и меченным MBP Cas4.

    Рисунок 5.

    Сборка комплекса Cas4 – Cas1.( A ) Анализ SEC / MALS для измерения молекулярной массы комплекса Cas4-Cas1. Молекулярная масса составила 99,8 кДа с погрешностью 1%. ( B ) ЭМ-оболочка комплекса Cas4 – Ca1, соответствующая кристаллической структуре Cas1 и структурной модели Cas4. N-концевой домен Cas1, C-концевой домен Cas1 и Cas4 окрашены в красный, желтый и синий цвета соответственно. ( C ) Анализ MBP «pull-down» на взаимодействие между очищенным полноразмерным Cas1 (Cas1-FL), C-концевым доменом Cas1 (Cas1-C) и меченным MBP Cas4.

    Для дальнейшего исследования сборки комплекса Cas4 – Cas1 мы решили определить структуру комплекса Cas4 – Cas1. Сначала мы попытались кристаллизовать комплекс Cas4 – Cas1 для определения структуры. После многих испытаний кристаллов комплекса нам так и не удалось получить. Поэтому мы обратились к определению структуры комплекса Cas4-Cas1 с помощью электронной микроскопии с отрицательным окрашиванием (EM). Отрицательное окрашивание с помощью ЭМ выявило гомогенные частицы несимметричной формы (дополнительный рисунок S8a). Всего было отобрано 48 355 частиц, и трехмерная реконструкция сгенерировала карту с разрешением ~ 19 Å (дополнительные рисунки S8b и c).Чтобы интерпретировать карту, мы сначала создали структурную модель Cas4 с использованием Saccharolobus solfataricus Cas4 (PDB ID: 4IC1) в качестве шаблона SWISS-MODEL (27). Затем мы подогнали модель Cas4 и кристаллическую структуру Cas1 к плотности ЭМ. Димер Cas1 и мономер Cas4 могут быть хорошо помещены в ЭМ-плотность, что соответствует стехиометрии 2: 1 Cas1 и Cas4 в комплексе. Общая архитектура комплекса Cas4-Cas1 принимает асимметричную структуру и показывает, что Cas4 может связываться с N-концевым доменом Cas1 (Figure 5B).

    Чтобы проверить детали взаимодействия между Cas4 и Cas1, мы выполнили анализ методом pull-down. Полноразмерный Cas1 был способен образовывать стабильный комплекс с Cas4, в то время как C-концевой домен Cas1 не мог взаимодействовать с Cas4 (Рисунок 5C), предполагая, что N-концевой домен Cas1 отвечает за взаимодействие с Cas4. Поскольку изолированный N-концевой домен Cas1 нестабилен, у нас не было возможности напрямую подтвердить наш вывод. Поскольку и Cas4, и Cas2 взаимодействуют с N-концевым доменом Cas1, Cas4 и Cas2 конкурируют друг с другом за взаимодействие с Cas1.Следовательно, комплексы Cas4-Cas1-Cas2 несовместимы из-за стерических затруднений, что объясняет наши предыдущие результаты биохимического восстановления (Рис. 1B-D и H).

    Cas4 обрабатывает предварительный спейсер PAM-зависимым образом

    Было показано, что

    Cas4 проявляет металло-зависимую эндонуклеазную и экзонуклеазную активности против оцДНК (11,28,29). Synechocystis Cas4 смог значительно обогатить новые спейсеры PAM-последовательностью «GTN» в клетках (14). Однако подробная биохимическая характеристика ферментативной активности Cas4 недоступна.С этой целью мы оценили нуклеазную активность Synechocystis Cas4 против различных 5'-меченых субстратов оцДНК в различных условиях. Мы обнаружили, что Cas4 проявляет PAM-зависимую эндонуклеазную активность (фиг. 6A). 5'-меченные PAM-содержащие субстраты оцДНК были обработаны до фрагментов размером ~ 30 нуклеотидов, что соответствует положению PAM. Помимо ожидаемого продукта размером ~ 30 нуклеотидов, мы также наблюдали неожиданную полосу с более короткой длиной, указывающую на неспецифические расщепления (фигура 6А). Более того, эта PAM-зависимая эндонуклеазная активность показала предпочтение двухвалентного катиона Mg 2+ и Mn 2+ , за которым следует Ca 2+ , тогда как Zn 2+ не поддерживает активность эндонуклеазы Cas4 (фигура 6B).

    Рисунок 6.

    PAM-зависимая эндонуклеазная активность Synechocystis Cas4. ( A ) Cas4 проявляет PAM-зависимую эндонуклеазную активность. ( B ) Металлозависимая эндонуклеазная активность Cas4 против 5'-меченной Cy3 оцДНК. ( C ) Cas1 способствует PAM-зависимой эндонуклеазной специфичности Cas4.

    Рисунок 6.

    PAM-зависимая эндонуклеазная активность Synechocystis Cas4.( A ) Cas4 проявляет PAM-зависимую эндонуклеазную активность. ( B ) Металлозависимая эндонуклеазная активность Cas4 против 5'-меченной Cy3 оцДНК. ( C ) Cas1 способствует PAM-зависимой эндонуклеазной специфичности Cas4.

    Чтобы изучить, как Cas1 или Cas2 влияют на эндонуклеазную активность Cas4, мы провели анализ расщепления Cas4 в присутствии Cas1 или / и Cas2. Cas1 или Cas2 по отдельности не проявляли никакой нуклеазной активности в наших экспериментальных условиях (рис. 6C).Примечательно, что добавление Cas1 стирает неспецифическую полосу, наблюдаемую только для Cas4 (Figure 6C), указывая на то, что образование комплекса Cas1-Cas4 способствует ферментативной специфичности Cas4. Вероятно, что сайты неспецифического расщепления были защищены Cas1. Неожиданно одновременное добавление как Cas1, так и Cas2 мало влияет на специфичность Cas4, вероятно, из-за приоритетной сборки комплекса Cas1-Cas2-ДНК.

    ОБСУЖДЕНИЕ

    В совокупности наше исследование позволило нам предложить модель процесса адаптации Synechocystis (рис. 7A – E), которая сильно отличается от того, что было описано для других видов.В эту модель включены два последовательных события сборки: сборка Cas4-Cas1 для обработки пре-спейсера и сборка Cas1-Cas2-prespacer для получения и интеграции пре-спейсера. На первом этапе Cas4 и Cas1 собираются в стабильный комплекс, который содержит две копии Cas1 и одну копию Cas4. С помощью Cas1, Cas4 распознает последовательность PAM «GTN» и обрезанные предшественники пре-спейсеров в их зрелую форму. Cas1-Cas4 в комплексе со зрелым пре-спейсером становится менее стабильным, чем таковой с необработанным пре-спейсером, что способствует сборке комплекса Cas1-Cas2-пре-спейсер.На втором этапе Cas2 вступает и может конкурировать с Cas4 за взаимодействие с N-концевым доменом Cas1. Хотя белки Cas2 и Cas1 демонстрируют относительно слабые взаимодействия, они способны образовывать гораздо более стабильные комплексы в присутствии преспейсерной ДНК. Следовательно, в присутствии пре-спейсера, генерируемого комплексом Cas4-Cas1, Cas4 может отталкиваться от Cas1 с помощью Cas2, что приводит к сборке тройного комплекса Cas1-Cas2-пре-спейсер. Наконец, пре-спейсер, переносимый комплексом Cas1-Cas2, интегрируется в массив CRISPR хозяина как новый спейсер.

    Рис. 7.

    Двухэтапная модель последовательной сборки адаптационного модуля типа I-D для Synechocystis . ( A ) Synechocystis Cas4 и Cas1 легко собираются в стабильный комплекс со стехиометрией от 1 Cas4 до 2 Cas1 для распознавания необработанного пре-спейсера с последовательностью PAM. ( B ) Cas4 обрезает PAM-содержащий 3'-выступ пре-спейсера PAM-зависимым образом, в то время как неизвестная ДНКаза, как полагают, обрабатывает 5'-выступ.( C ) Хотя Cas1 и Cas2 не могут образовывать стабильный комплекс, Cas1, Cas2 и обработанный пре-спейсер способны образовывать очень стабильный тройной комплекс для интеграции. ( D ) Поступающий преспейсер интегрируется в локус CRISPR посредством нуклеофильной атаки двух 3'-ОН групп. ( E ) Репликация с заполнением пробелов выполняется аппаратом репликации ДНК хозяина.

    Рис. 7.

    Двухэтапная модель последовательной сборки для модуля адаптации типа I-D Synechocystis .( A ) Synechocystis Cas4 и Cas1 легко собираются в стабильный комплекс со стехиометрией от 1 Cas4 до 2 Cas1 для распознавания необработанного пре-спейсера с последовательностью PAM. ( B ) Cas4 обрезает PAM-содержащий 3'-выступ пре-спейсера PAM-зависимым образом, в то время как неизвестная ДНКаза, как полагают, обрабатывает 5'-выступ. ( C ) Хотя Cas1 и Cas2 не могут образовывать стабильный комплекс, Cas1, Cas2 и обработанный пре-спейсер способны образовывать очень стабильный тройной комплекс для интеграции.( D ) Поступающий преспейсер интегрируется в локус CRISPR посредством нуклеофильной атаки двух 3'-ОН групп. ( E ) Репликация с заполнением пробелов выполняется аппаратом репликации ДНК хозяина.

    Следует отметить, что этот двухступенчатый последовательный механизм сборки определяется двумя ключевыми факторами. Во-первых, белки Cas4 и Cas2 конкурируют за один и тот же сайт связывания в Cas1; другой - различия в аффинности связывания между этими белками Cas. Как показали наши структурные исследования, как Cas4, так и Cas2 взаимодействуют с N-концевым доменом Cas1.Следовательно, Cas4 и Cas2 собираются в два взаимоисключающих комплекса с Cas1 соответственно. Как показали наши тесты связывания, комплексы Cas2 – Cas1, Cas4 – Cas1 и Cas1 – Cas2 – prespacer обнаруживают последовательно более высокое сродство, обеспечивая иерархический и ступенчатый процесс сборки.

    Наше структурное исследование также выявило много новых особенностей сборки комплекса Cas1-Cas2-prespacer, подчеркивая разнообразие адаптационной системы. Важно отметить, что структурное сравнение позволило нам идентифицировать консервативный мотив Cas1, названный здесь Grabber, для изгиба и направления 3'-выступа ДНК (Рис. 4A и B), что раньше не оценивалось.

    Кроме того, мы обнаружили, что активность экзонуклеазы Cas4 зависит от «PAM». Присутствие Cas1 помогло минимизировать неспецифическую активность Cas4 (фиг. 6), указывая на то, что Cas1 может связываться с необработанным преспейсером, чтобы блокировать неспецифическое расщепление с помощью Cas4.

    Несмотря на достигнутый нами прогресс, остается много нерешенных вопросов относительно системы адаптации Cas4 – Cas1 – Cas2. Один из важных вопросов - что является субстратом Cas4 – Cas1 в клетках. Другой интригующий вопрос заключается в том, измеряют ли Cas4 – Cas1 длину препапсера и каким образом.После обработки выяснилось, как Cas4 – Cas1 переключился на комплекс Cas1 – Cas2 – препсапсер. Во время этого перехода, как преспейсер был передан от Cas4 – Cas1 к Cas1 – Cas2. Кроме того, еще один важный вопрос, который необходимо решить, заключается в том, как ориентация спейсера сохраняется на этапах обработки и интеграции.

    Таким образом, наши результаты обеспечивают понимание механизмов обработки и интеграции преспейсеров, а также открывают новые возможности для будущих исследований систем адаптации. Наше исследование выявило не только универсальные принципы, присущие многим адаптационным системам, но и множество новых особенностей, уникальных для адаптационной системы Synechocystis .Учитывая разнообразие общей конструкции адаптационных систем, мы полагаем, что дополнительные вариации будут обнаружены у микробов, занимающих чрезвычайно разнообразные экологические ниши на Земле. Изучение этих разнообразных систем адаптации не только фундаментально углубит наше понимание систем адаптации, но также предложит новые инструменты для редактирования генома.

    НАЛИЧИЕ ДАННЫХ

    EM-объемы отрицательного окрашивания для комплекса Cas4-Cas1 были депонированы в EMDB под кодом доступа EMD-30377.Координаты атомов и структурные факторы Cas1-Ca2 в комплексе с 22-bp-duplex и 26-bp-duplex prespacers были депонированы в Protein Data Bank под кодом доступа 7CR6 и 7CR8, соответственно.

    ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ ДАННЫЕ

    Дополнительные данные доступны в NAR Online.

    БЛАГОДАРНОСТЬ

    Мы благодарим сотрудников канала BL19U1 Национального центра белковых исследований Шанхая (NCPSS) в Шанхайском центре синхротронного излучения за помощь во время сбора данных.

    Вклад авторов : Q.C., Y.Y. и T.M.F. задумал и спланировал эксперименты. C.W., D.T., J.C. и D.H. проводили подготовку и кристаллизацию белка. Y.Y., Q.C. и C.W. собрали данные ЭМ и рентгеновской дифракции, расшифровали структуры и провели структурный анализ. D.T., D.H. и Z.Y. выполнили анализы MBP pull-down. D.H., X.M., H.H. и S.Y. провели анализы связывания ДНК. Q.C. и T.M.F. написал рукопись при участии всех авторов.

    ФИНАНСИРОВАНИЕ

    Национальный фонд естественных наук Китая [31741027, 81672722, 81501368]; Сычуаньская программа науки и технологий [2019YFH0123, 2019YFH0124].Финансирование платы за открытый доступ: Национальный фонд естественных наук Китая; Сычуаньская программа науки и технологий.

    Заявление о конфликте интересов . Ничего не объявлено.

    ССЫЛКИ

    1.

    Райт

    А.В.

    ,

    Нуньес

    J.K.

    ,

    Дудна

    J.A.

    Биология и приложения систем CRISPR: использование природного инструментария для геномной инженерии

    .

    Ячейка

    .

    2016

    ;

    164

    :

    29

    -

    44

    . 2.

    Amitai

    G.

    ,

    Sorek

    R.

    Адаптация CRISPR – Cas: понимание механизма действия

    .

    Nat. Rev. Microbiol.

    2016

    ;

    14

    :

    67

    -

    76

    .3.

    Макарова

    К.С.

    ,

    Вольф

    Ю.И.

    ,

    Иранзо

    Дж.

    ,

    Шмаков

    С.А.

    ,

    Алхнбаши

    О.С.

    ,

    Браунс

    S.J.J.

    ,

    Шарпантье

    E.

    ,

    Cheng

    D.

    ,

    Haft

    D.H.

    ,

    Horvath

    P.

    et al. .

    Эволюционная классификация систем CRISPR – Cas: выброс класса 2 и производные варианты

    .

    Nat. Rev. Microbiol.

    2020

    ;

    18

    :

    67

    -

    83

    .4.

    Нуньес

    Дж.К.

    ,

    Ли

    A.S.

    ,

    Энгельман

    A.

    ,

    Doudna

    J.A.

    Получение опосредованного интегразой спейсера во время адаптивного иммунитета CRISPR – Cas

    .

    Природа

    .

    2015

    ;

    519

    :

    193

    -

    198

    . 5.

    Нуньес

    J.K.

    ,

    Харрингтон

    L.B.

    ,

    Кранцуш

    П.Дж.

    ,

    Энгельман

    А.Н.

    ,

    Дудна

    J.A.

    Захват чужеродной ДНК во время адаптивного иммунитета CRISPR – Cas

    .

    Природа

    .

    2015

    ;

    527

    :

    535

    -

    538

    ,6.

    Райт

    А.В.

    ,

    Лю

    J.J.

    ,

    Knott

    G.J.

    ,

    Doxzen

    K.W.

    ,

    Ногалес

    E.

    ,

    Doudna

    J.A.

    Структуры комплекса интеграции генома CRISPR

    .

    Наука

    .

    2017

    ;

    357

    :

    1113

    -

    1118

    .7.

    Сяо

    Y.

    ,

    Ng

    S.

    ,

    Nam

    K.H.

    ,

    Ke

    A.

    Как CRISPR-Cas типа II устанавливает иммунитет посредством Cas1-Cas2-опосредованной интеграции спейсера

    .

    Природа

    .

    2017

    ;

    550

    :

    137

    -

    141

    .8.

    Нуньес

    Дж.К.

    ,

    Бай

    Л.

    ,

    Харрингтон

    Л. Б.

    ,

    Hinder

    T.L.

    ,

    Дудна

    J.A.

    Для специфичности иммунологической памяти CRISPR требуется фактор хозяина

    .

    Мол. Ячейка

    .

    2016

    ;

    62

    :

    824

    -

    833

    .9.

    Heler

    R.

    ,

    Samai

    P.

    ,

    Modell

    J.W.

    ,

    Вайнера

    С.

    ,

    Goldberg

    G.W.

    ,

    Bikard

    D.

    ,

    Marraffini

    L.A.

    Cas9 определяет функциональные вирусные мишени во время адаптации CRISPR – Cas

    .

    Природа

    .

    2015

    ;

    519

    :

    199

    -

    202

    .10.

    Wilkinson

    M.

    ,

    Drabavicius

    G.

    ,

    Silanskas

    A.

    ,

    Gasiunas

    G.

    ,

    Siksnys

    V.

    ,

    Уигли

    Д. Б.

    Структура комплекса захвата связанного с ДНК спейсера системы CRISPR – Cas типа II

    .

    Мол. Ячейка

    .

    2019

    ;

    75

    :

    90

    -

    101

    . 11.

    Lemak

    S.

    ,

    Beloglazova

    N.

    ,

    Nocek

    B.

    ,

    Skarina

    T.

    ,

    Flick

    R.

    ,

    Brown

    G.

    ,

    Попович

    А.

    ,

    Иоахимиак

    А.

    ,

    Савченко

    А.

    ,

    Якунин

    AF

    Тороидальная структура и расщепление ДНК CRISPR-связанным [4Fe-4S] кластером, содержащим нуклеазу Cas4 SSO0001 из Sulfolobus solfataricus

    .

    J. Am. Chem. Soc.

    2013

    ;

    135

    :

    17476

    -

    17487

    .12.

    Zhang

    Z.

    ,

    Pan

    S.

    ,

    Liu

    T.

    ,

    Li

    Y.

    ,

    Peng

    N.

    Нуклеазы Cas4 могут влиять на специфическую интеграцию спейсеров CRISPR

    .

    J. Bacteriol.

    2019

    ;

    201

    :

    e00747-18

    . 13.

    Ли

    Х.

    ,

    Чжоу

    Ю.

    ,

    Тейлор

    Д.В.

    ,

    Сашитал

    D.G.

    Cas4-зависимая предварительная обработка обеспечивает высокую точность программирования массивов CRISPR

    .

    Мол. Ячейка

    .

    2018

    ;

    70

    :

    48

    -

    59

    . 14.

    Кипер

    S.N.

    ,

    Альмендрос

    C.

    ,

    Behler

    J.

    ,

    McKenzie

    R.E.

    ,

    Нобрега

    F.L.

    ,

    Haagsma

    A.C.

    ,

    Vink

    J.N.A.

    ,

    Hess

    W.R.

    ,

    Brouns

    S.J.J

    Cas4 облегчает выбор PAM-совместимого спейсера во время адаптации CRISPR

    .

    Cell Rep.

    2018

    ;

    22

    :

    3377

    -

    3384

    . 15.

    Shiimori

    M.

    ,

    Garrett

    S.C.

    ,

    Graveley

    B.R.

    ,

    Крачки

    М.П.

    Нуклеазы Cas4 определяют PAM, длину и ориентацию фрагментов ДНК, интегрированных в CRISPR Loci

    .

    Мол. Ячейка

    .

    2018

    ;

    70

    :

    814

    -

    824

    0,16.

    Альмендрос

    С.

    ,

    Нобрега

    F.L.

    ,

    Маккензи

    R.E.

    ,

    Браунс

    S.J.J.

    Слияние Cas4 – Cas1 способствует эффективному выбору PAM и контролю адаптации CRISPR

    .

    Nucleic Acids Res.

    2019

    ;

    47

    :

    5223

    -

    5230

    . 17.

    Garrett

    S.

    ,

    Shiimori

    M.

    ,

    Вт

    E.A.

    ,

    Кларк

    Л.

    ,

    Graveley

    B.R.

    ,

    Крачки

    М.П.

    Примированное поглощение ДНК CRISPR в Pyrococcus furiosus

    .

    Nucleic Acids Res.

    2020

    ;

    48

    :

    6120

    -

    6135

    0,18.

    Scheres

    S.H.

    Байесовский взгляд на определение крио-ЭМ структуры

    .

    J. Mol. Биол.

    2012

    ;

    415

    :

    406

    -

    418

    .19.

    Scheres

    S.H.

    РЕЛИОН: реализация байесовского подхода к определению крио-ЭМ структуры

    .

    J. Struct. Биол.

    2012

    ;

    180

    :

    519

    -

    530

    ,20.

    Minor

    W.

    ,

    Cymborowski

    M.

    ,

    Otwinowski

    Z.

    ,

    Chruszcz

    M.

    HKL-3000: интеграция обработки данных и структурного решения - по дифракционным изображениям до исходной модели за

    минут.

    Acta Crystallogr. D. Biol. Кристаллогр.

    2006

    ;

    62

    :

    859

    -

    866

    ,21.

    Адамс

    P.D.

    ,

    Афонин

    П.В.

    ,

    Bunkoczi

    G.

    ,

    Chen

    V.B.

    ,

    Davis

    I.W.

    ,

    Echols

    N.

    ,

    Headd

    J.J.

    ,

    Hung

    L.W.

    ,

    Капрал

    G.J.

    ,

    Grosse-Kunstleve

    R.W.

    et al. .

    PHENIX: комплексная система на основе Python для решения макромолекулярной структуры

    .

    Acta Crystallogr. D. Biol. Кристаллогр.

    2010

    ;

    66

    :

    213

    -

    221

    . 22.

    Emsley

    P.

    ,

    Cowtan

    K.

    Coot: инструменты построения моделей для молекулярной графики

    .

    Acta Crystallogr. D. Biol. Кристаллогр.

    2004

    ;

    60

    :

    2126

    -

    2132

    .23.

    Чен

    В.Б.

    ,

    Арендалл

    W.B.

    3-й,

    Headd

    J.J.

    ,

    Киди

    Д.А.

    ,

    Иммормино

    Р.М.

    ,

    Капрал

    G.J.

    ,

    Мюррей

    Л.В.

    ,

    Ричардсон

    Дж.

    ,

    Richardson

    D.C.

    MolProbity: проверка структуры всех атомов для кристаллографии макромолекул

    .

    Acta Crystallogr.D. Biol. Кристаллогр.

    2010

    ;

    66

    :

    12

    -

    21

    . 24.

    Годдард

    T.D.

    ,

    Huang

    C.C.

    ,

    Meng

    E.C.

    ,

    Pettersen

    E.F.

    ,

    Couch

    G.S.

    ,

    Morris

    J.H.

    ,

    Феррин

    T.E.

    UCSF chimeraX: решение современных задач в области визуализации и анализа

    .

    Protein Sci.

    2018

    ;

    27

    :

    14

    -

    25

    0,25.

    Lee

    H.

    ,

    Dhingra

    Y.

    ,

    Sashital

    D.G.

    Комплекс Cas4-Cas1-Cas2 обеспечивает точную пре-спейсерную обработку во время адаптации CRISPR

    .

    Элиф

    .

    2019

    ;

    8

    :

    e44248

    .26.

    Ван

    J.

    ,

    Li

    J.

    ,

    Чжао

    H.

    ,

    Sheng

    G.

    ,

    Wang

    M.

    ,

    Yin

    M.

    ,

    Wang

    Y.

    Структурные и механические основы получения PAM-зависимых спейсеров в системах CRISPR – Cas

    .

    Ячейка

    .

    2015

    ;

    163

    :

    840

    -

    853

    0,27.

    Waterhouse

    A.

    ,

    Bertoni

    M.

    ,

    Bienert

    S.

    ,

    Studer

    G.

    ,

    Tauriello

    G.

    ,

    Gumienny

    R.

    ,

    Heer

    F.T.

    ,

    de Beer

    T.A.P.

    ,

    Rempfer

    C.

    ,

    Bordoli

    L.

    et al. .

    SWISS-MODEL: моделирование гомологии белковых структур и комплексов

    .

    Nucleic Acids Res.

    2018

    ;

    46

    :

    W296

    -

    W303

    ,28.

    Чжан

    Дж.

    ,

    Kasciukovic

    T.

    ,

    Белый

    M.F.

    CRISPR-ассоциированный белок Cas4 представляет собой 5'-3'-экзонуклеазу ДНК с кластером железо-сера

    .

    PLoS Один

    .

    2012

    ;

    7

    :

    e47232

    ,29.

    Lemak

    S.

    ,

    Nocek

    B.

    ,

    Beloglazova

    N.

    ,

    Skarina

    T.

    ,

    Flick

    R.

    ,

    Brown

    G.

    ,

    Иоахимиак

    A.

    ,

    Савченко

    A.

    ,

    Якунин

    AF

    CRISPR-ассоциированный белок Cas4 Pcal_0546 из Pyrobaculum calidifontis содержит кластер [2Fe-2S]: кристаллическая структура и нуклеазная активность

    .

    Nucleic Acids Res.

    2014

    ;

    42

    :

    11144

    -

    11155

    .

    Заметки автора

    © Автор (ы) 2021.

    Ответить

    Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *