Как правильно останавливаться на механике: как останавливаться авто с МКПП перед светофором, двигателем и когда выжимать сцепление

ρ _{± ±} ( t ) = ∂ _t P _{± ±} ( t ), мы в конечном итоге приходим к функциям плотности вероятности, приведенным в уравнениях.29–36.

Наконец, нам нужны выражения для вероятностей расщепления, которые мы выводим с помощью сопряженных уравнений (19). Пусть π _{j ±} , где j = 0, 1, будет вероятностью того, что система, начиная с состояния j , затем произведет шаг ±. Начиная с π ₀₋, отметим, что из состояния 0 шаг назад может быть выполнен либо следующим переходом, являющимся шагом назад, который имеет вероятность ( b + w ₀ ) / ( a + b + u ₀ + w ₀ ), или путем перехода в состояние 1 и оттуда в конечном итоге получить шаг назад.Последняя возможность имеет полную вероятность π ₁₋ u ₀ / ( a + b + u ₀ + w ₀ ), так что

(62 )

Затем мы умножаем и переставляем слагаемые. Применяя ту же процедуру для других π _{j ±} , мы наконец получаем

(63)

Чтобы получить вероятности попарного расщепления в уравнениях. 29–37, мы сначала решаем π _{j ±} , а затем взвешиваем их в соответствии с начальными условиями уравнения.58:

(64)

Ссылки

19. Ван Кампен, Н. Г. 1992. Стохастические процессы в физике и химии, 2-е изд. Издательство Elsevier Science Publishers, Амстердам, Нидерланды.

29. Ховард Дж. 2001. Механика моторных белков и цитоскелета. Sinauer Associates, Сандерленд, Массачусетс.

37.Хилл, Т. Л. 1989. Свободная трансдукция энергии и кинетика биохимического цикла. Спрингер-Верлаг, Нью-Йорк.

55. Press, W. H., S. A. Teukolsky, W. T. Vetterling и B.P. Flannery. 1992. Числовые рецепты на C, 2-е изд. Издательство Кембриджского университета.

56. Барлоу Р. Дж. 1989. Статистика. Уайли, Чичестер, Англия.

Engine Неуверенность в прочтении [Архив] — DMCTalk Forum

У меня есть счетчик времени ожидания Actron. Также у меня есть шестигранный ключ с Т-образной рукояткой на 3 мм, и мой защитный колпачок уже был снят, когда я получил свою машину, и с тех пор резиновая заглушка DMCH находится в отверстии.

Совсем недавно, в том числе сегодня, автомобиль простаивал сразу после запуска из холодного состояния, и остановка стабильно сохранялась в диапазоне 50-60.

(Цифры выдержки, на которые я ссылаюсь, — это то, что считывается по 8-цилиндровой шкале и затем умножается на 2).

То же, что и у меня. Здесь все хорошо.

Это будет так в течение одной или двух минут, а затем, кажется, будет стабильно оставаться на уровне 44. Он будет стабильно держаться на уровне 44 большую часть времени, даже после того, как я достаточно прогрел машину на холостом ходу, чтобы толкнуть охлаждающие вентиляторы включаются и выключаются.
Я думаю, он должен был сработать задолго до того, как включились фанаты (59F согласно инструкции). Я знаю, что я слишком разборчив (Дэйв С. говорит мне, что я слишком беспокоюсь о множестве точных пятен, когда звоню и иногда подслушиваю его, что, как я выяснил, имеет место), но я все равно пытаюсь убить их, LOL .. .Но я думаю, что это слишком далеко. Я бы подтвердил и заподозрил датчик температуры. Но в таком случае переключаться уже поздно и впоследствии показания не изменятся …

Иногда, случайно или по совпадению увеличения оборотов, машина будет пульсировать, а не оставаться на том же постоянном уровне 44 .Однако пульсация намного выше, чем при центрировании около 40 (что вы имели в виду под 20 градусами, Рон), и будет до 75, а затем до 44 или около того. Он не делает это ужасно постоянно, так как временами кажется, что он мигает, когда опускается до 44, а затем хочет пульсировать около 40, как я хотел бы видеть, как это происходит, но затем он либо вернется к максимальному и широкому диапазон пульсирует или просто держится стабильно на уровне 44.

Ранние измерения и другие наблюдения указывали на то, что моя машина была настроена на богатый режим, поэтому я намеревался немного наклонить ее.Сняв резиновую заглушку, я услышал отчетливое изменение характеристик двигателя (влияние утечки вакуума?).
Я сделал небольшую регулировку винта смеси и считаю это «двумя часами» против часовой стрелки в том смысле, что, когда я закреплял шестигранный ключ на 3 мм, ручка была нацелена на 22:00, а я опустился на 20:00 ( понятно?). При необходимости я мог бы вернуть его обратно, так как это было легко.
Когда я добираюсь туда, где вы описываете выше, обычно он немного богатый. «Два часа» — это МНОГО.Попробуйте двигать его немного против часовой стрелки, пошагово … Это раздражает, особенно когда вы приближаетесь к нему. … Перетащите его наклонно (скажем, раскачивая @ 35) специально, чтобы знать диапазон.
Обратите внимание, когда он теплый, на холостом ходу, и он просто застывает там, он может быть так далеко, что он не может компенсировать. .

Да, это утечка вакуума. Всегда закрывайте отверстие пальцем, проверните двигатель один раз, чтобы очистить его, и немного подождите, пока он не успокоится, а затем снимите показания!

Я также заметил, что когда вы закрепляете гаечный ключ в отверстии, вы можете довольно легко надавить на узел рычага, с которым он все соединен, и заставить двигатель изменить шаг или разбрызгивание или что-то еще.Я бы предположил, что этого следовало ожидать, посмотрев на схему системы в руководстве по ремонту и увидев, что там происходит.
Ага, нормально.

Диагностическая таблица руководства для станций технического обслуживания, когда постоянное свечение на отметке 40-50 указывает на то, что датчик кислорода отключен. Я не думаю, что мой физически отключен, во всяком случае, то, что видно на проводе или разъеме. Я бы подумал, что это говорит мне, что датчик загрязнен или неисправен, так или иначе, да?
Имеет смысл.(При условии, что он не отключен, как с * выше).

У меня есть запасной кислородный датчик, который я могу поставить, но еще не сделал. Я перечитал Дэвида, говоря, что все остальное должно быть идеально, поэтому предположим, что должен быть установлен новый и / или надежный кислородный датчик, прежде чем вы сможете уверенно перейти к последнему этапу регулировки смеси CO?
Совершенно верно.

Планируется, что следующим шагом будет замена кислородного датчика? да / нет? Да (Если не как с * выше.)

Вы выполнили ВСЕ тесты в D: 04: 15?

Механика тканей определяет быструю адаптирующуюся и симметричную реакцию на прикосновение.

Значимость

Записи тельцов Пачини в 1960-х годах показали, что прикосновение вызывает симметричную активацию с последующей быстрой адаптацией.Синусоидальная стимуляция приводит к удвоению частоты в чувствительной полосе частот, что позволяет предположить, что эти рецепторы функционируют как частотно-настроенные датчики вибрации. В то время было предложено, чтобы окружающая пластинчатая капсула генерировала эту динамику отклика, действуя как механический фильтр. Однако подобная динамика ответа с тех пор наблюдалась у многих других механорецепторов, что привело к спорам по поводу специфичности этой гипотезы. Используя сочетание электрофизиологии in vivo, механической стимуляции с обратной связью и моделирования, мы разрешаем этот спор в пользу механического фильтра системного уровня, который не зависит от конкретных анатомических особенностей или конкретных каналов механоэлектрической трансдукции.

Abstract

Взаимодействие с физическим миром глубоко укоренилось в нашем чувстве осязания и зависит от ансамблей соматосенсорных нейронов, которые проникают в кожу и иннервируют ее. Соматосенсорные нейроны преобразуют механическую энергию, доставляемую при каждом прикосновении, в возбуждающие мембранные токи, переносимые по каналам механоэлектрической трансдукции (МЭП). Тельца Пачини у млекопитающих и нейроны рецепторов прикосновения (TRN) у нематод Caenorhabditis elegans встроены в особые специализированные вспомогательные структуры, имеют низкие пороги активации и быстро адаптируются к приложению и снятию механических нагрузок.Недавно были идентифицированы многие из белков-партнеров, которые формируют нативные каналы MeT в этих и других соматосенсорных нейронах. Однако биофизический механизм симметричных реакций на начало и смещение механической стимуляции ускользнул от понимания в течение десятилетий. Более того, неизвестно, активирует ли приложенная сила или возникающее в результате вдавливание каналы MeT. Здесь мы представляем систему для одновременной регистрации мембранного тока, приложенной силы и результирующей вмятины у живых C.elegans (Приложение механических нагрузок с обратной связью в сочетании с нейрофизиологией in vivo, FALCON) и использовать его вместе с моделированием для изучения этих вопросов. Мы показываем, что амплитуда тока увеличивается с вдавливанием, а не с силой, и что быстрые стимулы вызывают большие токи, чем более медленные стимулы, вызывающие такое же или меньшее вдавливание. Модель, связывающая вдавливание тела с активацией MeT-канала через встроенный вязкоупругий элемент, воспроизводит экспериментальные данные, предсказывает, что TRN функционируют как полосовой механический фильтр, и обеспечивает общий механизм для симметричной и быстрой адаптации активации MeT-канала, относящейся к соматосенсорным нейронам через типы и субмодальности.

Наше восприятие и реакция на окружающий физический мир глубоко уходят корнями в наше осязание. Ощущение боли имеет решающее значение для выживания, и даже самые легкие прикосновения жизненно необходимы. Например, отсутствие тактильных сенсорных стимулов в начале жизни отрицательно сказывается на росте и развитии нейронов (1). Кожа млекопитающих поражена множеством механорецепторных нейронов, которые различаются по своей чувствительности к механическим нагрузкам, динамике реакции и структуре (2, 3).Такое разнообразие делает ощущение прикосновения устойчивым, но также усложняет попытки расшифровать его биофизические, генетические и молекулярные основы. В то время как недавний анализ канала Piezo2 обеспечивает критическую отправную точку для будущих исследований (4–7) молекул, ответственных за прикосновение, в настоящее время мало что известно о том, как внешние механические нагрузки активируют каналы сенсорной механоэлектрической трансдукции (MeT) у любого животного. . Еще меньше известно о том, как кожа передает и фильтрует механическую энергию.Чтобы исследовать эти вопросы, мы использовали экспериментальные преимущества нематоды Caenorhabditis elegans , в том числе возможность получать записи патч-кламп целых клеток от идентифицированных механорецепторных нейронов у живых животных.

Взрослые особи Гермафродиты C. elegans , как известно, имеют пять классов механорецепторных нейронов, которые демонстрируют удивительно похожие паттерны быстро адаптирующихся и почти симметричных включенных и выключенных МТ-токов в ответ на приложенные механические нагрузки (см.8). В четырех классах, включая нейроны рецептора прикосновения (TRN), такие токи зависят от натрия и чувствительны к амилориду. Генетическая диссекция связывает эти токи MeT с DEG / ENaC (дегенерин / эпителиальный натриевый канал) белками в TRNs (9⇓⇓⇓-13) и мерцательным ноцицептором (14⇓-16). Транзиторный белок рецепторного потенциала выполняет роль механорецепторов пятого класса, которые функционируют как сенсор текстуры (9, 17–20). Оба типа ионных каналов также участвуют в ощущении прикосновения и боли у личинок Drosophila (9, 11, 14, 21–25).В совокупности эти наблюдения предполагают, что ни один класс белков не отвечает за формирование сенсорных каналов MeT и что свойства быстрой адаптации и симметричных ответов включения и выключения не связаны однозначно с одним классом канальных белков.

Самое раннее понимание механизмов быстрой адаптации появилось в результате работы над тельцем Пачини у млекопитающих в 1960-х гг., В котором их быстрые и симметричные реакции были связаны с луковичной пластинчатой ​​капсулой, которая покрывает его специализированное нервное окончание (9, 11–13, 19, 26⇓⇓ – 29).Было предложено, чтобы эта многослойная вспомогательная структура функционировала как чисто механический фильтр (14, 17, 30) или как механохимический фильтр, воплощенный в петле обратной связи, в которой считается, что ГАМКергические сигналы от ламеллярной капсулы подавляют потенциалы действия во время устойчивого стимула ( 12, 13, 16, 18, 20, 25, 28). Но быстро адаптирующиеся токи MeT обнаруживаются в других сенсорных афферентах млекопитающих, таких как те, которые, как считается, иннервируют тельца Мейснера и волосяные фолликулы (см. Ссылки 8, 31).Более того, все механорецепторные нейроны в C. elegans лишены дополнительных структур, аналогичных тельце Пачини, но они все же обнаруживают быструю адаптацию. Таким образом, быстро адаптирующиеся нейронные реакции не зависят от специализированных дополнительных структур.

Быстрая адаптация может быть автономным и внутренним свойством каналов MeT или свойством системного уровня, которое зависит от организации таких каналов в их естественной среде. Piezo2 необходим для быстрой адаптации вызванных прикосновением токов в клетках Меркеля в фолликулах усов (32⇓ – 34) и приводит к быстро адаптирующимся, механически активируемым каналам при экспрессии в гетерологичных клетках (35, 36), наблюдения согласуются с внутренними или клеточно-автономными механизмы.Подобным образом и как отмечалось выше, каналы, зависящие от DEG / ENaC MeT белка MEC-4, быстро активируются и адаптируются к устойчивым механическим нагрузкам в своих естественных условиях (12, 37). В отличие от каналов Piezo2, однако, MEC-4-зависимые каналы являются конститутивно активными (26, 38), когда экспрессируются в гетерологичных клетках. Это последнее наблюдение согласуется с идеей, что механическая активация и динамика ее ответа отражают не только внутреннюю механочувствительность MeT каналов, но также механику системного уровня и свойства материала иннервируемой ткани.

Мы рассудили, что усилия по различению внутренних механизмов и механизмов системного уровня будут ускорены с помощью инструментов, которые могут прикладывать механические нагрузки и измерять их влияние на деформацию тканей и ток через мембрану параллельно в условиях, которые поддерживают целостность всей сенсорной системы. . С этой целью мы разработали FALCON (приложение механических нагрузок с обратной связью в сочетании с нейрофизиологией in vivo), систему, которая сочетает управляемую с обратной связью механическую стимуляцию с записью патч-зажима целых клеток in vivo.Управление с обратной связью по усилию достигается с помощью настраиваемых чувствительных к усилию кремниевых микрокантилеверов со встроенными пьезорезистивными датчиками деформации (39⇓ – 41). Эта система может работать либо в зажиме смещения, обеспечивая определенные смещения при измерении приложенной силы, либо в зажиме усилия, создавая определенные силы при измерении приложенного смещения (32, 34, 42, 43). Как мы показываем здесь, полученные данные о приложенной механической силе, вдавливании тела и вызванных токах MeT позволяют детально исследовать физические параметры, которые управляют активацией TRN, а также проводить количественное физическое моделирование.

Независимо от того, передают ли мы силу или смещение, системы механической стимуляции, используемые нами и другими для исследования токов MeT в C. elegans , не имеют контроля с обратной связью (12, 13, 16, 18, 20, 44). Подобные системы с разомкнутым контуром широко используются для анализа соматосенсорных нейронов млекопитающих (45, 46) и не могут различать изменения амплитуды стимула и адаптацию канала, независимо от того, представлены ли стимулы как приложенная сила или смещение стимулятора.FALCON обходит это ограничение, комбинируя механическую стимуляцию с замкнутым контуром с регистрацией мембранного тока in vivo целыми клетками (рис. 1 и рис. S1).

Быстрая адаптация не зависит от подачи стимула или метода рассечения. ( A ) Экспериментальная подготовка и интеграция с системой FALCON для одновременной механической стимуляции с обратной связью и записи патч-кламп. Минимальная диссекция обнажает только тело клетки переднего сенсорного рецептора (ALM) ( Left ), а препарат щелевого червя обнажает гонады, кишечник и тело клетки ALM ( Center ).На микрофотографии показано положение микрокантилевера относительно тела клетки ALM (, справа, ). ( B ) Схематическое изображение поперечного сечения тела червя и положения TRN относительно кутикулы, эпидермиса, мышцы стенки тела и микрокантилевера. ( C ) Подготовка щелевого червя снижает жесткость тела по сравнению с процедурой минимального рассечения (синий, n = 21 мягкий червь; красный, n = 4 жестких червя). Кривые показывают взаимосвязь между силой и вдавливанием отдельных червей.( D — F ) Следы репрезентативной силы ( F ), вдавливания ( z ) и мембранного тока ( I ) для записи в жестком червяке, вызванном одноступенчатым протоколом с принудительным зажимом ( D ) и в мягком червяке, вызванном одноступенчатым протоколом с принудительным зажимом ( E ) и зажимом смещения ( F ). Пунктирными линиями показаны де свертки ползучести вдавливания ( E , τ = 34 мс) и релаксации силы ( F , τ = 45 мс), наблюдаемых у мягких червей во время принудительного зажима и зажима смещением. записи соответственно.Аналогичные результаты были получены в общей сложности 2 и 21 записи от мягких червей, проанализированных при смещении и силовом зажиме, соответственно, и 4 записях от жестких червей, проанализированных при силовом зажиме. Каждая запись представляет собой среднее значение от 10 до 14 испытаний.

Схема для FALCON. Эта система обеспечивает одновременную управляемую с обратной связью доставку произвольных механических нагрузок с помощью самочувствительного пьезорезистивного кантилевера, интегрированного с оборудованием для регистрации in vivo целых клеток с помощью патч-клампа.( A ) Схема системы. ( B ) Жесткость и собственная частота (измеренные в воздухе) консолей, использованных в этом исследовании. ( C ) Схема системы управления схемой управления FALCON.

Здесь мы используем эту систему, чтобы показать, что токи TRN MeT увеличиваются с вдавливанием тела, неприложенной силой и со скоростью стимуляции, и мы разрабатываем механическую модель, которая воспроизводит основные динамические особенности активации тока MeT in vivo.

Результаты

Механические нагрузки вызывают быстро адаптирующиеся «включенные» и «выключенные» токи MeT независимо от режима доставки или жесткости ткани.

Сначала мы спросили, как на текущую адаптацию MeT повлияли изменения в механике тела червя. Чтобы ответить на этот вопрос, мы подготовили червей, используя две процедуры вскрытия, стратегия, позволяющая нам сравнивать токи MeT в двух различных механических режимах. Первой процедурой была стандартная процедура рассечения с помощью щелевого червя, которая высвобождает часть гонад и кишечника, чтобы снизить внутреннее давление и облегчить успешное рассечение тел нейрональных клеток (10, 47). Второй — это недавно разработанная процедура вскрытия, которая лучше сохраняет физическую целостность нематоды, обнажая только интересующее тело нейрональной клетки (48–50) (рис.1 А ). Мы прикладывали механические нагрузки, совместив стеклянную микросферу, прикрепленную к кончику кантилевера, с верхней поверхностью животного, которая была его левой стороной (рис. 1 A и B ). В результате процедуры рассечения с помощью щелевого червя были получены черви, которые на ~ 60–90% мягче, чем те, которые были получены с помощью менее инвазивной процедуры рассечения (рис. 1 C ), которые имели среднюю эффективную жесткость 1,1 ± 0,3 Н / м ( среднее ± стандартное отклонение, n = 4). Это значение аналогично измеренным ранее для иммобилизованных или свободно перемещающихся интактных животных (12, 42, 51, 52).Для краткости мы называем червей, полученных с помощью щелевой червячной процедуры, «мягкими», а червей, полученных путем менее инвазивной диссекции, — «жесткими».

Независимо от метода рассечения и жесткости тела (рис. 1 D и E ) или от того, подавались ли стимулы под действием силового зажима или смещения зажима (рис. 1. E и F ), токи MeT быстро адаптируются. и активируется в ответ на приложение и снятие механических нагрузок. Например, в записях, полученных от жестких и мягких червяков, подвергнутых большим механическим нагрузкам, связанным с усилием, средняя постоянная времени для адаптации тока MeT составляла 23 мс ( n = 2, F = 5 мкН) и 24 ± 11 мс. (среднее ± стандартное отклонение, n = 21, F = 1 мкН) соответственно.Средняя постоянная времени адаптации токов MeT, вызванных большими механическими нагрузками, ограниченными смещением, составляла 22 мс ( n = 2, мягкие червяки, x _t = 5 мкм). Эти значения аналогичны тем, о которых сообщалось ранее при использовании методов механической стимуляции без обратной связи (12, 13, 44, 53). Важно отметить, что эти скорости адаптации отделены от скорости стимуляции, потому что время нарастания замкнутого контура было намного быстрее, чем адаптация тока MeT во всех случаях, варьируясь от 4 мс ( n = 2, жесткие черви под зажимом силы, F = От 5 мкН) до 6 ± 2 мс (среднее ± стандартное отклонение, n = 19, мягкие червяки под смещением зажима, F = 1 мкН) до 8 мс ( n = 2, мягкие червяки под смещением зажима, x _t = 5 мкм).Эти наблюдения показывают, что быстрая адаптация сохраняется при механической стимуляции с обратной связью и при фундаментальном изменении основной механики тела методом рассечения.

Динамика механики тела, однако, зависела от метода подготовки. У мягких червей вдавливание, необходимое для поддержания постоянной силы, увеличивается с течением времени, это механический процесс, известный как ползучесть (рис. 1 E , Middle ). Средняя постоянная времени для ползучести составляла 25 ± 11 мс (среднее ± стандартное отклонение, n = 21 запись от мягких червей) при F = 1 мкН, по оценке деконволюции ответа с профилем стимула ( методы ) .Усилие, необходимое для поддержания постоянного вдавливания, уменьшилось (ослабление силы; Рис.1 F , Top ) со средней постоянной времени 35 мс ( n = 2 мягких червяка, x _t = 5 мкм). Однако ползучесть вдавливания не наблюдалась в записях от жестких червей (рис. 1 D ). Поскольку скорости адаптации тока MeT были одинаковыми как у жестких, так и у мягких червей, ползучесть вдавливания и релаксация сил, которые наблюдались только у мягких червей, не могут объяснить быструю адаптацию тока MeT.

MeT Амплитуда тока зависит от вдавливания, неприложенной силы.

Установив процедуры для анализа токов MeT в различных механических режимах, мы использовали эту манипуляцию, чтобы определить, увеличивается ли амплитуда тока MeT с приложенной силой или индуцированным вдавливанием. Концептуально мы полагаемся на тот факт, что данная сила связана с большим вдавливанием в мягких червях по сравнению с жесткими червями. Как показано на рис.2, мы обнаружили, что жесткий механический режим смещает среднюю точку кривых силы тока (I-F) в сторону более высоких сил ( F _1/2 = 3.0 мкН и 0,38 мкН для жестких и мягких червей соответственно), а также значительно снижает чувствительность к силе. (Наклоны δ _F подогнанных кривых IF составляли 0,21 и 1,55 для мягких и жестких червяков, соответственно.) Напротив, средняя точка и наклон кривых (Iz) с отпечатком тока были неразличимы. между двумя механическими режимами. (Средние точки, z _1/2 , подобранных функций составляли 2,4 мкм и 2,9 мкм у жестких и мягких червей, соответственно, а наклоны δ _z были равны 1.4 и 1.3 для мягких и жестких червей соответственно.) Таким образом, амплитуда тока MeT увеличивается пропорционально вдавливанию тела, а не приложенной силе. Этот результат согласуется с нашим недавним исследованием поведенческой чувствительности у C. elegans (42) и предполагает, что вероятность ответа на нежное прикосновение зависит от амплитуды тока MeT. Как отступы на теле могут активировать каналы MeT? Простая модель состоит в том, что вдавливание вызывает деформацию и что именно эта деформация служит проксимальным физическим стимулом для активации собственных каналов MeT внешними механическими нагрузками.Такая модель предсказывает, что каналы MeT чувствительны к скорости приложенного стимула. Ниже мы тестируем эту модель экспериментально, а также аналитически путем разработки физической модели.

MeT чувствительны к вдавливанию тела. ( A и B ) Следы силы ( F ), вдавливания ( z ) и тока ( I ) для записей от мягкого (синие следы) и жесткого (красные следы) червя, стимулированного под воздействием усилие зажима между 0.05 и 6 мкН. Аналогичные результаты получены в общей сложности на 21 мягком и 4 жестких червях. Каждая запись представляет собой среднее значение от 10 до 14 испытаний. ( C ) Пиковый ток увеличивается пропорционально силе, но зависимость кажущейся силы отличается у мягких ( n = 18, синий) и жестких ( n = 2, красный) червяков. ( D ) Пиковый ток увеличивается пропорционально вдавливанию как у мягких (синий), так и у жестких (красный) червяков. Данные взяты из тех же записей, что и в C . Плавные линии в C и D — это функции Больцмана, соответствующие данным; заштрихованная область показывает 95% доверительный интервал соответствия.Коэффициенты подбора для зависимости силы в C составляют F _1/2 , сила, необходимая для полумаксимальной активации, и δ _F , наклон кривой, и имеют следующие значения: F _1/2 = 0,38 мкН и δ _F = 2,13 для мягких червей; F _1/2 = 3,0 мкН и δ _F = 1,55 для жестких червей. Коэффициенты подгонки для отступа в D равны z _1/2 , отступ, необходимый для полумаксимальной активации, и δ _z , наклон кривой, и имеют следующие значения: z _{1 / 2} = 2.9 мкм и δ _z = 1,40 для мягких червей; z _1/2 = 2,4 мкм и δ _z = 1,25 для жестких червей.

Токи MeT активируются в ответ на быстрые, но не медленные механические стимулы.

Затем мы спросили, как на активацию канала MeT влияет изменение скорости механической стимуляции. Мы разработали профили стимулов с постепенным нарастанием и удержанием, в которых фиксированное вдавливание производилось с переменной скоростью и быстро удалялось. Быстрое смещение обеспечивает положительный контроль наличия функциональных каналов MeT, тогда как переменная скорость начала проверяет чувствительность к скорости активации MeT.Мы обнаружили, что медленные линейные изменения не смогли активировать токи MeT, даже несмотря на то, что установившееся углубление, полученное в этих экспериментах, было достаточным, чтобы вызвать устойчивые отключенные токи одинаковой амплитуды во всех случаях (рис. 3 A ), предполагая, что, в отличие от Escherichia coli MscS (54, 55), эти каналы не инактивируются молча в ответ на низкоскоростную стимуляцию. Таким образом, TRN C. elegans и их MeT-каналы чувствительны к скорости стимуляции.

TRN C. elegans чувствительны к скорости и частоте стимула. ( A ) Сила ( F ), вдавливание ( z ) и ток ( I ), зарегистрированные в мягком червяке в ответ на стимулы ускорения и удержания, подаваемые под зажимом смещения ( n = 1 червь). ( B ) Регистрация силы, вдавливания и тока в мягком червяке в ответ на синусоидальные стимулы, подаваемые под действием зажима силы. Аналогичные результаты были получены в общей сложности в четырех записях от мягких червей.( C ) Спектры мощности токов, вызванных синусоидальными стимулами, приложенными к TRN в мягком червячном зажиме под действием силы. Выдающиеся пики на 6, 20 и 60 Гц соответствуют частотам стимула 3, 10 и 30 Гц соответственно и иллюстрируют, что TRN генерируют нелинейные сигналы, которые пропорциональны структуре динамических входов. ( D ) Чувствительность токов MeT в зависимости от частоты стимула. Чувствительность определяется как пиковая амплитуда тока, деленная на приложенную силу (от пика до пика) или достигнутое вдавливание, и имеет единицы пА / мкН (или пА / мкм) перед нормализацией к значению при максимальной приложенной частоте.Данные были объединены из четырех записей мягких червей, стимулированных принудительным зажимом на указанных частотах.

Кроме того, мы определили реакцию на синусоидальные профили нагрузки, которые варьировались по частоте от 1 до 300 Гц и приложили силы, достигающие максимальной размах 1,96 ± 0,02 мкН (среднее ± стандартное отклонение, n = 4) при низкие частоты, но уменьшаются по амплитуде на высоких частотах (Рис. 3 B , Top ). В соответствии со скоростной зависимостью, наблюдаемой в ответ на стимулы с нарастанием и удержанием, стимулы, подаваемые на частотах менее 3 Гц, не вызывали какого-либо заметного изменения мембранного тока (рис.3 B , Нижняя ). Однако при 100 Гц значительно меньшая размах силы 0,45 ± 0,04 мкН (среднее ± стандартное отклонение, n = 4) давала устойчивый и устойчивый внутренний ток. На промежуточных частотах и ​​размахе амплитуды ток MeT демонстрировал колебания значительной мощности на удвоенной частоте стимула (рис. 3 B и C ). Взятые вместе, эти результаты показывают, что TRN являются датчиками вибрации, нечувствительными к низкочастотной (<3 Гц) механической стимуляции (рис.3 D ).

Биофизические модели симметричных и быстро адаптирующихся токов MeT.

Охарактеризовав, как токи MeT реагируют на динамические механические нагрузки, мы использовали эти экспериментальные результаты для разработки механической модели, чтобы углубить наше понимание и ответить на вопросы о физике активации каналов MeT. Общие элементы модели показаны на рис. 4 A и B , а концептуальная и математическая формулировка физической модели подробно описана в методах и SI методах .Эвристически считается, что приложение механических нагрузок к коже вызывает зависящую от времени деформацию в вязкоупругих тканях, которые охватывают TRN, и гипотетический вентильный элемент связывает каналы MeT с этими вязкоупругими тканями. Для удобства мы называем стробирующий элемент филаментом и отметим, что роль, которую играет эта филамент, также может выполняться за счет взаимодействий между MeT-каналом и фосфолипидным бислоем. Дифференциальные смещения между MeT-каналами и их нитями приводят к удлинению волокон, которое пропорционально скорости вдавливания, и такое удлинение способствует открытию канала ( SI Methods ).Как только каналы MeT открываются, модель утверждает, что силы упругости и вязкости (трения) возвращают соединенные волокна в их расслабленную форму, закрывая каналы и обеспечивая быструю адаптацию. Эта модель предлагает объяснение быстрой адаптации, симметрии между реакциями включения и выключения (рис.1 C — E и 4 C и D ) и удвоением частоты в ответ на синусоидальные стимулы. (Рис.3 B и C ).

Реконструкция динамики отклика MeT-токов с помощью физической модели TRN как вязкоупругих механических фильтров. ( A ) Схема, показывающая силы, ортогональные оси вдавливания. ( B ) Схема, показывающая один из возможных вариантов реализации модели: канал MeT, связанный через эластичную нить с якорем (красный шар), который может перемещаться через вязкий внеклеточный матрикс. Система находится в состоянии покоя, и канал MeT закрыт на верхней и нижней панелях.Движение сверху по часовой стрелке: внутренние силы, возникающие в результате внешней деформации, вызывают поперечный сдвиг между внеклеточным матриксом и якорем, растягивая нить и активируя канал; вязкоупругие силы возвращают нить в ее расслабленную форму, что приводит к адаптации и последующему закрытию канала MeT; внутренние силы, возникающие при снятии внешней деформации, вызывают латеральный сдвиг внеклеточного матрикса и якоря, растягивая нить и активируя канал; наконец, вязкоупругие силы завершают цикл симметрично.( C ) Сравнение экспериментальной и теоретической реакции на механическую нагрузку, приложенную при силовом зажиме. Показаны (сверху вниз) измеренное вдавливание, прогнозируемые вероятности состояния канала MeT как функция времени во время стимуляции, измеренные (зеленый) и прогнозируемые макроскопические токи MeT (черный). Параметры модели SLS описаны в третьей строке таблицы S1. ( D ) Набор измеренных (зеленый) и прогнозируемых (черный) токов MeT, вызванных синусоидальными эпохами, выбранными из записей в мягком червяке.Параметры модели как в C . ( E ) Токи MeT, вызванные произвольным профилем стимула (зеленый), и отклик, предсказанный с использованием тех же параметров модели, что и в C и D (черный).

Когда упругие и вязкие силы представлены обычно используемой стандартной линейной твердотельной моделью (SLS) (9, 11), модель точно предсказывает экспериментально наблюдаемые токи MeT, вызванные импульсными механическими стимулами у мягких червей (рис. 4 ). C и рис.S2). Поскольку модель также явно включает взаимосвязь между механическими нагрузками и средней вероятностью того, что каналы MeT будут закрыты или войдут в субпроводимость и полностью открытые состояния, ее также можно использовать для прогнозирования взаимосвязи между механическими нагрузками и состояниями каналов (рис. 4 C , Средний ). Временной масштаб и профиль прогнозируемых откликов адаптирующегося тока являются результатом как динамического взаимодействия трех основных состояний MEC-4-зависимого канала MeT — одного закрытого непроводящего состояния и двух открытых, проводящих состояний (14) — и вязкоупругого механические параметры модели (см. методы и SI методы ).В то время как моделирование включало открытые и закрытые состояния, они не включали неактивированные состояния, потому что они не были необходимы для учета адаптации MeT и не обнаруживались экспериментально. Затем мы бросили вызов модели, чтобы воспроизвести реакцию, генерируемую синусоидальными стимулами, и общий набор параметров в равной степени был способен предсказывать токи, вызванные этими более сложными профилями механической нагрузки (рис. 4 D ). Мы также спросили, может ли модель воспроизвести реакцию на произвольные профили стимулов, такие как показанный на рис.4 E . Тесное соответствие между предсказанным ответом (черный) и экспериментальными наблюдениями (зеленый) подчеркивает надежность модели.

Сравнение измеренных и смоделированных токов, вызванных множеством различных форм сигналов вдавливания. ( A ) Импульсы вдавливания. ( B ) Быстрые (, слева, ) и медленные (, справа, ) стимулы нарастания. ( C ) Синусоидальные стимулы 1–100 Гц. На каждой панели верхние кривые показывают профиль стимула, а нижние кривые показывают токи механорецепторов, измеренные при -60 мВ (темно-зеленый) и теоретический прогноз модели SLS (уравнение. S16 , черный). Пунктирными линиями показаны ожидаемые верхний и нижний пределы прогнозируемого тока, основанные на 1 SD, оцененном по формуле. S13 и типичное количество 25 активированных каналов. Эта запись (169) относится к мягкому червю и также показана на рис. S4 – S6.

Единый набор оптимизированных параметров (см. Таблицы S1 и S2) воспроизводил совокупность данных, собранных от каждого мягкого червя (Рис. 4 и Рис. S2 и S3), открытие, которое предполагает, что свойства, которые определяют реакцию отдельного червя прикосновения фиксированы и не зависят от типа применяемого механического стимула.Чтобы дополнительно проверить эту идею, мы использовали оптимизированные параметры импульсных механических стимулов для предсказания синусоидальных стимулов, стимулов с линейным нарастанием и удержанием и произвольных стимулов, и мы обнаружили близкое соответствие между предсказанным ответом и экспериментальными наблюдениями (рис. S4). Кроме того, когда мы предсказали теоретический отклик для одного червя, используя параметры, оптимизированные для другого червя, мы обнаружили близкое общее согласие между ними (рис. S3). Таким образом, существует высокая степень согласованности между оптимальными наборами параметров модели для отдельных мягких червей, несмотря на различия в жесткости тела, возникающие во время процедуры вскрытия (рис.1 С ).

Оптимальные параметры, полученные при подгонке экспериментальных данных записи 169 к различным вязкоупругим моделям, представленным в тексте

Оптимальные параметры, полученные путем подгонки экспериментальных данных записи 173 к различным вязкоупругим моделям, представленным в тексте; Структура строк и обозначения такие же, как в Таблице S1

Различия в теоретических предсказаниях, полученных на основе разных записей. ( A и C ) Формы сигналов стимула.( B и D ) Токи механорецепторов, измеренные при -60 мВ в записи 173 (темно-зеленый) по сравнению с предсказаниями модели SLS (уравнение S16 ) с использованием оптимальных параметров для записи 173 (черный, вверху, модель 173) и полученные из оптимальных параметров записи 169 (ярко-зеленый, внизу, модель 173). В то время как прогнозы, полученные на основе оптимальных параметров для самой записи 173, явно имеют более высокое качество, общее поведение согласуется даже с параметрами, оптимизированными для другой записи 169.Эта запись (173) сделана мягким червем и также показана на рис. S7.

Прогнозы с параметрами модели, полученными из реакции на импульсы вдавливания, воспроизводят реакцию на более сложные формы волн стимуляции. ( A ) Синусоидальные стимулы ( верхний ), вызванные токи (темно-зеленый, нижний ) и прогнозируемый ответ (черный, нижний ). ( B ) Стимул нарастания и удержания (, верх, ), вызванные токи (темно-зеленый, , нижний ) и прогнозируемая реакция (черный, , нижний ).( C ) Произвольный профиль стимула (, верх, ), вызванные токи (темно-зеленый, , нижний ) и прогнозируемый ответ (черный, , нижний ). Экспериментальные данные взяты из записи 169, которая также показана на рис. S2, S5 и S6.

Наши теоретические прогнозы также устойчивы в отношении некоторых деталей моделирования. Так называемая модель Кельвина, модель SLS в пределе исчезающей памяти о силе трения (9), уже в значительной степени отражает отклик канала MeT (рис.S5 – S7). Кроме того, хотя три состояния канала (закрытый, полностью открытый и субпроводимость) были введены для согласования экспериментальных наблюдений каналов, содержащих MEC-4 (14), токи MeT уже хорошо воспроизводятся более простой моделью с двумя состояниями, включающей одно закрытое и одно открытое состояние (рис. S6 и S7). В частности, конститутивная активность, наблюдаемая на фиг. 3 B или 4 D на высоких частотах синусоидальной стимуляции присутствует в обеих моделях. Действительно, при высокой частоте стимула переходы между различными конформационными состояниями больше не следуют входному стимулу (рис.S6 и S7), а инерция каналов MeT делает состояния заселенными примерно постоянными долями.

Сравнение токов механорецепторов с прогнозами, полученными на основе различных моделей. ( A ) Формы сигналов стимула, применяемые с помощью FALCON. ( B ) Токи механорецепторов, измеренные при -60 мВ (темно-зеленый), по сравнению с прогнозами, полученными на основе вязкоупругих моделей, обсуждаемых в основном тексте. Прогнозы, полученные с использованием модели SLS (уравнение S16, , черный), очень похожи на предсказания, данные моделью, включающей производные вдавливания более высокого порядка (уравнение. S18 , пурпурный). Улучшение совпадения экспериментальных трасс и прогнозов отражает лучшее описание быстрых изменений в динамике. Экспериментальные данные взяты из записи 169, которая также показана на рис. S2, S4 и S6.

Прогнозы, полученные на основе модели Кельвина (уравнение S2 ) с двумя или тремя конформационными состояниями для каналов MeT (запись 169). ( A ) Формы сигналов стимула, применяемые с помощью FALCON. ( B ) Токи механорецепторов, измеренные при -60 мВ (темно-зеленый), и прогнозы, полученные на основе модели Кельвина (уравнение. S4 ) с двумя конформационными состояниями (открытое и закрытое) и тремя конформационными состояниями (открытое, субпроводящее, закрытое) в пурпурном и черном цветах соответственно. Экспериментальные данные взяты из записи 169, которая также показана на рис. S2, S4 и S5.

Прогнозы, полученные на основе модели Кельвина (уравнение S4 ) с двумя или тремя конформационными состояниями для каналов MeT (запись 173). ( A ) Формы сигналов стимула, применяемые с помощью FALCON. ( B ) Токи механорецепторов, измеренные при -60 мВ (темно-зеленый), и прогнозы, полученные на основе модели Кельвина (уравнение. S4 ) с двумя конформационными состояниями (открытое и закрытое) и тремя конформационными состояниями (открытое, субпроводящее, закрытое) в пурпурном и черном цветах соответственно. Экспериментальные данные взяты из записи 169, которая также показана на рис. S3.

Полоса пропускания FALCON была ограничена необходимостью вручную настраивать коэффициенты усиления контроллера для оптимальной доставки заданного стимула и сложностью перенастройки во время записи ( методы ). Это ограничение помешало нам полностью исследовать диапазон частотной характеристики C.elegans TRN и экспериментального тестирования того, ведет ли вся система себя больше как высокочастотный или полосовой механический фильтр. Тем не менее, поскольку физическая модель близко соответствует имеющимся экспериментальным данным (рис. 4 и 5), мы можем использовать модель для размышлений о механическом фильтре, который формирует отклик C. elegans TRN на изменяющиеся во времени синусоидальные механические нагрузки. (т.е. вибрация). Общие соображения относительно пассивных вязкоупругих материалов предполагают, что сила, необходимая для создания вдавливания кутикулы фиксированной амплитуды, должна увеличиваться с частотой на высоких частотах (9, 12, 13, 19, 26, 28).В этом сценарии ожидается, что амплитуда образовавшихся вмятин будет уменьшаться по мере увеличения их частоты. Это уменьшение амплитуды вдавливания в сочетании с неспособностью медленно движущихся стимулов активировать токи могло бы вызвать отклик полосового фильтра. Рис. 5 A показывает экспериментальные результаты вместе с моделями, основанными на этом сценарии. В моделировании, но не в экспериментах, мы также можем задаться вопросом, как вся механическая система работает в условиях, в которых приложенная максимальная сила не зависит от частоты стимула.Как показано на Рис. 5 B , этот анализ показывает, что вдавливание уменьшается с частотой и что пиковый ток и чувствительность этого препарата достигают максимальных значений при 150 и 725 Гц соответственно. Моделирование также показывает, что ток колеблется в два раза выше входной частоты и что амплитуда таких колебаний уменьшается с частотой (Рис. 5 C ). Одна из моделей, объясняющих это наблюдение, заключается в том, что на высоких частотах каналы находятся в открытых состояниях и редко посещают закрытые состояния.Мы отмечаем, что эти рассуждения о механической фильтрации у мягких животных не принимают во внимание различия в жесткости тела среди людей или активные механизмы модуляции жесткости тела во время сенсорных стимулов, которые наблюдались у других животных (например, ссылка 30) и которые могли бы обеспечивают механизмы на уровне организма для регулирования частотной зависимости ощущения прикосновения.

Экспериментально-вычислительное исследование АЧХ тактильных ощущений у мягких животных.( A ) Моделирование с использованием параметров, оптимизированных для соответствия ответам на механические стимулы (рис. 4), воспроизводит экспериментальные ответы на синусоидальные стимулы в репрезентативной записи от мягкого червя. В таблице S1 (третья строка) перечислены параметры для модели SLS. Показаны (сверху вниз) приложенная сила (от пика к пику), результирующее вдавливание (от пика к пику), пиковый ток и чувствительность (пА / мкм). Сплошные черные линии показывают экспериментальные результаты репрезентативной записи; сплошные синие линии показывают результаты, объединенные по четырем записям; пунктирные черные линии показывают моделирование; а заштрихованные области указывают на ошибки измерения и моделирования.Приложенная сила уменьшается с частотой из-за ограничений устройства FALCON. ( B ) Моделирование механической и физиологической реакции на приложенную силу до 3 кГц. Параметры модели как в A . Показаны (сверху вниз) приложенная сила (пик), результирующая вмятина (пик), пиковый ток и чувствительность (пА / мкм). Вдавливание уменьшается с частотой в результате свойств механической системы, несмотря на постоянную амплитуду приложенной силы. ( C ) Моделирование вдавливания и токов, вызванных синусоидальными силовыми стимулами.Параметры модели такие же, как у A и B . Экспериментально установлено, что частота колебаний тока примерно в два раза превышает частоту стимула, за исключением высоких частот, когда большие колебания тока уменьшаются.

Обсуждение

Представленная здесь динамика ответа характерна для других быстро адаптирующихся механосенсорных нейронов, включая ноцицепторов C. elegans и Drosophila (12, 13, 16, 18, 20, 25) и нейронов, иннервирующих пачиниан и Тельца Мейснера и волосяные фолликулы у млекопитающих (см.31, 56). Тот факт, что сходная динамика ответа обнаруживается в типах и в сенсорных нейронах, которые радикально различаются по своей морфологии, убедительно свидетельствует о том, что это свойство возникает из общего физического механизма. Важно отметить, что представленная и проверенная здесь модель требует только канала, который реагирует и адаптируется к окружающей среде посредством вязкоупругой динамики. Несколько молекулярных вариантов осуществления совместимы с нашей моделью, например, одиночные или множественные эластичные нити, привязанные непосредственно к каналу MeT или к структуре, которая перекрывает путь проникновения ионов, который отодвигается латерально деформациями кожи.Более того, такие филаменты могут быть прикреплены к внеклеточному матриксу или к цитоскелету. В настоящее время экспериментальные данные делают маловероятной прямую связь между каналом MeT и цитоскелетом микротрубочек в TRN (32, 34). Однако такая связь была предложена и охарактеризована для колоколообразных сенсилл у взрослых особей Drosophila, и мультидендритных ноцицепторов у личинок (35, 57). Наконец, предлагаемая нами вязкоупругая динамика может возникать из самой плазматической мембраны, что предполагает, что белковая привязка к каналу MeT может не быть необходимым элементом для стробирования в физиологических условиях.Наша модель совместима с этой моделью «силы от липидов» (37). Выявление микроскопической и молекулярной природы механического устройства потребует целенаправленных экспериментов для идентификации вязкоупругих элементов и определения того, как такие элементы взаимодействуют с MeT-каналами на месте. Представленные здесь данные и методы предоставляют инструменты для манипулирования ключевыми белками и наблюдения за их влиянием на механику и адаптацию.

Предлагаемый нами механизм устанавливает неожиданную связь между двумя различными механическими чувствами: осязанием и слухом.Система эластичных волокон напоминает аналогичные модели, первоначально предложенные для волосковых клеток (26), хотя и с одним существенным отличием. Быстро адаптирующиеся афференты симметрично реагируют на прикосновение как в начале, так и в момент смещения стимула (рис. 1 C — E и 4 C ). И наоборот, реакция волосковых клеток асимметрична по отношению к приложению силы, например, ответы наблюдаются только в начале стимуляции, указывающей на киноцилий пучка волос.Асимметрия обусловлена ​​контролируемой геометрией звеньев кончика и менее выражена в незрелых волосковых клетках, когда присутствует несколько звеньев кончика, а их направления все еще ориентированы случайным образом (39). Симметрия, наблюдаемая в TRN C. elegans , по прогнозам, возникает из-за механики вдавливания тонкой кутикулы и последующей деформации филаментов, которая возникает как в начале, так и при смещении стимуляции в противоположных направлениях, но со сравнимыми амплитудами. Однако остается открытым вопрос, сохраняется ли симметрия на уровне отдельных каналов MeT или она сохраняется только на уровне всего механорецепторного нейрона.Для схемы, показанной на рис. 4, отдельные каналы MeT будут показывать симметричные отклики включения-выключения, если, например, прикрепление нити к каналу может скользить по окружности канала. Тогда эта система будет по существу аналогична люку, перекрывающему канал и скользящему вбок при механической стимуляции. И наоборот, если бы точка прикрепления нитей была фиксированной, отдельные каналы MeT имели бы предпочтение в направлении стимуляции, а симметрия включения-выключения была бы макроскопическим свойством всего нейрона из-за случайного положения каналов и их предполагаемые филаменты вдоль нейрита (32, 34).Таким образом, в отсутствие структур, нарушающих симметрию, таких как те, что встречаются в волосковых клетках позвоночных, щетине насекомых или остевых волосах млекопитающих (28, 58), мы ожидаем, что системы, характеризующиеся соматосенсорными нейронами, встроенными в тонкие ткани, обычно будут включать и выключать симметрия в их сенсорных реакциях.

Как C. elegans может использовать чувствительность к деформации, скорости и вибрации? Давно известно, что C. elegans TRN участвуют в распознавании как нежного прикосновения к телу, так и нелокализованных механических нажатий (см.45). Черви меняют направление в ответ на переднее прикосновение, поведение избегания, которое позволяет им убегать от хищных грибов (47). Наши результаты показывают, что устойчивый ответ от C. elegans TRN требует краткого контакта с достаточной глубиной вдавливания. Этот временной и пространственный порог может гарантировать, что TRN не будут интерпретировать мелкие частицы, такие как бактерии, как отвращающие и уйти от потенциального источника пищи. Фильтрация низких частот также может позволить TRN игнорировать движения тела, которые включают частоты волнистости порядка 0.5 Гц при ползании по стандартным пластинам роста без еды (например, ссылки 48, 50). Таким образом, тонкая настройка системы может помочь TRN сосредоточиться на ответе на отталкивающие механические стимулы, оставляя при этом стимулы, такие как те, которые производятся структурой субстрата и самодвижением, другим нейронам механорецептора.

Методы

Штаммы и культура нематод.

Синхронизированные по возрасту нематод C. elegans выращивали на стандартных планшетах для выращивания OP50 при 20–22 ° C. Черви дикого типа представляли собой TU2769 [P mec-17 (uIs31) III ], интегрированный штамм, который использует промотор mec-17 для экспрессии GFP исключительно в TRN, которые проходят вдоль тела нематоды, как описано ранее. (12).

Электрофизиология.

Червей иммобилизовали на тонких подушечках из агарозы (2% вес / объем во внеклеточном солевом растворе) с помощью WormGlu (GluStitch). Наблюдения проводились на микроскопе Nikon Eclipse FN1, оснащенном оптикой Nomarski-DIC, водно-иммерсионным объективом 60 × / 1.0 N.A. и черно-белой камерой CCD (JAI CV-A55IR C). В большинстве экспериментов большая часть гонады и кишечника позади вульвы иссекалась для снятия внутреннего давления, как описано ранее (10).В некоторых экспериментах гонады и кишечник оставались на месте, как описано в ссылке. 49. Во всех экспериментах делали небольшой разрез непосредственно перед клеточным телом переднего нейрона рецептора прикосновения, ALM.

Все разрезы были выполнены с использованием острого стеклянного инструмента для рассечения, установленного на гидравлическом манипуляторе (Narishige MMO-203). Тело клетки и задний нейрит ALM остались нетронутыми и на месте, что подтверждается просмотром флуоресценции GFP. Насосы через глотку и движения головы использовались для определения того, что черви были живы во время записи.Все записи были получены от нейрона ALM на левой стороне тела со стимулирующим кантилевером, расположенным сразу после луковицы глотки, на расстоянии ∼150 мкм от тела клетки (рис. 1 A ). Другие нейроны сенсорных рецепторов были недоступны из-за геометрических ограничений, налагаемых положением стимулирующего кантилевера и записывающей головки с фиксатором.

Регистрирующие пипетки вытягивали из боросиликатного стекла до диаметра кончика 2–4 мм на съемнике для микропипеток P-97 (Sutter Instruments) и формировали путем полировки под давлением (59, 60).Пипетки имели сопротивление 6-17 МОм при заполнении физиологическим раствором (см. Ниже) и 20 мМ сульфородамина 101 (Invitrogen).

Ток и напряжение мембраны были усилены и получены с помощью усилителя EPC-10 и программного обеспечения Patchmaster (HEKA Instruments / Harvard Biosciences). Аналоговые данные оцифровывались с частотой 10 кГц и фильтровались с частотой 2,9 кГц. Регистрация целых клеток была достигнута комбинацией всасывания и короткого импульса напряжения («zap»), где успех был подтвержден путем мониторинга диффузии GFP в пипетку и сульфородамина-101 в тело клетки.

Внешний солевой раствор состоял из (в мМ): NaCl (145), KCl (5), MgCl ₂ (5), CaCl ₂ (1) и Hepes (10), pH доведен до 7,2 с помощью КОН. . Осмолярность всех внешних растворов доводили до ~ 325 мОсм с помощью 20 мМ D -глюкозы. Внутренний солевой раствор состоял из (в мМ): K-глюконат (125), KCl (18), NaCl (4), MgCl ₂ (1), CaCl ₂ (0,6), Hepes (1) и EGTA. (10), pH доводили до 7,2 с помощью КОН. Осмолярность внутриклеточных растворов составляла ~ 315 мОсм.Все химические вещества были закуплены у Sigma.

СОКОЛ.

Система FALCON сочетает в себе электрофизиологию патч-зажима с системой зажима-зажима. Система «усилие-зажим» похожа на системы, которые использовались ранее для характеристики механики тела и поведенческих реакций на прикосновение (5–7, 33, 36, 42, 43, 51, 52). Он обеспечивает управляемую обратной связью доставку заданных пользователем сил (или смещений) и состоит из пьезорезистивного кремниевого кантилевера, пьезоэлектрического привода со встроенным датчиком смещения тензодатчика (P-841.10, Physik Instrumente), и контроллер реального времени (National Instruments, программируемая вентильная матрица Compact Rio). Кантилеверы (ширина 30 мкм, длина 750 мкм, толщина 7 мкм) были изготовлены на микроорганизмах, как сообщалось ранее (8, 12, 40, 41, 43). Пьезорезистор служит встроенным тензодатчиком для измерения прогиба кантилевера; отклонение преобразуется в силу на основе калиброванной жесткости консольной пружины k _c . Консоли приклеивались к печатным платам (ширина 5 мм, длина 29 мм, 0.Толщиной 8 мм) с эпоксидной смолой (Devcon) и подключается к измерительной цепи через алюминиевые провода. В ходе этих экспериментов использовались пять кантилеверов, которые имели значения k _c от 0,773 до 0,868 Н / м и резонансные частоты в воздухе от 15,2 до 16,2 кГц (рис. S1 B ). Стеклянные микросферы (боросиликатное стекло диаметром 10 ± 1 мкм, ThermoFisher Scientific) прикрепляли к наконечникам кантилевера с помощью фотоотверждаемого акрилового клея (Loctite 352, Henkel) для создания определенной контактной поверхности.Наконец, алюминиевые проволочные соединения были покрыты эпоксидной смолой (Devcon), а затем 600 нм Parylene N (Specialty Coating Systems) были нанесены на каждое устройство. Этот последний шаг защищает электрические компоненты от воздействия физиологического раствора во время экспериментов. Печатная плата была изготовлена ​​из FR4 (модуль Юнга = 11 ГПа) и была на несколько порядков жестче кантилеверов ( k _PCB = 300 Н / м). Схема измерения состояла из консольного пьезорезистора, подключенного по схеме моста Уитстона, с двумя потенциометрами и резистором температурной компенсации.Смещение моста было установлено на 2 В, а его выход усилен в 1000 раз с помощью инструментального усилителя (INA103).

Пьезорезистивные кантилеверы крепились к пьезоэлектрическому приводу под углом 10 °. Поскольку устройство помещалось непосредственно над поверхностью червя перед каждым экспериментом, глубина вдавливания образца ( z ) была рассчитана как z = x _t — x _c , где x _t — это полное смещение привода, измеренное встроенным датчиком на приводе, а x _c — отклонение кантилевера, измеренное пьезорезистором.

Контроллер реального времени рассчитал и отрегулировал управляющее напряжение пьезоэлектрического привода, чтобы исправить ошибку между сигналом напряжения от пьезорезистивного кантилевера и желаемой уставкой. Обратная связь осуществлялась через контур управления, работающий на частоте 100 кГц. Контроллер был подключен к усилителю EPC-10 через систему цифрового ввода CompactRio и запускался цифровым сигналом от программного обеспечения Patchmaster (Harvard Bioscience) со временем задержки менее 2 мкс.Эта схема гарантировала, что система управления вырабатывала соответствующее командное напряжение привода для желаемого расстояния перемещения привода и приложенной силы. Система была откалибрована путем вдавливания предметного стекла и проверки выходного напряжения. Перед каждым экспериментом зонд располагался вне контакта с червем, мост Уитстона был сбалансирован, а усиление обратной связи регулировалось вручную для достижения самого быстрого времени нарастания с минимальным выбросом стимула в начале протокола стимуляции.

Анализ данных.

Емкость всей ячейки и последовательное сопротивление измеряли, как описано ранее (10, 12, 13, 38). Последовательное сопротивление не компенсировалось, а мембранное напряжение корректировалось с учетом потенциалов жидкого перехода, но не с учетом ошибок, возникающих из-за нескомпенсированного последовательного сопротивления. Анализ данных выполнялся с помощью Igor Pro (Wavemetrics) и MATLAB (MathWorks).

Из-за дрожания во времени доставки импульсов механического стимула было необходимо согласовать реплики постфактум и перед усреднением ответов на предъявление стимулов.Выравнивание было достигнуто путем максимизации взаимной корреляции между небольшими регионами в одной реплике и идентичными регионами внутри каждой из других реплик (всего 6-14 повторов в типичной серии). После правильного выравнивания усреднялись данные о силе, смещении и токе мембраны.

Чтобы оценить постоянные времени для активации и затухания канала MeT, мы аппроксимируем усредненные формы сигналов тока функцией I (t) = Gmax * (exp (-t / τ2) −exp (-t / τ1)) * (Vh − ENa ) + Io,

, где G _max — расчетная максимальная проводимость, V _h — удерживающий потенциал, E _Na — потенциал Nernst + для Na ионов в наших растворах, I _o — базовый ток, а τ ₁ и τ ₂ — постоянные времени активации и адаптации соответственно.Спад приложенной силы, наблюдаемый при смещении зажима, описывался одной экспонентой. Повышение вдавливания или ползучесть, наблюдаемое при стимуляции мягких червей под действием зажима с усилием, соответствовало двойной экспоненте, где первая постоянная времени представляла скорость приложения стимула, а вторая постоянная времени представляла скорость ползучести. Нормы были усреднены для одного большого стимула (1 мкН для мягких червей с принудительным зажимом, 5 мкм для мягких червей с принудительным зажимом и 5 мкН для жестких червей с принудительным зажимом).

Чтобы определить, как ток зависит от приложенной силы и вдавливания, пиковый ток был построен как функция силы или вдавливания, и полученные кривые были подогнаны с помощью функции Больцмана f (x) = Imax / (1 + exp ((X50-x ) / δ)),

, где I _max — расчетный максимальный ток мембраны, X ₅₀ — расчетная половина максимального усилия или вдавливания, а δ — наклон, который контролирует крутизну кривой. . Затем данные были нормализованы к прогнозируемому I _max и объединены по записям, полученным в аналогичных условиях в отношении процедуры вскрытия (жесткая, мягкая).

Чтобы оценить скорость ползучести вдавливания в мягких червях, мы деконволюционировали временной ход вдавливания с временным ходом приложенной силы. Чтобы соответствовать диапазону вдавливаний, создаваемых для силы 1 мкН, мы ввели нелинейность, которая увеличивается с вдавливанием (15, 16, 40, 41). Точно так же, чтобы оценить скорость релаксации силы в мягких червях, мы деконволюционировали график силы во времени с примененным курсом времени вдавливания.

Средние значения везде представлены как среднее ± стандартное отклонение. Статистический анализ выполнен с помощью IgorPro (Wavemetrics).

Моделирование активации каналов MeT.

Здесь мы описываем физические составляющие модели, разработанной для анализа и прогнозирования реакции TRN C. elegans; математическая формулировка модели подробно описана в SI Methods . Мы предположили, что каждый канал MeT в плазматической мембране TRN связан с механическими единицами (называемыми для простоты «якорями») через эластичные нити (рис. 4 B ). На рис. 4 B нить и якорь встроены во внеклеточный матрикс, но аналогичные результаты были бы получены, если бы эти элементы были встроены в другое место.Когда поверхность нематоды деформируется, в кутикуле возникает деформация (рис. 4 A ), и мы ожидаем, что такая деформация вызовет дифференциальные смещения между каналами и их якорями. Тонкость кутикулы (по сравнению с ее латеральным протяжением) диктует, что деформация, возникающая в результате вдавливания, перпендикулярного поверхности червя, наиболее сильна в тангенциальной плоскости (17⇓⇓ – 20, 42, 43). В результате эластичные нити вытянуты в противоположных направлениях, но с примерно симметричными амплитудами в начале и смещении стимула на поверхности нематоды (рис.4 A и B ). Две дополнительные силы определяют динамику систем нить / якорь: (–) сила Гука, возникающая в результате удлинения упругой нити, которая стремится восстановить расстояние релаксации нити; и ( ii ) силы трения между внеклеточным матриксом и системой филамент / якорь, которые сопротивляются их относительному движению. Мы представили комбинацию сил упругости и трения с моделями, обычно используемыми для вязкоупругих материалов (9, 11–13, 16, 18, 20–25, 44).В частности, модели Кельвина и SLS дают уравнения и результаты, представленные в основном тексте и в SI Methods . Модель Кельвина содержит пружину, установленную параллельно приборной панели, тогда как модель SLS содержит пружину, параллельную модулю Максвелла, который сам является еще одной пружиной, соединенной последовательно с приборной панелью (9, 11, 27, 29, 46).

Кроме того, мы предположили, что активация каналов MeT следует за функцией Больцмана от удлинения их связанных нитей.Предыдущие экспериментальные наблюдения показали, что каналы MeT, содержащие MEC-4, принимают несколько открытых и закрытых состояний, включая заметное состояние субпроводимости (10, 14, 17). Следовательно, мы предположили, что каналы переходят между своими закрытыми и открытыми состояниями через третью конформацию с промежуточной проводимостью и что скорости переходов между этими конформационными состояниями соблюдают детальный баланс. Как подробно описано в SI Methods , допущения позволяют использовать экспериментальные профили вдавливания в качестве входных данных для получения прогнозируемых токов MeT.Затем мы сравнили экспериментальные кривые, чтобы они соответствовали параметрам нашей модели, и получили результаты, представленные здесь.

SI Методы

Количественная модель активации механорецепторных токов in vivo и ее приложение к сенсорному ощущению.

Мы разработали теоретическую модель, которая связывает внешние нагрузки с активацией каналов MeT в нейронах рецептора касания C. elegans . Концептуальная основа этой модели представлена ​​в основном тексте; здесь мы разрабатываем аналитическую и вычислительную основу модели и обсуждаем, как она была получена, реализована и использована для восстановления экспериментальных результатов.Вкратце, модель предполагает, что вдавливание тела вызывает боковую деформацию в теле червя, которая передается в каналы MeT посредством упругой нити, и что натяжение в упругой нити контролирует вероятность открытия канала. Локальный механический стимул активирует несколько каналов, распределенных по длине сенсорного нейрона, так что их вероятность открытия зависит от расстояния между каждым каналом и местом стимула. Как обсуждается ниже, мы использовали приближение среднего поля для упрощения модели с учетом влияния расстояния от точки контакта.Для конкретности мы сосредоточимся на конкретной микроскопической модели, в которой каналы связаны с якорем во внеклеточном матриксе. Отметим, однако, что наши результаты являются общими и совместимы с другими микроскопическими возможностями, такими как якоря в цитоскелете или искажение плазматической мембраны без какого-либо якоря, действующего как механический преобразователь.

Динамика нити канал – якорь.

Мы утверждаем, что каждый канал MeT через эластичную нить соединен с механическим узлом, который мы называем «якорем».«Приложение силы к поверхности C. elegans создает углубление глубиной ζ (t) и деформирует его кутикулу, которую мы рассматриваем как вязкоупругую среду. Учитывая, что кутикула представляет собой тонкую оболочку, следует, что доминирующая составляющая упругого напряжения возникает в плоскости, ортогональной отпечатку при умеренных деформациях (19). При больших деформациях доминирующий компонент напряжения остается локализованным в плоскости, локально касательной к поверхности червяка, которая изменяется, хотя при движении по поверхности (61).Мы ожидаем, что каналы MeT и их якоря будут смещены относительно друг друга в результате их различных вязкоупругих свойств. Эластичные нити, соединяющие каналы MeT с якорем, удлинены, что, как мы предполагаем, увеличивает вероятность того, что каналы войдут в свою открытую (проводящую) конформацию и приведут к значительным токам механорецепторов, как описано ниже.

В частности, мы используем Xc, a для обозначения положения канала и анкера в отсутствие какой-либо деформации, xc, a (t) для обозначения их соответствующих смещений (которые зависят от исходных положений Xc, a) и S (X, t), чтобы указать смещение общей точки X в вязкоупругой среде, в которую встроен якорь.расстояния между каналом и якорем, которое предполагается постоянным на протяжении всего цикла стимуляции. Если направление изменится быстро, чего не будет в дальнейшем, потребуется многомерное описание динамики. В нижеследующем описании только первый член в разложении уравнения S1 достаточно, т. Е. Пружина гуковская, а сила упругости пропорциональна удлинению. Мы рассмотрели нелинейные члены в уравнении. S1 , и они не оказывают существенного влияния на результаты, представленные ниже.

Под действием пружины анкер перемещается относительно вязкоупругой среды, в которую он встроен. Их относительному движению противодействует сила трения ℱ, которая в простейшем приближении принимает вид = −γd (xa − S (X ′, t)) dt≃ − γd (xa − S (Xa, t)) dt. [ S2] Здесь Xa + xa = X ‘+ S (X’, t), то есть X ‘- недеформированное положение той точки в вязкоупругой среде, которая находится в текущем местоположении якоря Xa + xa (t).Для второго приблизительного равенства мы предполагаем, что дифференциальное смещение между каналом и анкером невелико по сравнению с типичным масштабом изменения длины S . Ожидается, что порядок величины последнего будет аналогичен радиусу вдавливающего шарика и толщине кутикулы, которая составляет микрометры для рассматриваемой здесь ситуации. Разница в формуле. S2 выше переписывается как xa (t) −xc (t) + xc (t) −S (Xa, t) ≃x (t) −χ (Xa) ζ (t), [S3], где x = xa− xc, дифференциальное смещение S (Xa, t) −xc (t) размерно пропорционально отступу ζ (t), а функция χ (Xa) зависит от положения покоя Xa (должным образом безразмерного).Чтобы упростить обозначения, мы опускаем дополнительные зависимости × от фиксированных параметров, таких как размер и форма вдавливающего тела, внутреннее давление недеформированного червяка, вязкоупругие параметры и т. Д., И мы предполагаем, что для уравнения. S4 ниже, основная составляющая временной зависимости хорошо улавливается линейным членом ζ (t).

Эффектом инерции обычно можно пренебречь в микроскопическом молекулярном мире, и обычно справедливо приближение сверхзатухания (62), которое влечет за собой приравнивание к нулю суммы сил.Используя уравнения. S1 — S3 , таким образом, окончательно получаем уравнение удлинения x = xa − xc: dxdt + 1τx = χdζ (t) dt, [S4], где τ = γ / k. Левая часть в уравнении. S4 описывает действие пружины параллельно с дроссельной заслонкой, которая известна как вязкоупругий модуль Кельвина (9, 11). Этого простого модуля уже достаточно, чтобы зафиксировать две основные особенности экспериментальных данных, представленных в основном тексте (рис. 1 и 2). Во-первых, внешнее вдавливание заставляет нить растягиваться пропорционально (dζ (t)) / dt, т.е.е., к производной отпечатка по времени. Таким образом, постоянное вдавливание не приведет к растяжению нити, тогда как резкое изменение вдавливания приведет к растяжению нити, которая затем расслабится из-за вязкоупругого комбинированного действия пружины и члена трения в формуле. S4 . Поскольку открытие каналов контролируется растяжением нити накала (см. Следующий раздел), модель естественным образом приводит к свойству адаптации, как показано на рис. 1 и 2. Кроме того, при приложении к поверхности силы C.elegans или облегчено, отступ (dζ (t)) / dt будет обратным, и x (t) изменит знак, но его модуль будет примерно таким же. Как мы подробно обсудим в следующем разделе, это свойство составляет основу симметрии в реакции на быстрое приложение и снятие механических нагрузок. Наконец, мы показываем в Сравнение с экспериментальными данными ниже, что уравнение простой модели. S4 (в сочетании с динамикой каналов, обсуждаемой в следующем разделе) выходит за рамки качественных аспектов отклика и также охватывает основные количественные аспекты.

Б. Динамика стробирования каналов MeT.

Ниже мы развиваем количественную зависимость между удлинением x в уравнении. S4 и вероятность того, что каналы находятся в открытых (проводящих) состояниях. MEC-4-зависимые каналы, ответственные за механорецепторные токи в рецепторах прикосновения, могут занимать закрытые, полностью открытые и промежуточные или субпроводящие состояния (14). Для простоты мы рассматриваем одно состояние субпроводимости и отмечаем, что этот подход обеспечивает отличную реконструкцию экспериментальных данных.Pc, Ps и Po — вероятности нахождения в закрытом, субпроводящем или открытом состоянии соответственно; Rji — это скорость перехода из состояния j в состояние i . Тогда динамика конформации канала определяется выражением {dPcdt = −Pc Rcs + Ps Rsc, dPsdt = Pc Rcs − Ps (Rsc + Rso) + Po Ros, dPodt = Ps Rso − Po Ros. [S5] Предполагая, что каналы соответствуют законам статистической физики равновесия, отношение двух вероятностей в состоянии равновесия Pieq и Pjeq задается фактором Больцмана Pieq / Pjeq = exp [−βΔGij], где ΔGij = Gi − Gj — разность свободной энергии между состояния i и j , β = 1 / kBT, T — термодинамическая температура, kB — постоянная Больцмана (см.г., исх. 62). Отсюда следует, что скорости перехода удовлетворяют соотношениям RcsRsc = e − βΔGsc, RsoRos = e − βΔGos. [S6] Наконец, для равновесных значений трех вероятностей Pc, Ps и Po получаем: Pseq = 11 + e − βΔGos + e − βΔGcs, Poeq = 11 + e − βΔGco + e − βΔGso, Pceq = 1 − Poeq − Pseq. [S7]

Чтобы лучше понять влияние этой конкретной модели канала на количественные прогнозы, мы также исследовали более простая модель, которая не учитывала субпроводимость и включала одно открытое и одно закрытое состояние.Уравнения, управляющие Pc и Po, аналогичны уравнению. S5 и уравнение. S6 .

Средний ионный ток через единственный канал определяется выражением j = Poio + Psis, где is и io представляют максимальные токи в субпроводимости и открытой конформации, соответственно; ток в замкнутом состоянии равен нулю. Средний макроскопический ток, протекающий через весь нейрон, представляет собой сумму токов, протекающих по его каналам, то есть I = ∑kjk, [S8], где jk — ток канала k -го.Для совокупности N идентичных каналов ожидаемое количество элементов в открытом состоянии и состоянии субпроводимости и соответствующий полный ток равны 〈ns〉 = N Ps, 〈no〉 = N Po, 〈I〉 = N [isPs + ioPo] , [S9] где ns, o — количество каналов в субпроводимости и открытой конформации, соответственно.

Две экспериментальные оценки одноканального тока доступны для каналов C. elegans MeT, смоделированных здесь. Первая оценка получена из стационарного анализа шума in vivo (12), вторая — из одноканальных записей MEC-4-зависимых каналов, экспрессируемых в гетерологичных клетках (14).Мы используем значение одноканальных токов, согласующееся с обоими экспериментальными измерениями: -1,6 ± 0,2 пА. В то время как одноканальная проводимость фиксирована, ожидается, что количество каналов, активируемых во время данного механического воздействия, будет переменным. В частности, вероятность нахождения в открытом состоянии будет варьироваться в зависимости от положения канала относительно точки стимуляции. Экспериментальные данные показывают, что каналы локализуются в дискретных точках, распределенных вдоль нейрита, без явного базального / апикального смещения и что распределение межпунктовых интервалов приблизительно логнормально и со средним межпунктовым расстоянием около 2 мкм (32).Ожидается, что деформации тела червя, возникающие при механическом воздействии, будут сильнее в области, близкой к точке вдавливания. Отсюда следует, что различные каналы и их якоря будут подвергаться различным уровням механической стимуляции, которые отражены в формуле. S4 через зависимость функции χ от недеформированного положения Xa.

Следующее приближение [типа среднего поля, распространенного в статистической физике (19)] позволяет нам упростить модель и оценить сумму в уравнении. S8 . Зависимость χ от Ха в уравнении. S4 сокращается до двух возможных классов: набор каналов с уникальным ненулевым значением χ , а остальные из них имеют χ = 0, например, потому что они слишком далеко от точки вдавливания. Количество активных каналов (χ ≠ 0) зависит от следующих факторов. Точечное вдавливание упругой сферической оболочки приводит к профилям деформации с масштабированием растяжения как степенным законом вдавливания; см., например, ссылки.19, 63 для случая без внутреннего давления или с внутренним давлением, и аналогичное поведение имеет место для шара, вдавливающего цилиндр с внутренним давлением. Каналы в пределах типичной шкалы длины деформации (микрометры) обеспечивают верхнюю оценку количества активных каналов, которая достигается в результате быстрых вдавливаний. С другой стороны, мы физически ожидаем, что если окончательная деформация будет производиться медленно, количество активных каналов будет уменьшено. Поэтому ожидается, что количество активных каналов будет увеличиваться по мере изменения вдавливания и уменьшаться в некоторых типичных временных масштабах релаксации, сравнимых с динамикой филамента, т.е.е., чтобы иметь поведение, подобное | x | как определено в предыдущем разделе. Это замечание предполагает, что вместо того, чтобы вводить независимую динамику с набором дополнительных параметров, мы могли бы экономно использовать | x | в качестве заместителя числа активных каналов и введите логарифмический член в разность свободной энергии между закрытыми и открытыми формами каналов: βΔGoc = xh− | x | xs − p log (| x |), [S10] с (положительная) экспонента p оставлена ​​как подгоночный параметр. Логарифмический член в уравнении. S10 вводит зависимость | x | p в отношении Po / Pc, т. Е. Увеличивает истощение каналов в открытом состоянии и оставляет их закрытыми при малых удлинениях (малых | x |). Первый член в правой части уравнения. S10 — это стандартная форма Больцмана, которая способствует линейному открытию канала по мере удлинения нити накала. Две константы xh и xs являются свободными параметрами, которые также поглощают член, делающий логарифм безразмерным. Зависимость формы Больцмана от | x | для описания наблюдаемого симметричного ответа нейрона на приложение и снятие механических нагрузок.Наконец, свободная энергия состояния субпроводимости может априори иметь функциональную зависимость и / или параметры, отличные от уравнения. S10 , но, опять же, чтобы минимизировать свободные параметры, мы делаем предположение, что его свободная энергия является промежуточной между закрытым и открытым состояниями ΔGos = aΔGoc; ΔGsc = (1 − a) ΔGoc, [S11] с единственным параметром 0≤a≤1.

Обратите внимание, что подход среднего поля резко снижает сложность проблемы: совокупность многих каналов заменена одним «эффективным» каналом, который реагирует на стимулы, кодируемые удлинением прикрепленной к нему нити эффективным потенциалом. Уравнение S10 , который включает свойства отдельных каналов и всего их ансамбля. В частности, ток, протекающий через нейрон, эквивалентен току, переносимому по единственному эффективному каналу, то есть средний ионный ток (уравнение S8 ) определяется выражением I = PoIo + PsIs, [S12], где Io и Is являются максимальные токи в открытом и субпроводящем состоянии эффективного канала соответственно. Максимальный ток I0 нашего эффективного канала примерно равен произведению максимального тока i0 для одного реального канала, умноженного на количество каналов, которые подвергаются максимальной стимуляции для наших условий подготовки и стимуляции.Сравнивая значения Io, которые мы сообщаем в таблицах S1 и S2, с экспериментальным значением io = -1,6 пА, упомянутым выше для одиночных каналов, мы заключаем, что наш эффективный канал включает в себя проводимость около N≃15-30 реальных каналов. Этот диапазон качественно согласуется с количеством активированных каналов, оцененным в предыдущей работе (12). Обратите внимание, что это число, как ожидается, будет варьироваться в зависимости от условий подготовки и стимуляции, а именно от максимального расширения поля деформации в экспериментальной установке, используемой для стимуляции животного.Связь Is со значениями, измеренными экспериментально (14), менее прямая. Это связано с тем, что Is не относится к состоянию, однозначно идентифицируемому, например, к максимальному значению тока, протекающего через нейрон, в случае Io. В частности, оценка Is чувствительна к промежуточным значениям тока, протекающего через нейрон, который в действительности представляет собой совокупность нескольких каналов, занимающих различные состояния проводимости. В нашей обработке среднего поля совокупность каналов фиксируется только эффективно, и значение Is, таким образом, связано с динамикой вероятностей Pc, s, o.

Оцененные выше значения N не влияют ни на одно из последующих прогнозов, которые включают средний ток и, следовательно, значения Io и Is. В частности, значение N = 25 использовалось только для построения доверительных интервалов наших прогнозов через ожидаемую дисперсию тока, оцененную как σI2 = 1N [Is2Ps (1 − Ps) + Io2Po (1 − Po) −2Is IoPsPo. ]. [S13]

В заключение отметим, что при выводе свободной энергии мы предполагали зависимость от | x | для обеспечения симметричной реакции на приложение и снятие механических нагрузок.Остается неизвестным, сохраняется ли симметрия на уровне отдельных каналов MeT или является макроскопическим свойством ансамбля каналов, которые украшают нейроны рецептора прикосновения. Для модели, схематически изображенной на рис. 4 основного текста, первая ситуация была бы реализована, если бы точка прикрепления нити к каналу могла скользить по окружности канала. Тогда эта система будет по существу аналогична люку, перекрывающему канал и скользящему вбок при механической стимуляции.И наоборот, если бы точка прикрепления нитей была фиксированной, отдельные каналы MeT имели бы предпочтение в направлении их стимуляции; симметрия реакции ансамбля будет восстановлена ​​как следствие случайного положения каналов и их нитей вдоль нейрита. На уровне среднего тока нейрона несимметричный случай аналогичен симметричному с меньшей плотностью каналов вдоль нейрита.

Дополнительные вязкоупругие модели.

Чтобы улучшить качество теоретических предсказаний, мы представляем две дополнительные модели вязкоупругого взаимодействия между деформацией тела и активацией канала. Эти модели связаны с быстрыми изменениями внешних нагрузок, которые должны исследовать тонкую структуру вязкоупругой динамики. Вкратце, мы обнаружили, что в то время как уточненные вязкоупругие модели действительно улучшают описание экспериментальных данных, более простая модель Кельвина фиксирует основные закономерности.

Член трения, введенный в уравнение. S2 предполагает мгновенный отклик среды. В действительности обычно требуется конечное время, и простейшая модель, отражающая этот эффект, следующая: (v (t)) = — γ∫ − ∞tK (t − u) v (u) du, [S14] где K — это ядро трения, а v (t) — относительная скорость объекта, движущегося в вязкоупругой среде. Ниже мы покажем, что ядро ​​вида K (t) = 1ηe− (t / η), [S15] приводит к стандартной вязкоупругой линейной модели (9, 11) и согласуется с нашими экспериментальными данными. Если память ядра пренебрежимо мала относительно характерного времени изменения v , тогда уравнение трения S14 сводится к уравнению.(s) из x (t). Это выражение для стандартной модели линейного твердого тела (SLS) (также известной как обобщенная модель Максвелла – Вихерта в простейшем варианте с двумя элементами, пружиной параллельно модулю Максвелла, т. Е. Еще одной пружиной, включенной последовательно с приборной панелью. ) (9, 11). Как обсуждалось выше, модель SLS сводится к контрольной точке, параллельной пружине, то есть модулю Кельвина, когда память о фрикционном члене незначительна (9, 11).

Интегральное уравнение. S16 решается путем введения вспомогательной переменной m (t) = ∫ − ∞tK (t − u) [x (u) −χ ζ (u)] du, интегрирования по частям и использования экспоненциальной формы Eq. S15 для получения дифференциальных уравнений {dm (t) dt = −1τ + η [m (t) + χζ (t)], x (t) = ττ + η [m (t) + χζ (t)] . [S17] Подтверждено, что свойство адаптации и двухпозиционная симметрия отклика, которые обсуждались в Динамика нити канал-якорь выше для уравнения. S4 для модели SLS Ур. S16 тоже.

Вязкоупругие модели, более сложные, чем модуль Кельвина и модель SLS, включают рациональные функции более высокого порядка по переменной Лапласа и обычно исследуют производные более высокого порядка по времени (9, 11).Как обсуждалось, мы также ожидаем, что дифференциальные смещения и функция χ в уравнении. S3 имеют некоторую зависимость от скорости вдавливания. Эти дополнительные условия могут сильно повлиять на прогнозы, например, для протоколов стимуляции, которые включают экстремальные временные колебания. Чтобы оценить эти эффекты и надежность наших прогнозов, мы записали (и сравнили результаты с предыдущими моделями) следующую общую вязкоупругую модель: σ1d2xdt2 + dxdt + 1τx = χ (dζ (t) dt + σ2d2ζ (t) dt2), [ S18], который содержит производные по времени до второго порядка.Параметры τ , σ1 и σ2 в уравнении. S18 — три независимые постоянные времени. Эта структура уравнения. S18 можно получить, моделируя вязкоупругое взаимодействие между якорем и средой с помощью приборной панели последовательно с модулем Кельвина (9, 11) и заменяя уравнение. S3 через xa (t) −S (Xa, t) ∼x (t) — (χ (Xa) ζ (t) + χ1 (Xa) (dζ (t) / (dt)) +…), что учитывает возможные вязкоупругие зависимости от истории внешнего воздействия. Уравнение S18 затем получается с использованием приближения сверхдемпфирования, сохраняя производные по времени до второго порядка и изменяя масштаб константы первой производной.

В заключение, мы ожидаем от сравнения между моделями уравнений. S4 , S16 , и S18 , что любые исправления или улучшения модели будут относительно незначительными, по крайней мере, для доступных в настоящее время профилей стимуляции. Таким образом, преждевременно рассматривать эффекты высшего порядка и нелинейные эффекты, что объясняет природу модельного уравнения. S18 и тот факт, что мы использовали уравнение модели SLS. S16 для прогнозов, показанных в основном тексте.

Сравнение с экспериментальными данными.

Мы оценили способность теоретических моделей восстанавливать динамику отклика тока MeT следующим образом. Прогнозы в основном тексте были получены путем оптимизации параметров по всему ансамблю форм сигналов стимула, применяемых во время данной записи. Затем мы проверили надежность прогнозов, варьируя модель и параметры, например, мы спросили, насколько хорошо параметры модели, полученные из реакции на импульсы вдавливания, могут воспроизводить ответы на сигналы произвольной формы и на синусоидальную стимуляцию.Наиболее строгое сравнение было проведено для двух записей (идентифицированных по их лабораторным индексам 169 и 173), в которых был получен полный набор данных, включая реакцию на серию импульсов вдавливания, синусоидальных стимулов и стимулов с изменением и удержанием. Таким образом, мы сосредотачиваемся на этих двух наборах данных и демонстрируем ниже, что модель достаточно надежна, чтобы параметров, полученных из одной записи, было достаточно, чтобы уловить основные особенности другой записи.

Вывод параметров моделей.

Для всех вязкоупругих моделей, представленных выше, параметр χ может быть установлен на единицу путем изменения масштаба x и переопределения параметров xh и xs, появляющихся в уравнении. S10 . Что касается скоростей конформационных переходов, скупая форма, соблюдая подробные уравнения баланса ограничений. S 6 и S11 isRsc = rcse (1 + b) (1-a) βΔGoc; Rcs = rcseb (1-a) βΔGoc; Ros = rsoe (1 + d) aβΔGoc; Rso = rsoedaβΔGoc. [S19] Здесь rcs (rso) управляет скоростью переходов между закрытым и субпроводящим состояниями (субпроводимостью и открытым состоянием), а параметры b и d управляют их глобальным сдвигом относительно вариациям разности свободных энергий.Поскольку ожидается, что вероятность открытия каналов будет расти с | x |, параметры b , d ограничены диапазоном −1≤b≤0.

Параметры моделей выводятся из сравнения с экспериментальными кривыми с использованием функции оптимизации lsqcurvefit , доступной в MATLAB. Оптимизация находит параметры, которые лучше всего воспроизводят данные, , а именно ., Дают расстояние по методу наименьших квадратов между прогнозируемым и наблюдаемым профилями тока.Эта процедура дала параметрам различных моделей значения, показанные в таблицах S1 и S2 для записей 169 и 173, соответственно.

Результаты.

Прогнозы для модели SLS Ур. S16 находятся в основном тексте. Здесь мы приводим дополнительные кривые на рис. S2 и S3 для записей 169 и 173 соответственно. Один набор параметров используется для соответствия ансамблю кривых, то есть линейным изменениям, шагам и синусоидам для каждой из двух записей. Оптимальные параметры модели различаются между двумя записями, как и ожидалось, исходя из различий в механических свойствах вскрытых животных (рис.1 С ). Несмотря на это изменение, точная настройка не потребовалась, и значения для двух наборов параметров аналогичны. Принимая во внимание многомерный характер набора параметров, лучшая демонстрация представлена ​​на рис. S3, где мы вычислили отклик записи 173, используя оптимальные параметры для записи 169, и сравнили результат с экспериментальными кривыми для запись 173. Несмотря на то, что некоторое расхождение очевидно, общее согласие очень хорошее и подтверждает согласованность двух наборов параметров.

Соответствующее замечание к кривым на рис. S2 и S3 — это насыщение ответа на высоких частотах, то есть тот факт, что ответ не следует за стимуляцией и устанавливается на постоянный уровень. В основном это связано с инерционностью каналов; ожидаемые конформационные переходы не могут следовать за стимуляцией, когда его колебания слишком быстрые. Населения в конформационных состояниях каналов устанавливаются затем примерно до постоянных значений (с шумом).

На рис.S4, мы показываем, как параметры модели, полученные из реакции только на импульсы вдавливания, могут воспроизводить ответ на стимулы с нарастанием и удержанием и синусоидальную стимуляцию (для той же записи). Другими словами, мы оптимизируем параметры на подмножестве экспериментальных данных, а затем сравниваем прогнозируемый ток для остальных экспериментальных стимулов. Несмотря на то, что глобальная оптимизация дает лучшее описание, прогнозы явно совместимы с экспериментами.

Далее мы сравним качество прогнозов для различных моделей Eqs. S4 , S16 и S18 . Мы обнаружили, что в обеих записях характеристики моделей схожи, а различия можно увидеть только в тонкой структуре кривых. Некоторые репрезентативные графики показаны на рис. S5 для записи 169. Для ясности мы сообщаем только результаты SLS, как модели Кельвина и SLS в уравнениях. S4 и S16 дают практически одинаковые результаты. Это согласуется с тем фактом, что предполагаемое время запоминания η составляет порядка 10-5 с, т.е.е., примерно на 2 порядка быстрее, чем в любой временной шкале экспериментальных стимуляций. Общая модель второго порядка Eq. S18 немного улучшает качество прогнозов. В частности, мы наблюдаем, что реакция на шаги лучше отражает резкие изменения стимуляции и ближе к экспериментальным результатам по сравнению с другими моделями. Однако различия относительно незначительны и не вполне достаточны, чтобы количественно охарактеризовать характер поправок к основным уравнениям модели. S4 и S16 . Для этого потребуется экспериментальная установка следующего поколения, которая в настоящее время находится в стадии разработки, с более расширенным набором данных для однократной записи, более высокими частотами стимуляции и уменьшенным шумом приборов, чтобы точно измерить слабые токи, генерируемые медленными стимуляциями.

Наконец, сравним на рис. S6 и S7 результаты для модели Кельвина с двумя или тремя конформационными состояниями. Для обеих записей 169 и 173 прогнозы с тремя состояниями дают немного лучшее соответствие, но основное поведение уже зафиксировано моделью с двумя состояниями (с меньшим количеством параметров).Суть в том, что поведение различных вязкоупругих моделей относительно похоже, и полученные прогнозы для имеющихся профилей стимуляции устойчивы по отношению к деталям моделей.

Благодарности

Мы благодарим Валерию Васкес, Александра Ганьона, Фредерика Луазо и Сильвию Фехнер за вклад и Zhiwen Liao за техническую поддержку. Изготовление проводилось на Стэнфордском предприятии по нанотехнологиям, которое поддерживается Национальным научным фондом через Национальную сеть инфраструктуры нанотехнологий (грант ECS-9731293).A.L.E. был поддержан премией Рут Л. Киршштейн (F32NS065718) и B.C.P. была поддержана стипендиями для аспирантов Национального научного фонда. Стэнфордский университет оказал поддержку NIH (грант R01NS07715 для M.B.G. и грант R01EB006745 для M.B.G. и B.L.P.).

Сноски

• Вклад авторов: A.L.E., B.L.P. и M.B.G. спланированное исследование; М.В. разработанные теоретические исследования; A.L.E. проведенное исследование; В ВИДЕ. проведены теоретические и вычислительные исследования; Б.C.P., S.-J.P. и B.L.P. внесение новых устройств / инструментов; A.L.E. и M.B.G. проанализированные данные; и A.L.E., A.S., B.C.P., M.V., B.L.P. и M.B.G. написал газету.

• Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

• Эта статья представляет собой прямое представление PNAS.

• Эта статья содержит вспомогательную информацию на сайте www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1514138112/-/DCSupplemental.

Доступен бесплатно в режиме онлайн через опцию открытого доступа PNAS.

Морфомеханика супраструктур человеческого коллагена, выявленная с помощью полностью оптической корреляционной микроспектроскопии

Подготовка образца

Это исследование было проведено в соответствии с принципами Хельсинкской декларации. Здоровые роговицы человека были приобретены в Veneto Eye Bank Foundation (Венеция, Италия) после отбора среди тех, которые не подходят для трансплантации. После сбора образцы хранились в растворе для консервации тканей (CARRY-C, Alchimia srl, Падуя, Италия) не более трех дней с момента доставки, а затем обрабатывались в соответствии с протоколом, обеспечивающим сохранение их механической целостности и морфологии ⁵² .Сначала образцы фиксировали в течение 24 часов в фосфатно-солевом буфере с 4% параформальдегидом и промывали тем же буфером перед подготовкой к визуализации. Затем роговичную пуговицу отделяли от склеры с помощью Barron Donor Cornea Punche (Katena Products, Inc., Корт Денвилл, Нью-Джерси, США) и вставляли в самодельную камеру, сделанную путем смещения двух стеклянных покровных стекол, запечатанных клеем и заполненных фосфатом. забуференный физиологический раствор для поддержания физиологической осмолярности. Один образец, представленный на дополнительном рисунке 1, был проанализирован перед любым протоколом фиксации.

Чтобы точно отобразить одно и то же поле зрения с помощью SHG, Бриллюэна и рамановской микроскопии, с помощью лазерной абляции на эпителии роговицы был выжжен характерный узор из меток, как показано на рис. 5a). Каждая метка была нанесена как фототермическое повреждение при использовании мощности лазера около 30 мВт и при освещении области 10 × 10 мкм ² . Пространственное ограничение абляции и отсутствие повреждений нижележащей коллагеновой стромы было подтверждено путем получения стопки изображений в самой верхней строме, непосредственно под мембраной Боумена, с помощью ГВГ микроскопии (рис.5б). На рис. 5в показано объединение изображений на рис. 5а, б. Чтобы исследовать неповрежденную ткань роговицы и избежать любого возможного влияния процесса абляции, коррелятивное исследование ГВГ, комбинационного рассеяния света и Бриллюэна проводилось на расстоянии не менее 60 мкм в радиальном направлении и нескольких десятков микрон вдоль оптической оси от каждого реперного пятна.

, где d ₂₂ = χ _yyy , d ₁₅ = χ _xxz , d ₃₁ = χ _zxx , d 33 = χ _zzz , — элементы тензора восприимчивости второго порядка, α — угол между осью фибриллы и ориентацией поляризации, A — нормировочный коэффициент. Поскольку χ _yyy отклоняется от нуля и увеличивается по абсолютной величине по мере того, как тригональная симметрия возникает над цилиндрической (см. Следующий абзац), мы определили параметр симметрии, который отражает эту тенденцию.Для увеличения чувствительности этого параметра к супрамолекулярной симметрии коллагена мы использовали соотношение между модулем χ _yyy и χ _zxx , т.е. S = | d ₂₂ | / d _{31 =} | χ _ггг | / χ _zxx. Мы реконструировали карты S с пространственным разрешением, анализируя каждый пиксель.

Стек изображений P-SHG. Пример набора изображений P-SHG, взятых из образца роговицы человека, полученного с использованием сагиттальной геометрии оптического сечения.Направление поляризации изменяется с шагом 20 °, что схематично показано вставками с красными стрелками в правом верхнем углу изображений. Ориентация поляризации относительно горизонтальной оси изображения следующая: a 0 °, b 20 °, c 40 °, d 60 °, e 80 °, f 100 °, g 120 °, h 140 °, i 160 °, j 180 °. Поле зрения: 200 × 200 мкм ² . Разрешение: 1024 × 1024 пикселей ²

Математическая модель P-SHG

В нелинейной оптике оптические процессы второго порядка, такие как SHG, зависят от поляризации второго порядка, которая определяется уравнением:

$ $ P_i \ left ({2 \ omega} \ right) = 2 \ mathop {\ sum} \ limits_ {jk} \ mathop {\ sum} \ limits_ {nm} \ chi _ {ijk} \ left ({\ omega _n + \ omega _m, \ omega _n, \ omega _m} \ right) E_j (\ omega _n) E_k (\ omega _m), $$

(1)

Где ω _n и ω _m — две различные частоты падающего поля, χ _ijk — элементы тензора восприимчивости второго порядка χ ( i, j, k ), соответствующие к направлениям главных осей, E _j ( ω _n ) и E _k ( ω _n амплитуд) являются компоненты электрического поля на частоте ω _n и ω _m соответственно.

Для SHG ω _n = ω _m = ω и ω _n + ω _m = 2ω, так что уравнение для поляризации имеет вид:

$$ P_i \ left ({2 \ omega } \ right) = 2 \ mathop {\ sum} \ limits_ {jk} \ chi _ {ijk} \ left ({2 \ omega; \, \ omega, \ omega} \ right) E_j (\ omega) E_k. $ $

(2)

χ — это матрица ранга 3 из 27 элементов, которая может быть упрощена до матрицы из 18 ненулевых элементов из-за симметрии в последних двух индексах (поскольку ω _n = ω _m = ω в SHG) ⁵³

$$ \ left ({\ begin {array} {* {20} {c}} {P_x} \\ {P_y} \\ {P_z} \ end {array}} \ right) = 2 \ left ({\ begin {array} {* {20} {c}} {\ chi _ {xxx}} & {\ chi _ {xyy}} & {\ chi _ {xzz}} & {\ chi _ {xyz }} & {\ chi _ {xxz}} & {\ chi _ {xxy}} \\ {\ chi _ {yxx}} & {\ chi _ {yyy}} & {\ chi _ {yzz}} & { \ chi _ {yyz}} & {\ chi _ {yxz}} & {\ chi _ {yxy}} \\ {\ chi _ {zxx}} & {\ chi _ {zyy}} & {\ chi _ { zzz}} & {\ chi _ {zyz}} & {\ chi _ {zxz}} & {\ chi _ {zxy}} \ end {array}} \ right) \ left ({\ begin {array} {* {20} {c}} {E_xE_x} \\ {E_yE_y} \\ {E_zE_z} \\ {2E_yE_z} \\ {2E_xE_z} \\ {2E_xE_y} \ end {array}} \ right).$

(3)

В предыдущих исследованиях ^54,55 , сфокусированных на характеристике коллагеновых фибрилл в образцах роговицы, данные P-SHG были смоделированы с упрощенной формулой х , полученной из предположения о симметрии Клейнмана для коллагеновых фибрилл. Из этого условия следует свободная коммутируемость всех трех индексов i, j, k . Более того, предположение о цилиндрической симметрии в пространственном расположении гармонофор сокращает количество ненулевых членов ⁵⁶ .При этих предположениях χ принимает форму:

$$ \ left ({\ begin {array} {* {20} {c}} 0 & 0 & 0 & 0 & {\ chi _ {xxz}} & 0 \\ 0 & 0 & 0 & {\ chi _ {xxz}} & 0 & 0 \\ {\ chi _ {xxz}} & {\ chi _ {xxz}} & {\ chi _ {zzz}} & 0 & 0 & 0 \ end {array}} \ right). $$

(4)

Хотя симметрия Клейнмана часто предполагается для моделирования P-SHG-ответа коллагена, в нескольких приложениях было продемонстрировано, что ее достоверность не соответствует действительности ⁵⁷ .Причина этой неудачи в том, что в большинстве практических контекстов симметрия Клейнмана выполняется только частично. Это происходит, когда электронные резонансные частоты гармонофоров примерно на порядок меньше, чем частота возбуждения. Второе предположение также наиболее часто используется в экспериментах с P-SHG и основывается на симметрии пространственного распределения гармонофоров, которое предполагается цилиндрическим. Условие цилиндрической симметрии выполняется, когда фибриллы коллагена расположены в шахматном порядке бок о бок и параллельны друг другу ⁵⁸ .И наоборот, когда эта идеальная фибриллярная геометрия не соблюдается, предположение о цилиндрической симметрии немедленно не выполняется. Если фибриллы коллагена собираются в более общем геликоидальном распределении, тригональная симметрия (3 мкм) является более подходящей моделью для описания их ГВГ. Согласно гипотезе тригональной симметрии χ принимает новую форму:

$$ \ left ({\ begin {array} {* {20} {c}} 0 & 0 & 0 & 0 & {\ chi _ { xxz}} & {- \ chi _ {yyy}} \\ {- \ chi _ {yyy}} & {\ chi _ {yyy}} & 0 & {\ chi _ {xxz}} & 0 & 0 \\ {\ chi _ {zxx}} & {\ chi _ {zxx}} & {\ chi _ {zzz}} & 0 & 0 & 0 \ end {array}} \ right).$

(5)

Выражение [5] отличается от [4] элементом χ _yyy , который не равен нулю, и неравенством: χ _xxz ≠ χ zxx 929 . Элемент χ _yyy принимает ненулевое значение, которое увеличивается в абсолютном выражении по мере того, как тригональная симметрия преобладает над цилиндрической. Нарушение симметрии Клейнмана вместо этого означает, что χ _xxz ≠ χ _zxx .

Предполагая, что движущее поле распространяется вдоль x , коллагеновая фибрилла ориентирована вдоль z , а электрическое поле поляризовано вдоль направления, которое образует угол α по отношению к оси фибриллы, вектор электрического поля имеет вид:

$ $ E_z \ left (\ omega \ right) = E \ left (\ omega \ right) \ cos \ left (\ alpha \ right). $$

(6)

$$ E_y \ left (\ omega \ right) = E \ left (\ omega \ right) \ sin \ left (\ alpha \ right). 2 .2} \ right \}. \ End {array} $$

(15)

Подгоняя экспериментальные результаты к уравнению [15], мы можем исследовать различные свойства коллагена роговицы, то есть, достаточно ли резонансная частота гармонофоров выше частоты возбуждения, чтобы соответствовать условию Клейнмана и, что более важно, супрамолекулярная сборка коллагеновых фибрилл соответствует геликоидальному или ступенчатому расположению бок о бок.

Учитывая, что элемент χ _yyy принимает значение, отличное от нуля, поскольку тригональная симметрия преобладает над цилиндрической симметрией, наше определение S (S = | d ₂₂ | / d ₃₁ = | χ _yyy | / χ _zxx , подробности см. В предыдущем абзаце) подчеркивает нарушение цилиндрической симметрии и служит удобным показателем для измерения степени скручивания коллагеновых пластинок.Этот параметр полезен для характеристики супрамолекулярной симметрии коллагена роговицы и, в частности, для различения шовных пластинок, то есть класса ламелл коллагена, которые локализуются в передней части стромы роговицы в нормальной ткани человека, проходят в случайных направлениях и часто разветвляются и переплетаются неравномерно ³³ .

Мультимодальная установка для построения изображений Бриллюэна-Рамана

Мы использовали изготовленную на заказ микроспектроскопическую установку, способную одновременно выполнять визуализацию Бриллюэна и Рамана.На рисунке 5e схематически показана экспериментальная установка: источником света является одномодовый твердотельный лазер (Spectra Physics Excelsior, Spectra Physics K.K., Санта-Клара, Калифорния, США), излучающий одну продольную моду на длине волны 532 нм. Свет направлялся в конфокальный микроскоп (CM-JRS Scientific Instruments) и фокусировался на образец линзой объектива M-Plan Apo × 20 (Mitutoyo, Kawasaki, Япония) с очень большим рабочим расстоянием (WD = 20 мм) и числовая апертура 0,42, что дает пространственное разрешение на образце ~ 2 × 2 × 10 мкм ³ .

Линза объектива использовалась как для фокусировки, так и для сбора обратно рассеянного света, который отделялся в соответствии с его частотой настраиваемым ультракоротким короткопроходным фильтром (TEF, SP01-561RU, Semrock Inc., Рочестер, Нью-Йорк, США). ). Антистоксова квазиупруго рассеянная составляющая передавалась на интерферометр Фабри – Перо TFP-2 HC (JRS Scientific Instruments, Table Stable Ltd., Mettmenstetten, Швейцария), в то время как стоксово глубоко неупруго рассеянный свет отражался в сторону трехаксиального рамановского спектрометра iHR320. (RM-Horiba Ltd., Киото, Япония). TFP-2 HC — это высококонтрастный вариант оригинального тандемного многопроходного интерферометра типа Sandercock, обеспечивающий беспрецедентную контрастность более 10 ¹⁵ с разрешением по частоте 100 МГц.

Для построения 2D-изображений спектры комбинационного рассеяния света и Бриллюэна были получены из каждой точки путем пошагового перемещения образца с использованием трехосевого пьезоэлектрического преобразователя (PI 611-3 S Nanocube XYZ, Physik Instrumente (PI) GmbH & Co. KG, Карлсруэ , Германия) с разрешением 0.01 мкм и диапазон перемещения 100 мкм на ось. Для измерений Бриллюэна-Рамана время сбора данных составляло 65 с на точку, а мощность лазера на образце составляла около 10 мВт.

Сбор и анализ Бриллюэна-Рамана

Для выполнения последовательностей одновременных измерений Рамана / Бриллюэна, синхронизированных с позиционированием образца, была разработана специальная процедура с использованием программного обеспечения LabSpec 5 (Horiba Ltd., Киото, Япония) для получения спектров комбинационного рассеяния и JRS GHOST 7 (JRS Scientific Instruments, Table Stable Ltd., Метменштеттен, Швейцария) для спектров Бриллюэна.

Спектроскопия Бриллюэна изучает свет, рассеянный акустическими фононами, термически активированными в материале. По сути, спектры Бриллюэна состоят из пиков, симметрично смещенных по частоте относительно падающего света на величину, ω _b , которая относится к M ‘, то есть действительной части продольного модуля упругости, посредством уравнения ω _b = q (M ′ / ρ ) ^{0.2}}. $$}

(16)

где 2Γ _b — ширина пика.

Рамановская спектроскопия исследует свет, неупруго рассеянный меж- и внутримолекулярными колебательными модами химических веществ, присутствующих в образце. Благодаря своей высокой молекулярной специфичности, рамановская спектроскопия подходит для анализа химического состава материалов. Пиковые интенсивности пропорциональны концентрации молекулярных частиц, умноженной на их оптическую активность.Следовательно, зондирование модуляции пиковых интенсивностей в различных областях образца дает изображения с контрастом, связанным с молекулярным составом. Однако спектры комбинационного рассеяния не имеют внутреннего спектроскопического маркера для их нормализации. Для устранения возможных паразитных эффектов, связанных с (i) флуктуациями интенсивности лазера, (ii) небольшими различиями в оптическом поглощении образца и (iii) небольшими изменениями в объеме рассеяния, обычно используется пик нормализации. решение.Этот подход позволяет исследовать относительные изменения концентраций одного и того же химического вещества в разных точках образца или проследить относительные изменения концентрации между различными веществами. В нашем случае мы выбрали сигнал амида I в качестве пика нормализации, который стал золотым стандартом как для исследований IR ⁵⁹ , так и для исследований комбинационного рассеяния ⁷ . Анализ данных комбинационного рассеяния проводился с использованием специальных кодов Fortran и Matlab. Чтобы точно оценить площадь анализируемых пиков, из каждого сбора данных вычитался фон, снабженный сплайном, учитывающим темные подсчеты и слабую люминесценцию.

ТЕМ-визуализация

Образцы дополнительно получали с помощью просвечивающего электронного микроскопа CM12 (Philips, Амстердам, Нидерланды), работающего при 80 кВ и оснащенного камерой MegaViewG2 (Olympus Corporation, Токио, Япония). Для ПЭМ-визуализации образцы роговицы были разделены на 1 мм ² фрагментов площади поверхности, которые дважды промывали фосфатно-солевым буфером (0,1 М, pH 7,2), а затем фиксировали свежим глутаральдегидом (2,5%) в том же буфере при 4 ° C в течение 12 ч. Затем все образцы последовательно промывали трижды (15 мин) фосфатно-солевым буфером с последующей фиксацией тетроксидом осмия (1.0%) в том же буфере в течение 1 ч, дважды промывали тем же буфером (по 15 мин), обезвоживали 30, 40 и 50% этанолом в течение 10 мин, затем 70% этанолом в течение 20 мин, затем 80, 95% и чистый этанол в течение 10 минут и с чистым оксидом пропилена в течение 10 минут и, наконец, пропитан смолой Spurr ⁶⁰ . Ультратонкие срезы инфильтрированных образцов были собраны и нанесены на покрытые углеродом медные сетки с размером ячейки 200, окрашенные уранилацетатом в метаноле (50%) в течение 5 минут и цитратом свинца в течение 8 минут ⁶¹ .Цитрат свинца получали в соответствии с предписаниями Venable and Goggeshall ⁶² . Все процедуры отмывки проводили водой, не содержащей CO ₂ , при барботировании азота в течение 30 мин.

Сводка отчетов

Дополнительная информация о дизайне экспериментов доступна в Сводке отчетов по исследованиям природы, связанной с этой статьей.

Живем ли мы в симуляции? Шансы примерно 50–50

Нечасто, что комик вызывает у астрофизика мурашки по коже, обсуждая законы физики.Но комик Чак Найс сумел это сделать в недавнем выпуске подкаста StarTalk . Ведущий шоу Нил де Грасс Тайсон только что объяснил аргумент о симуляции — идею о том, что мы можем быть виртуальными существами, живущими в компьютерной симуляции. Если это так, симуляция, скорее всего, будет создавать восприятие реальности по запросу, а не моделировать всю реальность все время — во многом как в видеоигре, оптимизированной для визуализации только тех частей сцены, которые видны игроку. «Может быть, поэтому мы не можем путешествовать быстрее скорости света, потому что, если бы мы могли, мы бы смогли попасть в другую галактику», — сказала Найс, соведущая шоу, побудив Тайсона радостно прервать его.«Прежде, чем они смогут его запрограммировать», — сказал астрофизик, обрадовавшись этой мысли. «Итак, программист поставил этот предел».

Такие разговоры могут показаться легкомысленными. Но с тех пор, как в 2003 году Ник Бостром из Оксфордского университета написал основополагающую статью об аргументе моделирования, философы, физики, технологи и, да, комики боролись с идеей, что наша реальность является симулякром. Некоторые пытались определить способы, с помощью которых мы можем различить, являемся ли мы симулированными существами.Другие пытались вычислить вероятность того, что мы виртуальные сущности. Новый анализ показывает, что шансы на то, что мы живем в базовой реальности, то есть в существовании, которое не моделируется, в значительной степени равны. Но исследование также демонстрирует, что если бы люди когда-либо развили способность имитировать сознательные существа, шансы в подавляющем большинстве увеличились бы в пользу нас, являющихся виртуальными обитателями чужого компьютера. (Предостережение к такому выводу состоит в том, что нет единого мнения о том, что означает термин «сознание», не говоря уже о том, как его можно моделировать.)

В 2003 году Бостром вообразил технологически развитую цивилизацию, которая обладает огромной вычислительной мощностью и нуждается в небольшой части этой мощности для моделирования новых реальностей с сознательными существами в них. Учитывая этот сценарий, его аргумент о моделировании показал, что по крайней мере одно утверждение в следующей трилемме должно быть верным: во-первых, люди почти всегда вымирают, не дойдя до стадии моделирования. Во-вторых, даже если люди дойдут до этой стадии, они вряд ли будут заинтересованы в моделировании своего собственного прошлого.И в-третьих, вероятность того, что мы живем в симуляции, близка к единице.

До Бострома фильм Матрица уже внес свою лепту в популяризацию понятия симулированной реальности. И эта идея имеет глубокие корни в западных и восточных философских традициях, от аллегории Платона о пещере до мечты Чжуан Чжоу о бабочке. Совсем недавно Илон Маск придал дополнительный импульс идее о том, что наша реальность — это симуляция: «Вероятность того, что мы находимся в базовой реальности, составляет один к миллиарду», — сказал он на конференции 2016 года.

«Маск прав, если вы предполагаете, что [предположения] первая и вторая трилеммы ложны», — говорит астроном Дэвид Киппинг из Колумбийского университета. «Как вы можете это предположить?»

Чтобы лучше понять аргумент Бострома о моделировании, Киппинг решил прибегнуть к байесовским рассуждениям. В этом типе анализа используется теорема Байеса, названная в честь Томаса Байеса, английского статистика и министра XVIII века. Байесовский анализ позволяет вычислить шансы того, что что-то произойдет (так называемая «апостериорная» вероятность), сначала сделав предположения об анализируемом объекте (присвоив ему «априорную» вероятность).

Киппинг начал с превращения трилеммы в дилемму. Он объединил предложения один и два в одно утверждение, потому что в обоих случаях конечным результатом является отсутствие моделирования. Таким образом, дилемма противопоставляет физическую гипотезу (нет моделирования) гипотезе моделирования (существует базовая реальность — и есть моделирования). «Вы просто присваиваете каждой из этих моделей априорную вероятность», — говорит Киппинг. «Мы просто принимаем принцип безразличия, который является допущением по умолчанию, когда у вас нет никаких данных или склонностей в любом случае.”

Таким образом, каждая гипотеза получает априорную вероятность равную половине, , как если бы кто-то подбрасывал монету, чтобы принять решение о ставке.

Следующий этап анализа требовал размышлений о «родственных» реальностях — о тех, которые могут порождать другие реальности, — и о «нерожавших» реальностях — о тех, которые не могут моделировать дочерние реальности. Если бы физическая гипотеза была верна, то вероятность того, что мы живем в нерожавшей Вселенной, было бы легко вычислить: она составила бы 100 процентов.Затем Киппинг показал, что даже в гипотезе симуляции большинство симулируемых реальностей будут нерожавшими. Это связано с тем, что по мере того, как симуляции порождают больше симуляций, вычислительные ресурсы, доступные каждому последующему поколению, сокращаются до такой степени, что подавляющее большинство реальностей не будет иметь вычислительной мощности, необходимой для имитации дочерних реальностей, способных вместить сознательные существа.

Подсоедините все это к формуле Байеса, и вы получите ответ: апостериорная вероятность того, что мы живем в базовой реальности, почти такая же, как апостериорная вероятность того, что мы являемся симуляцией — с вероятностью, склоняющейся в пользу базовой реальности всего лишь за счет немного.

Эти вероятности резко изменились бы, если бы люди создали симуляцию с сознательными существами внутри, потому что такое событие изменило бы шансы, которые мы ранее приписывали физической гипотезе. «Вы можете сразу исключить эту [гипотезу]. Тогда остается только гипотеза моделирования », — говорит Киппинг. «В тот день, когда мы изобретаем эту технологию, шансы на то, что мы настоящие, чуть выше 50–50, почти наверняка не реальны, согласно этим расчетам.В тот день это было бы очень странным празднованием нашего гения ».

Результат анализа Киппинга состоит в том, что, учитывая текущие данные, Маск ошибается в отношении вероятности один к миллиарду, которую он приписывает нам, живущим в базовой реальности. Бостром согласен с результатом — но с некоторыми оговорками. «Это не противоречит аргументу о моделировании, который только утверждает что-то о дизъюнкции», — утверждает он.

Но Бостром не согласен с выбором Киппинга приписать равные априорные вероятности физической гипотезе и гипотезе моделирования в начале анализа.«Применение принципа безразличия здесь довольно шатко, — говорит он. «С равным успехом можно было бы применить его к трем моим первоначальным альтернативам, что тогда дало бы им по одной трети шанса каждой. Или можно каким-то другим способом разделить пространство возможностей и получить любой желаемый результат ».

Такие придирки действительны, потому что нет никаких доказательств, подтверждающих одно утверждение над другими. Эта ситуация изменится, если мы найдем доказательства симуляции. Так можно ли обнаружить сбой в Матрице?

Хоуман Овади, специалист по вычислительной математике Калифорнийского технологического института, задумался над этим вопросом.«Если симуляция обладает бесконечной вычислительной мощностью, вы ни за что не увидите, что живете в виртуальной реальности, потому что она может вычислить все, что вы хотите, с желаемой степенью реализма», — говорит он. «Если эта вещь может быть обнаружена, вы должны исходить из того принципа, что [у нее] ограниченные вычислительные ресурсы». Подумайте еще раз о видеоиграх, многие из которых полагаются на умное программирование, чтобы минимизировать вычисления, необходимые для создания виртуального мира.

Для Оухади наиболее многообещающим способом поиска потенциальных парадоксов, порождаемых такими сокращениями, являются эксперименты по квантовой физике.Квантовые системы могут существовать в суперпозиции состояний, и эта суперпозиция описывается математической абстракцией, называемой волновой функцией. В стандартной квантовой механике акт наблюдения заставляет эту волновую функцию случайным образом коллапсировать до одного из многих возможных состояний. Физики расходятся во мнениях относительно того, является ли процесс коллапса чем-то реальным или просто отражает изменение наших знаний о системе. «Если это просто симуляция, коллапса не будет», — говорит Оухади. «Все решено, когда смотришь на это.Остальное — просто симуляция, как в этих видеоиграх ».

С этой целью Оухади и его коллеги работали над пятью концептуальными вариациями эксперимента с двумя щелями, каждая из которых предназначена для сбивания с толку моделирования. Но он признает, что на данном этапе невозможно узнать, могут ли такие эксперименты работать. «Эти пять экспериментов — всего лишь предположения», — говорит Оухади.

Зохре Давуди, физик из Мэрилендского университета в Колледж-Парке, также высказал идею о том, что моделирование с ограниченными вычислительными ресурсами может проявить себя.Ее работа сосредоточена на сильных взаимодействиях или сильном ядерном взаимодействии — одной из четырех фундаментальных сил природы. Уравнения, описывающие сильные взаимодействия, которые удерживают кварки, образуя протоны и нейтроны, настолько сложны, что их невозможно решить аналитически. Чтобы понять сильные взаимодействия, физики вынуждены проводить численное моделирование. И в отличие от любых предполагаемых суперцивилизаций, обладающих безграничной вычислительной мощностью, они должны полагаться на ярлыки, чтобы сделать эти симуляции вычислительно жизнеспособными — обычно рассматривая пространство-время как дискретное, а не непрерывное.Самый продвинутый результат, которого исследователям удалось добиться на основе этого подхода, — это моделирование одного ядра гелия, состоящего из двух протонов и двух нейтронов.

«Естественно, вы начинаете спрашивать, если бы вы смоделировали атомное ядро ​​сегодня, может быть, через 10 лет, мы могли бы создать более крупное ядро; возможно, через 20 или 30 лет мы сможем создать молекулу », — говорит Давуди. «Кто знает, может быть, через 50 лет вы сможете сделать что-то размером с несколько дюймов материи. Может быть, лет через 100 мы сможем создать [человеческий] мозг.”

Давуди считает, что классические компьютеры скоро наткнутся на стену. «Возможно, в следующие 10-20 лет мы действительно увидим пределы наших классических моделей физических систем», — говорит она. Таким образом, она обращает внимание на квантовые вычисления, которые полагаются на суперпозиции и другие квантовые эффекты, чтобы сделать решаемыми определенные вычислительные проблемы, которые были бы невозможны с помощью классических подходов. «Если квантовые вычисления действительно материализуются в том смысле, что это крупномасштабный и надежный вариант вычислений для нас, то мы вступаем в совершенно другую эру моделирования», — говорит Давуди.«Я начинаю думать о том, как выполнить мое моделирование физики сильного взаимодействия и атомных ядер, если бы у меня был жизнеспособный квантовый компьютер».

Все эти факторы заставили Давуди задуматься о гипотезе моделирования. Если наша реальность является симуляцией, то симулятор, вероятно, также дискретизирует пространство-время, чтобы сэкономить на вычислительных ресурсах (при условии, конечно, что он использует те же механизмы, что и наши физики для этой симуляции). Сигнатуры такого дискретного пространства-времени потенциально можно было бы увидеть в направлениях, откуда приходят космические лучи высоких энергий: они имели бы предпочтительное направление в небе из-за нарушения так называемой вращательной симметрии.