Как отключить сигналку: Как отключить сигнализацию на машине чтоб завести. Отключение сигналки Шерхан, Аллигатор, Томагавк, Старлайн, Шериф

Signal для безопасного обмена сообщениями имеет ряд полезных функций, таких как возможность настраивать уведомления о сообщениях, которые, как и сквозное шифрование Signal, могут помочь защитить вашу конфиденциальность. Вы можете управлять настройками уведомлений во всех версиях Signal: ПК, Mac, Android и iPhone.

Параметры управления уведомлениями Signal относительно обширны по сравнению с некоторыми другими приложениями для обмена сообщениями, но вот краткое руководство, которое поможет вам начать работу.

1. Откройте приложение Signal и войдите в систему.

2. Щелкните значок своего профиля в верхнем левом углу экрана, затем щелкните » Предпочтения «.

3. Практически всеми настройками уведомлений можно управлять из появившегося всплывающего окна. Например, вы можете полностью отключить уведомления или удалить имя и контент из уведомлений для повышения конфиденциальности.

4. Единственный параметр управления уведомлениями, которым нельзя управлять с помощью настроек, — это отключение определенных разговоров. Для этого коснитесь беседы, которую хотите отключить, затем коснитесь значка в виде трех горизонтальных точек. Наконец, нажмите «Отключить уведомления», а затем нажмите на продолжительность, на которую вы хотите отключить звук разговора.

1. Откройте приложение Signal и войдите в систему.

2. Нажмите на значок своего профиля, расположенный в верхнем левом углу экрана.

3. Нажмите на «Уведомления».

4. На этом экране вы можете переключать настройки уведомлений для большинства функций сигналов. Например, вы можете выбрать, какая информация будет отображаться в каждом уведомлении и какие звуки будут издавать каждое предупреждение.

5. Если вы хотите отключить звук определенного разговора, нажмите на разговор, который вы хотите отключить, затем нажмите на имя вашего контакта в верхней части экрана. Наконец, нажмите «Отключить уведомления» и нажмите на время, на которое вы хотите отключить разговор. Вы также можете установить пользовательские настройки уведомлений для конкретного разговора, вместо этого нажав «Пользовательские уведомления».

1. Откройте приложение Signal и войдите в систему.

2. Чтобы изменить общие настройки уведомлений Signal, нажмите на значок своего профиля, расположенный в верхнем левом углу углу экрана, затем нажмите «Уведомления». Здесь вы можете выбрать звуки сообщений, содержимое уведомлений и многое другое.

3. Чтобы заглушить разговор или установить собственный звук для определенного разговора, нажмите на этот конкретный разговор, затем нажмите на имя вашего контакта в верхней части экрана. Затем нажмите «Без звука», чтобы отключить беседу, или нажмите «Звук сообщения», чтобы установить собственный звук уведомления.

Switch-like регуляция клеточной передачи сигналов посредством индукции транскрипции

Abstract

Клеточные сигнальные сети подвергаются транскрипционной и протеолитической регуляции как при физиологических, так и при патологических условиях.Например, известно, что экспрессия белков, подвергающихся ковалентной модификации путем фосфорилирования, изменяется при клеточной дифференцировке или во время канцерогенеза. Однако неясно, как умеренные изменения в экспрессии белков могут вызывать большие изменения в передаче сигнала, как, например, наблюдаемое в случае гаплонедостаточности, когда уменьшение вдвое экспрессии сигнальных белков отменяет клеточную функцию. Моделируя фундаментальный мотив передачи сигнала, цикл фосфорилирования-дефосфорилирования, мы показываем, что незначительные изменения в концентрации белка, подлежащего фосфорилированию (или фосфатазы), могут влиять на передачу сигнала очень сверхчувствительным образом.Этой «ультрасенсибилизации» в значительной степени способствует секвестрация субстрата каталитическими ферментами, и ее можно наблюдать с помощью экспериментально измеренных констант скорости ферментов. Кроме того, мы показываем, что скоординированная транскрипция множества белков (т.е. синэкспрессия) в каскаде протеинкиназ приводит к еще более выраженному поведению «все или ничего» в отношении передачи сигнала. Наконец, мы демонстрируем, что ультрасенсибилизация может объяснить специфичность и модульность регуляции клеточной передачи сигнала.Ультрасенсибилизация может приводить к принятию решений о судьбе клеток по принципу «все или ничего» и к высокоспецифической клеточной регуляции. Кроме того, известно, что подобные переключатели явления, такие как сверхчувствительность, способствуют бистабильности, колебаниям, снижению шума и неоднородности клеток.

Сводка

Гормоны и другие внешние раздражители вызывают клеточные переходы, такие как деление или дифференцировка клеток, регулируя экспрессию генов. Известно, что клеточные переходы, индуцированные гормонами, происходят по принципу переключателя: в то время как слабые фоновые стимулы отклоняются, клеточные переходы происходят полностью, как только превышается пороговая концентрация гормона.Более ранние исследования описали несколько механизмов, с помощью которых подобное переключательное поведение может быть реализовано во внутриклеточной коммуникации через сети передачи сигналов, которые преобразуют гормональные сигналы в изменения в экспрессии генов.

Авт. Демонстрируют, как переключательное поведение может быть дополнительно усилено после индуцированной гормонами экспрессии генов. Они показывают, что даже незначительные (вызванные гормонами) изменения в экспрессии генов могут резко повлиять на активность внутриклеточных сетей передачи сигналов и тем самым изменить клеточное поведение.Это явление получило название «ультрасенсибилизация».

Ультрасенсибилизация может объяснить выраженную дозовую чувствительность, наблюдаемую для многих белков передачи сигналов, связанных с заболеванием: например, мутация одного из двух аллелей (копий гена), приводящая к 2-кратному снижению экспрессии гена, уже может инициировать прогрессирование заболевания. Хотя такая чувствительность к мутациям потенциально вредна, тот факт, что клетки, тем не менее, демонстрируют ультрасенсибилизацию, предполагает, что клетки каким-то образом выигрывают от ультрасенсибилизации.Авторы иллюстрируют, как ультрасенсибилизация улучшает специфичность и эффективность межклеточной коммуникации и способствует клеточной памяти.

Образец цитирования: Legewie S, Blüthgen N, Schäfer R, Herzel H (2005) Ультрасенсибилизация: подобная переключателю регуляция клеточной передачи сигналов посредством индукции транскрипции. PLoS Comput Biol 1 (5): e54. https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.0010054

Редактор: Сатору Мияно, Токийский университет, Япония

Поступила: 9 мая 2005 г .; Принята к печати: 26 сентября 2005 г .; Опубликовано: 28 октября 2005 г.

Авторские права: © 2005 Legewie et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

Введение

Передача клеточного сигнала имеет два уровня регуляции: вышестоящие стимулы, такие как внеклеточные пептидные гормоны, активируют внутриклеточные промежуточные соединения (например,g., митоген-активированные протеинкиназы), которые, в свою очередь, вызывают внутриклеточные ответы (например, активированные факторы транскрипции), как показано на рисунке 1А. Этот тип регулирования, который обычно действует в масштабе времени в минутах, в данной статье будет называться «быстрым регулированием». Быстрая регуляция включает посттрансляционную модификацию ранее существовавших пулов белков для передачи сигналов в ядро. Ответы, индуцированные быстрой регуляцией (Ответ 1), такие как активированные факторы транскрипции, часто, в свою очередь, изменяют общее количество их собственных активаторов (Промежуточный продукт 1) или промежуточных продуктов в гетерологичных каскадах (Промежуточный продукт 2), например.g., вследствие индуцированного синтеза мРНК / белка или деградации (рис. 1А). Например, пути передачи сигнала в иммунной системе изменяют концентрацию своих собственных компонентов посредством транскрипционной положительной или отрицательной обратной связи, вызывая сенсибилизацию [1] или десенсибилизацию [2]. Сходным образом передача сигналов циклического гуанозинмонофосфата влияет на гетерологичные митогенные каскады посредством «перекрестной транскрипции», индуцируя фосфатазу MKP-1 и ингибиторы циклин-зависимых киназ [3]. Из-за длинных периодов полураспада большинства мРНК [4] и белков [5], этот тип регуляции в большинстве (но не во всех) случаях действует на временной шкале, равной часам, и поэтому здесь он будет называться «медленной регуляцией». .

Рисунок 1. Медленная и быстрая регуляция передачи клеточного сигнала

(A) Схематическое изображение передачи клеточного сигнала. Возвратные стимулы (например, гормоны) приводят к изменению экспрессии генов, вызывая быстрые внутриклеточные реакции, такие как факторы транскрипции (быстрая регуляция). Результирующие изменения в экспрессии белков часто, в свою очередь, влияют на клеточную обработку сигналов вышестоящих входов через транскрипционную обратную связь или перекрестные помехи (медленная регуляция).

(B) Схематическое изображение цикла фосфорилирования-дефосфорилирования, где киназа K и фосфатаза P катализируют (де) фосфорилирование субстрата S.Гормональная стимуляция (то есть быстрая регуляция) моделировалась изменением общей концентрации киназы, K _до = K + S ₀ K, и стационарная концентрация свободного фосфорилированного субстрата, S ₁ , была принята за отклик. Влияние медленной регуляции моделировалось изменением концентрации субстрата (S _до = S ₀ + S ₀ K + S ₁ + S ₁ P) или концентрации фосфатазы (P _tot = P + S ₁ P).

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.0010054.g001

На рисунке 1A показан упрощенный вид передачи сигнала: вышестоящие стимулы, такие как гормоны (т.е. быстрая регуляция), вызывают экспрессию генов (т.е. медленную регуляцию), что, в свою очередь, изменяет обработку сотового сигнала. Предыдущие теоретические и экспериментальные исследования (например, [6,7]) в основном анализировали, как быстрая регуляция влияет на медленную регуляцию, в то время как последующие эффекты, то есть влияние медленной регуляции на быструю регуляцию, менее изучены.Однако медленная регуляция, вероятно, не менее важна, поскольку экспрессия фосфопротеинов изменяется во время различных физиологических процессов, таких как дифференцировка [8], развитие [9], апоптоз [10], долгосрочное потенцирование [11], клеточный цикл. [12] и циркадный ритм [13]. Кроме того, было показано, что нарушение регуляции экспрессии фосфопротеинов дикого типа коррелирует с такими заболеваниями, как диабет [8] и рак [14].

На первый взгляд можно ожидать, что измененное выражение промежуточного соединения 1 (т.е., медленное регулирование) линейно влияет на передачу сигнала в установившемся режиме через промежуточное звено 1 (т. е. на быстрое регулирование) (рис. 1А). Однако недавние исследования показывают, что сильная нелинейность наблюдается, по крайней мере, в некоторых случаях: различные гены-супрессоры опухолей, участвующие в передаче клеточного сигнала, не следуют гипотезе двух совпадений Кнудсона, то есть они не требуют гомозиготной потери обоих аллелей для поддерживать прогрессирование опухоли. Напротив, потеря одной копии, т.е. уменьшение вдвое экспрессии белка, достаточна для отмены функции супрессора опухоли, и это явление получило название гаплонедостаточности [15,16].Это говорит о том, что экспрессия сигнальных белков (т.е. медленная регуляция) влияет на передачу сигнала (т.е. быструю регуляцию) очень похожим на переключателя образом. Поскольку усиление передачи сигнала, вызванное индукцией транскрипции, называется сенсибилизацией [1], такая сверхчувствительная регуляция будет называться здесь «ультрасенсибилизацией».

Имеющиеся экспериментальные данные позволяют предположить, что ультрасенсибилизация является физиологически выгодной: известно, что рецепторно-тирозинкиназы, которые вызывают различные клеточные ответы, вызывают широко перекрывающиеся наборы немедленных ранних генов, хотя амплитуда немедленной ранней индукции генов зависит от рецептора [17 , 18].Ультрасенсибилизация позволяет клеткам различать такие незначительные различия в экспрессии немедленных ранних генов (т.е. в медленной регуляции) и, таким образом, придает специфичность передаче сигналов рецептор-тирозинкиназа. Кроме того, даже концентрации насыщающего гормона индуцируют / репрессируют подавляющее большинство целевых мРНК менее чем в 10 раз (например, [19]). Таким образом, стимул-ответ индуцированной гормоном транскрипции демонстрирует значительную базальную активацию, так что индукция мРНК (т.е. медленная регуляция) относительно нечувствительна к концентрациям внеклеточного гормона [20].В таких случаях ультрасенсибилизация может резко усилить клеточные эффекты введения внеклеточных гормонов и может помочь в принятии решений относительно судьбы клеток по принципу «все или ничего». Наконец, известно, что сильные нелинейности, такие как сверхчувствительность, способствуют бистабильности, колебаниям, снижению шума и клеточной неоднородности (см. Обсуждение).

Фосфорилирование — наиболее распространенный способ передачи информации эукариотами, и было подсчитано, что одна треть всех клеточных белков фосфорилируется [21].Поскольку несколько гаплонедостаточных опухолевых супрессоров кодируют фосфопротеины (например, p53, BRCA1, h3AX и pRb) или фосфатазы (PTEN), мы интересовались, может ли ультрасенсибилизация происходить в простом цикле фосфорилирования-дефосфорилирования (Рисунок 1B). Мы показываем здесь, что выраженная ультрасенсибилизация возможна с экспериментально измеренными кинетическими константами, особенно в диапазоне параметров, где соотношение субстрат-фермент таково, что большая часть субстрата, подвергаемого (де) фосфорилированию, секвестрируется каталитическими ферментами.Кроме того, мы показываем, что скоординированная транскрипция множества белков (т.е. синэкспрессия) в каскаде киназ может привести к еще более выраженной ультрасенсибилизации. Наконец, мы демонстрируем, что ультрасенсибилизация может объяснить специфичность и модульность регуляции клеточной передачи сигнала.

Результаты

Ультрасенсибилизация в цикле фосфорилирования-дефосфорилирования

Как указано во введении, нас интересовали средства, с помощью которых измененная экспрессия белка (т.е., медленная регуляция) влияет на передачу сигнала (т. е. быструю регуляцию) с помощью простого цикла фосфорилирования-дефосфорилирования, изображенного на Рисунке 1B. (Де) фосфорилирование белков моделировали с использованием необратимого механизма Михаэлиса-Ментен, где каждый элементарный шаг описывается кинетикой действия массы. Как показано на рисунке 1B, свободный нефосфорилированный субстрат, S ₀ , обратимо связывается со свободной киназой, K, и образующийся комплекс киназа-субстрат, S ₀ K, может необратимо образовывать свободный фосфорилированный субстрат, S _1. , рециркулируя, таким образом, свободную киназу K.Точно так же свободный фосфорилированный субстрат, S ₁ , подвергается дефосфорилированию фосфатазой, и это происходит через образование комплекса субстрат-фосфатаза, S ₁ P (см. Протокол S1 для дифференциальных уравнений). Важно отметить, что наш подход к моделированию учитывает секвестрацию субстрата на фермент-субстратных комплексах, S ₀ K и S ₁ P, что контрастирует с хорошо известным приближением Михаэлиса-Ментен для ферментативного катализа, где субстрат предполагается, что концентрация значительно превышает концентрацию фермента.Воздействие вышестоящих стимулов, таких как внеклеточные гормоны (т. Е. Быстрая регуляция), моделировалось изменением общей концентрации киназы, K _— = K + S ₀ K, и постоянной концентрации свободного фосфорилированного субстрата, S ₁ , было принято в качестве ответа системы. Поскольку мы предполагаем, что фосфатаза конкурирует с нижестоящими эффекторами за единственный сайт стыковки в субстрате (например, [22]), комплекс субстрат-фосфатаза, S ₁ P, не вносит вклад в ответ.

Чтобы понять, как экспрессия белка (т. Е. Медленная регуляция) влияет на передачу сигнала (т. Е. Быструю регуляцию), устойчивый стимулирующий ответ модели, изображенной на рисунке 1B, был нанесен на график для изменяющейся экспрессии субстрата: S _— = S ₀ + S ₀ K + S ₁ + S ₁ P. Затем, установившиеся уровни активации (S ₁ ) для данного стимула (K _до ) до и после индукции субстрата (S _— ).Как показано правой стрелкой на фиг. 2, 5-кратная индукция экспрессии субстрата может привести к 94-кратному увеличению уровня активации в стационарном состоянии при сильной стимуляции (K _— >> P _— ). Ультрасенсибилизация еще более выражена при промежуточной стимуляции, поскольку тогда 5-кратное изменение экспрессии субстрата может вызвать 325-кратное увеличение уровня активации в стационарном состоянии. Напротив, нелинейность исчезает при очень слабой стимуляции, т.е.е., для K _tot → 0, где абсолютные уровни активации пренебрежимо малы (Рисунок 2).

Рисунок 2. Ультрасенсибилизация в цикле фосфорилирования-дефосфорилирования

Стимул-ответ цикла фосфорилирования-дефосфорилирования, изображенного на рисунке 1B, для различных уровней экспрессии субстрата, S _— = S ₀ + S ₀ K + S ₁ + S ₁ P в двойном логарифмическом масштабе. Относительные изменения в ответе, S ₁ , для данного стимула, K _до = K + S ₀ K, вызванные 5-кратным изменением экспрессии субстрата, указаны рядом с вертикальными стрелками.Выбранные параметры: k _{вкл, K} = k _{выкл, P} = k _{cat, P} = 0,01; k _{выкл, K} = k _{cat, K} = 1; к _{по, Р} = 1,6; P _до = 1,25.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.0010054.g002

Таким образом, мы доказали, что экспрессия белка (т. е. медленная регуляция) может влиять на передачу сигнала (т. е. быструю регуляцию) очень нелинейным образом при условии, что стимуляция достаточно сильно. Другими словами, ультрасенсибилизация возможна в цикле фосфорилирования-дефосфорилирования, и эксперименты по трансфекции в живых клетках подтверждают этот вывод [23].

Ультрасенсибилизация из-за секвестрации субстрата

Чтобы получить более полное представление о ультрасенсибилизации в цикле фосфорилирования-дефосфорилирования, мы проанализировали передачу стационарного сигнала при сильной стимуляции (K _— >> P _— ), поскольку аналитическое выражение для ответа: S ₁ , можно получить в этом лимите (протокол S1):

Здесь константа Михаэлиса-Ментен фосфатазы, K _{M, P} , и пороговая концентрация субстрата, S _{tot, T} , при которой происходит ультрасенсибилизация (см. Ниже), даются как:

Константы скорости k _на , k _на и k _cat описывают отдельные стадии киназного (K) или фосфатазного (P) катализа, как показано на рисунке 1B, а P _— = P + S _{. 1} P — общий уровень экспрессии фосфатазы.

Как показано на Фигуре 3, большое относительное изменение передачи сигнала согласно Уравнению 1 от S ₁ << S _до до S ₁ ≈ S _до может наблюдаться при незначительном увеличении экспрессии субстрата. Поскольку это резкое относительное изменение происходит в дополнение к абсолютному увеличению S _до , экспрессия субстрата, S _до (медленная регуляция), влияет на передачу сигнала через S ₁ (быстрая регуляция) очень сверхчувствительным образом (ультрасенсибилизация). , особенно если:

Если это условие выполняется, передача сигнала незначительна (т.е.е., S ₁ << S _tot ) для слабых уровней экспрессии субстрата, S _tot tot, T (Рисунок 3), поскольку с этого момента практически весь субстрат изолирован на фермент-субстратных комплексах. , S ₀ K и / или S ₁ P (протокол S1). Напротив, передача сигнала начинает повышаться сверхчувствительным образом (сверхчувствительность), как только экспрессия субстрата превышает пороговое значение, то есть как только S _до > S _{tot, T} .Это можно объяснить следующим образом: порог, S _{tot, T} , равен максимальному количеству субстрата, который может быть изолирован на фермент-субстратных комплексах, S ₀ K и / или S ₁ P (Протокол S1 ), так что секвестрация субстрата больше не препятствует передаче сигнала, если S _tot > S _{tot, T} . В конце концов, ультрасенсибилизация исчезает при очень сильной экспрессии субстрата (S _tot >> S _{tot, T} ), с тех пор количество изолированного субстрата незначительно, так что экспрессия субстрата влияет на передачу сигнала линейным образом (т.е.е., S ₁ ≈ S _до ).

Рисунок 3. Ультрасенсибилизация из-за секвестрации субстрата

Нормализованный максимальный ответ цикла фосфорилирования-дефосфорилирования, изображенный на Рисунке 1B, представлен как функция экспрессии субстрата в полулогарифмической шкале для предела сильной стимуляции (согласно уравнению 1), где K _до >> P _до . Пороговое значение S _{tot, T} (см. Уравнение 2) варьировали, как указано, в то время как константа Михаэлиса-Ментен фосфатазы, K _{M, P} , оставалась постоянной и принималась равной единице.Схема вверху указывает механизм ультрасенсибилизации: при слабой экспрессии субстрата большая часть субстрата секвестрируется на фермент-субстратных комплексах, S ₀ K и S ₁ P, в то время как передача сигнала через S ₁ происходит, как только экспрессия субстрата, S _tot , превышает пороговое значение, S _{tot, T} .

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.0010054.g003

Таким образом, мы показали, что выраженная ультрасенсибилизация из-за секвестрации субстрата на каталитических ферментах требует выполнения уравнения 3 (рисунок 3).Как указано в Обсуждении, уравнение 3 соответствует экспериментально измеренным данным, поэтому ожидается, что ультрасенсибилизация из-за секвестрации будет наблюдаться in vivo. Следует отметить, что численные исследования показали, что сверхсенсибилизация из-за секвестрации субстрата в режиме уравнения 3 не требует для очень сильной стимуляции (K _— >> P _— ), что предполагалось для получения аналитических выражений, но скорее можно наблюдать при условии, что (Протокол S1):

Уравнение 4 можно рассматривать как общее требование для любой ультрасенсибилизации в цикле фосфорилирования-дефосфорилирования, поскольку в противном случае киназная активность (т.е.е., стимул) слишком слаб, чтобы вызвать значительное накопление активных частиц, S ₁ . Как указано выше, ультрасенсибилизация относится к значительному относительному увеличению передачи сигнала по мере увеличения уровня экспрессии субстрата и, таким образом, требует, чтобы большая часть субстрата была активной (т. Е. Чтобы S ₁ ≈ S _до ) для достаточно больших S _до . Для таких высоких уровней экспрессии субстрата секвестрация субстрата каталитическими ферментами незначительна, и общие скорости фосфорилирования (S ₀ → S ₁ ) и дефосфорилирования (S ₁ → S ₀ ) могут быть аппроксимированы следующим образом: V _{макс., K} и V _{макс., P} .Согласно Goldbeter и Koshland [24], сильная передача сигнала (т.е. S ₁ ≈ S _до ) для больших S _до и, следовательно, ультрасенсибилизация, может наблюдаться только в том случае, если скорость киназы превышает скорость фосфатазы, то есть, если выполняется уравнение 4 (протокол S1). Этот результат подтверждает наши более ранние наблюдения, что ультрасенсибилизация исчезает при слабой стимуляции (см. Рис. 2).

Ультрасенсибилизация из-за переключения активности

Хотя ультрасенсибилизация из-за секвестрации субстрата сохраняется для промежуточных уровней стимула (см. Выше), это не объясняет, почему ультрасенсибилизация может быть более выраженной для промежуточных стимулов по сравнению с сильной стимуляцией (рис. 2).Для промежуточных уровней стимула дополнительный механизм, который не зависит от секвестрации субстрата, может вызвать повышенную сенсибилизацию. При условии выполнения уравнения 4 увеличение экспрессии субстрата вызывает «переключение активности» с высокой общей активности фосфатазы (S ₁ → S ₀ ) на высокую общую киназную активность (S ₀ → S ₁ ), если киназный катализ значительно менее насыщен, чем катализ фосфатазой, т. е. если:

Как уже упоминалось, ультрасенсибилизация относится к значительному относительному увеличению передачи сигнала по мере увеличения уровня экспрессии субстрата.В то время как уравнение 4 требуется для передачи сильного сигнала (S ₁ ≈ S _до ) для большого S _до (см. Выше), уравнение 5 гарантирует, что передача сигнала исчезает (S ₁ << S _до ) если S _tot является небольшим: для низких уровней экспрессии субстрата, когда насыщение фермента незначительно, общие скорости фосфорилирования и дефосфорилирования в устойчивом состоянии могут быть аппроксимированы линейной кинетикой с константами скорости первого порядка V _{max, K} / K _{M, K} и V _{max, P} / K _{M, P} (протокол S1).Если выполняются уравнения 4 и 5, активность фосфатазы превышает активность киназы (т. Е. V _{max, P} / K _{M, P} >> V _{max, K} / K _{M, K} ) при условии, что стимул, K _до , не слишком сильный, так что передача сигнала не происходит (S ₁ << S _до ). Следовательно, заметное относительное изменение от слабой к сильной передаче сигнала (ультрасенсибилизация) может наблюдаться по мере увеличения уровня экспрессии субстрата, если выполняются оба уравнения 4 и 5.Важно отметить, что эта ультрасенсибилизация из-за переключения активности не зависит от секвестрации субстрата.

Соответствующие численные результаты показаны на рисунке 4 для цикла фосфорилирования-дефосфорилирования со слабой секвестрацией субстрата, где промежуточный стимул V _{max, K} приводит к выраженной ультрасенсибилизации из-за переключения активности. Ультрасенсибилизация исчезает для более сильных уровней стимула, поскольку тогда общая активность киназы превышает активность фосфатазы независимо от уровня экспрессии субстрата (см. Выше).Другими словами, ультрасенсибилизация из-за переключения активности ограничивается промежуточными уровнями стимула, что объясняет, почему ультрасенсибилизация на рисунке 2 является оптимальной при промежуточной стимуляции.

Рисунок 4. Ультрасенсибилизация из-за переключения активности

Нормализованная реакция цикла фосфорилирования-дефосфорилирования, изображенная на рисунке 1B, представлена ​​как функция экспрессии субстрата в полулогарифмической шкале для различных уровней стимула. Чтобы связать график с аналитическими результатами, приведенными в основном тексте (уравнение 4), стимул, K _до , выражается как V _{max, K} и выражается во временах V _{max, P} .Для выбранных параметров (k _{вкл, K} = 0,02; k _{выкл, K} = k _{cat, K} = k _{off, P} = 1; k _{on, P} = 2; k _{cat, P} = P _до = 0,1), секвестрация субстрата незначительна (т.е. уравнение 3 не соответствует , а не ), и киназа значительно менее насыщена, чем фосфатаза (уравнение 5). Схема вверху показывает механизм ультрасенсибилизации: увеличение экспрессии субстрата вызывает переключение от высокой общей активности фосфатазы (S ₁ → S ₀ ) к высокой общей киназной активности (S ₀ → S ₁ ).

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.0010054.g004

Ультрасенсибилизация за счет синэкспрессии в каскаде киназ

Часто множественные промежуточные соединения в сигнальном каскаде циклов фосфорилирования-дефосфорилирования (Figure 5A) транскрибируются скоординированно в так называемой группе синэкспрессии. Например, рецептор инсулина и его нижележащий субстрат IRS-1 активируются во время дифференцировки адипоцитов [8,25], и это резко увеличивает чувствительность к инсулину в адипоцитах по сравнению с предшественниками фибробластоидов.Кроме того, множественные компоненты дрожжевого пути восприятия феромонов скоординированно индуцируются в петле положительной обратной связи транскрипции после стимуляции феромонами [19,26].

Рисунок 5. Ультрасенсибилизация из-за синэкспрессии в сигнальном каскаде

(A) Схематическое изображение сигнального каскада, подверженного синэкспрессии. Предполагалось, что увеличение регулятора r приводит к пропорциональному увеличению экспрессии промежуточных соединений S и T, оба из которых подвергаются ковалентной модификации посредством (де) фосфорилирования.

(B) Ультрасенсибилизация из-за синэкспрессии в сигнальном каскаде, измеренная численно путем построения нормированного ответа как функции концентрации регулятора, r, где S _tot = T _tot = r (сплошная линия). Чтобы показать, что синэкспрессия усиливает ультрасенсибилизацию, случай, когда регулятор r влияет только на транскрипцию T, также показан для S _— = 10 (пунктирная линия). Аналогичные результаты были получены для других значений от S _до или других значений силы стимула (данные не показаны).Выбранные параметры: k _{off, 1} = k _{off, 5} = k _{cat, 2} = k _{cat, 6} = k _{off, 3} = k _{off, 7} = k _{cat, 8} = P _{S, общ} = P _{T, общ} = 1; k _{on, 1} = 0,02; k _{о, 5} = 0,2; k _{о, 3} = 2,1; k _{on, 7} = 2; k _{cat, 4} = 1,1; K _до = 10.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.0010054.g005

Поскольку влияние таких групп синэкспрессии на передачу сигнала еще не исследовано, мы проанализировали минимальную модель, в которой регулятор транскрипции r одновременно индуцирует экспрессия белка S и его нижележащего субстрата T, оба из которых подвергаются ковалентной модификации путем фосфорилирования (рис. 5А).Для простоты мы предположили, что увеличение регулятора r приводит к пропорциональному увеличению уровней экспрессии обоих промежуточных продуктов каскада, то есть в S _— и T _— . Численное моделирование модели, изображенной на фиг. 5A, демонстрирует, что синэкспрессия S и T (сплошная линия на фиг. 5B) значительно усиливает ультрасенсибилизацию по сравнению с экспрессией только T (пунктирная линия на фиг. 5B). Например, 3-кратное увеличение регулятора r (обозначено вертикальными пунктирными линиями) приводит к 24-кратному увеличению не -нормализованного ответа, T ₁ , если предполагается синэкспрессия, в то время как только В системе, лишенной синэкспрессии, наблюдается 9-кратное увеличение (рис. 5В).Следует отметить, что эта повышенная сенсибилизация на Фигуре 5B не является результатом , а не сверхчувствительности нулевого порядка [24] ответа, T ₁ , по отношению к промежуточному продукту S ₁ , а скорее является неотъемлемым свойством каскадов. при условии синэкспрессии.

Последний вывод может быть подтвержден аналитически для упрощенной модели каскада киназ, в которой не учитывались секвестрация субстрата и насыщение ферментов (Протокол S2). Эти аналитические исследования (протокол S2) показали, что сверхчувствительность из-за синэкспрессии наблюдается независимо от выбранных параметров, хотя степень сверхчувствительности зависит от параметров.Как и ожидалось, чем больше стадий каскада скоординировано регулируется транскрипцией, r, тем более выражена ультрасенсибилизация из-за синэкспрессии (протокол S2). Поскольку абсолютные уровни фосфопротеинов в киназных каскадах часто существенно различаются, то есть от S _до ≠ T _до на Рисунке 5A [27,28], нас интересовало, как такая дифференциальная экспрессия влияет на ультрасенсибилизацию из-за синэкспрессии. Оказалось, что ультрасенсибилизация за счет синэкспрессии наиболее выражена, если абсолютные концентрации увеличиваются вдоль каскада, т.е.е., если S _до до на Фигуре 5A (Протокол S2), как ранее сообщалось для каскада митоген-активируемых протеинкиназ [27,28].

Наши исследования моделирования, представленные в этом разделе, объясняют, почему скоординированная активация рецептора инсулина и его нижележащего субстрата, IRS-1, во время дифференцировки адипоцитов приводит к значительному повышению чувствительности к инсулину (см. Выше). Важно отметить, что ультрасенсибилизация из-за синэкспрессии не ограничивается регуляторным режимом, изображенным на рисунке 5A, но также наблюдается, если несколько дезактиваторов сигнального каскада синэкспрессируются (протокол S2), как, например, наблюдается в сигнальных путях фактора роста фибробластов [29 ].Имеющиеся экспериментальные данные подтверждают ультрасенсибилизацию из-за синэкспрессии, поскольку титрование перванадатом, общим ингибитором протеинтирозинфосфатаз, увеличивает фосфорилирование Mek сверхчувствительным образом [30], скорее всего, за счет одновременной активации нескольких тирозин-фосфорилированных белков, включая рецепторы, адаптеры и Mek. сам.

Ультра (де) сенсибилизация может придать специфичность и модульность

В предыдущих разделах мы показали, что измененная экспрессия субстрата, S _— , может влиять на передачу сигнала посредством циклов фосфорилирования-дефосфорилирования (см. Рис. 1B) очень сверхчувствительным образом.Аналогичным образом, увеличение уровня экспрессии фосфатазы, P _— = P + S ₁ P, может снижать передачу сигнала при достаточно сильной стимуляции переключателем (рис. 6), как предполагают исследования трансфекции в живых клетках [ 23]. Эта сверхчувствительность, которая здесь будет называться «сенсибилизация ultra de », особенно выражена, если катализ фосфатазой демонстрирует сильное насыщение (см. Протокол S1), то есть, если:

Здесь мы предполагаем, что сверхдесенсибилизация из-за индуцированной экспрессии фосфатазы приводит к высокоспецифической регуляции передачи клеточного сигнала при условии, что выполняется уравнение 6.Рассмотрим схему, изображенную в правом верхнем углу рисунка 6, где нефосфорилированный субстрат S фосфорилируется тремя киназами: K ₁ , K ₂ и K ₃ . Согласно рисунку 6, передача сигнала через K ₁ (красная линия) при сильной стимуляции специально отключается при относительно небольшом увеличении уровня экспрессии фосфатазы, P _до = P + S ₁ P (обозначено горизонтальной линией). стрелка), а передача сигналов через K ₂ (зеленая линия) и K ₃ (синяя линия) практически не изменяется.Другими словами, сверхдесенсибилизация из-за экспрессии фосфатазы специально отключает индивидуальные перекрестные сигнальные взаимодействия бинарным образом, если выполняется уравнение 6. Дифференциальная чувствительность к экспрессии фосфатазы, показанная на рисунке 6, связана с тем, что катализ (т.е. k _{cat, K} на рисунке 1B) K ₁ медленнее, чем катализ K ₂ и K ₃ . Дальнейшее увеличение экспрессии фосфатазы последовательно дезактивирует передачу сигналов через K ₂ и K ₃ , как показано вертикальными пунктирными линиями на Фигуре 6.Таким образом, четыре специфических и бинарных регуляторных состояния могут быть реализованы в пределах двух порядков величины экспрессии фосфатазы, что является максимальным диапазоном индукции или репрессии транскрипции in vivo (например, [19]).

Хотя подобная специфичность, в принципе, также может быть достигнута за счет снижения экспрессии киназ, от K ₁ до K ₃ , регулирование фосфатазы является преимуществом по двум причинам. Во-первых, индуцированная экспрессия фосфатазы (как показано вертикальной стрелкой на фиг. 6) отменяет опосредованное K ₁ фосфорилирование S, оставляя другие действия K ₁ незатронутыми, и тем самым улучшает специфичность клеточной регуляции.Во-вторых, транскрипционная регуляция экспрессии фосфатазы может привести к модуляции и, таким образом, к упрощению клеточной регуляции: слабая индукция фосфатазы (горизонтальная стрелка на рисунке 6) одновременно подавляет все события фосфорилирования, которые ведут себя как реакция, катализируемая K ₁ (высокочувствительный модуль), при этом не затрагиваются менее чувствительные модули (синие и зеленые линии на рис. 6).

Рисунок 6. Ультра (де) сенсибилизация может привести к специфичности и модульности

Ответ цикла фосфорилирования-дефосфорилирования (см. Рисунок 1B) на сильную стимуляцию показан как функция уровня экспрессии фосфатазы (P _— = P + S ₁ P) для изменения соотношения чисел оборота, k _{cat, P} / k _{cat, K} .Уравнение 1 использовалось для построения графика, поскольку это выражение также применяется независимо от относительных уровней экспрессии киназы и фосфатазы при условии, что K _до >> S _до и K _до >> K _{M, K} (см. Протокол S1 ). Представленные графики соответствуют схеме, изображенной в верхнем правом углу, где свободный нефосфорилированный субстрат, S, фосфорилируется тремя киназами, которые различаются числами оборота, k _{cat, K} : K ₁ (красный линия; k _{кот, P} / k _{кот, K} = 100), K ₂ (зеленая линия; k _{кот, P} / k _{кот, K} = 20) и K ₃ ( синяя линия; k _{кот, P} / k _{кот, K} = 3).Как показано вертикальными пунктирными линиями, сверхдесенсибилизация может привести к четырем бинарным регуляторным состояниям в зависимости от уровня экспрессии фосфатазы, особенно если фосфатаза сильно насыщена своим субстратом (уравнение 6), что мы и предположили здесь (K _{M, P} = 0,01; S _до = 1).

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.0010054.g006

Важно отметить, что аналогичные выводы относительно избирательной и модульной регуляции событий фосфорилирования (показаны на рисунке 6) также верны, если беспорядочная фосфатаза дефосфорилирует множественные циклы фосфорилирования-дефосфорилирования [ 31–34] с высоким сродством (уравнение 6).В этом случае предполагается, что небольшая индукция экспрессии фосфатазы специфически деактивирует все высокочувствительные циклы фосфорилирования-дефосфорилирования (красная линия на рисунке 6), оставляя менее чувствительные циклы практически незатронутыми (синие и зеленые линии на рисунке 6). Исследования трансфекции подтверждают такую ​​дифференциальную чувствительность клеточных сигнальных путей к экспрессии фосфатазы [35,36]. Кроме того, экспериментальные данные согласуются с модуляризацией клеточной регуляции, поскольку было показано, что незначительные изменения в экспрессии PTB-1B одновременно влияют как на цитокин-, так и на инсулино-опосредованную передачу сигналов [32].

Обсуждение

Предыдущие исследования передачи сигналов были в основном сосредоточены на том, как гормональная стимуляция (быстрая регуляция) изменяет экспрессию генов (медленная регуляция). Для сравнения, влияние экспрессии генов на обработку гормональных входов изучено менее хорошо, хотя оба типа регуляции тесно связаны (см. Рисунок 1A). В работе, описанной здесь, мы использовали вычислительные методы, чтобы показать, что незначительные изменения в экспрессии сигнальных белков могут привести к большим изменениям в передаче сигнала в стационарном состоянии.Другими словами, мы показали, что медленная регуляция передачи сигнала может влиять на быструю регуляцию очень нелинейным образом. Поскольку повышенная передача сигнала, вызванная индукцией транскрипции, называется сенсибилизацией [1], мы назвали такую ​​нелинейность ультрасенсибилизацией.

Экспериментальные данные предполагают, что экспрессия генов относительно нечувствительна к внеклеточной стимуляции (например, [19]), так что физиологические концентрации гормонов будут влиять на экспрессию клеточных белков лишь в незначительной степени.Биохимические сети, демонстрирующие ультрасенсибилизацию, преобразуют такие незначительные изменения в большие изменения клеточной функции, так что ожидается, что ультрасенсибилизация усилит эффекты введения внеклеточных гормонов. Кроме того, подпороговые изменения в экспрессии белка (например, S _tot tot, T в уравнении 1) будут нейтрализованы, так что предполагается, что ультрасенсибилизация будет вносить вклад в принятие решений о клеточной судьбе по принципу «все или ничего».

Если экспрессия белка, подверженного ковалентной модификации путем фосфорилирования, демонстрирует стохастические вариации (см. Обзоры [37,38]), ультрасенсибилизация может вносить вклад в клеточную гетерогенность, которая, как известно, важна для некоторых типов дифференцировки клеток [37]: при условии, что что средний уровень экспрессии находится в диапазоне ультрасенсибилизации (т.е.е., S _tot ≈ S _{tot, T} в уравнении 1), некоторые клетки будут очень чувствительны к внеклеточным факторам роста, тогда как другие будут по существу нечувствительными. Подобным образом было высказано предположение, что повышенная стохастичность в экспрессии генов способствует гаплонедостаточности генов-супрессоров опухолей [39]. В этой модели временное снижение функции супрессора опухолей представляет собой окно возможностей для прогрессирования рака. Ультрасенсибилизация может усиливать такие стохастические эффекты, трансформируя относительно незначительные изменения в экспрессии генов в резкие изменения функции супрессора опухолей.Важно отметить, что ультрасенсибилизация также объясняет другие типы чувствительности к дозировке, которые вызывают множество заболеваний. Например, относительно небольшая избыточная экспрессия онкогенных фосфопротеинов [14], по прогнозам, резко влияет на митогенную передачу сигналов, тем самым внося свой вклад в канцерогенез. Наконец, сильные нелинейности, такие как сверхчувствительность, приводят к бистабильности или колебаниям в сочетании с положительной [40] или отрицательной [41] обратной связью.

Анализируя передачу стационарного сигнала для данного стимула в зависимости от экспрессии белка, мы показали, что изменения в экспрессии субстрата могут вызвать ультрасенсибилизацию в цикле фосфорилирования-дефосфорилирования (см. Рисунок 2) при условии, что стимуляция достаточно сильна (уравнение 4 ).Важно отметить, что кинетическая схема, изображенная на рисунке 1B, также применима для других типов ковалентной модификации (например, ацетилирования) и для циклов активации малых G-белков, поэтому ожидается, что ультрасенсибилизация будет широко распространенным явлением в передаче клеточной информации. Наши аналитические результаты показывают, что ультрасенсибилизация при сильной стимуляции требует связывания субстрата каталитическими ферментами (уравнение 3). Более конкретно, секвестрация субстрата киназой и / или фосфатазой полностью предотвращает передачу сигнала для слабых уровней экспрессии субстрата (см. Фигуру 3).Поскольку количество изолированного субстрата не может превышать пороговое значение, S _{tot, T} (уравнение 2), передача сигнала начинает повышаться сверхчувствительным образом (сверхчувствительность), как только уровень экспрессии субстрата незначительно превышает пороговый уровень экспрессии, т. Е. если S _tot > S _{tot, T} (Рисунок 3).

Несмотря на то, что эксперименты по трансфекции предполагают, что ультрасенсибилизация происходит in vivo [23], мы спросили, согласуется ли предсказанная потребность в ультрасенсибилизации из-за секвестрации субстрата (уравнение 3) с имеющимися данными кинетики ферментов.К сожалению, константы Михаэлиса-Ментен фосфатаз часто измеряются с использованием нефизиологических субстратов, таких как p -нитрофенилфосфат (т.е. константы Михаэлиса-Ментен, вероятно, будут ниже in vivo), и было выполнено лишь очень небольшое количество количественных оценок концентраций клеточной фосфатазы. в определенных типах клеток. Тем не менее, имеющиеся данные показывают некоторые кандидаты на фосфатазы, такие как PP1B (K _{M, P} = 0,04–10 мкМ; P _tot = 0,5 мкМ) и PP2B (K _{M, P} = 2–20 мкМ; P _tot = 20 мкМ), клеточная концентрация которого P _— , как сообщается, превышает константу Михаэлиса-Ментен K _{M, P} [42].Точно так же клеточная концентрация PP2A, которая, по оценкам, составляет 0,25% от общего клеточного белка [43], превышает константу Михаэлиса-Ментен K _{M, P} = 10 мкМ [44].

Хотя имеющиеся данные предполагают, что другие фосфатазы, такие как PTP-1B (K _{M, P} = 0,6–8 мкМ; P _tot = 0,02 мкМ) и PP2C (K _{M, P} = 0,1–0,3 мкМ; P _до = 0,01 мкМ) не соответствуют условию K _{M, P} ≤ P _до [42], следует иметь в виду, что субклеточное нацеливание, которое было показано для различных фосфатаз (например,g., [33,34]), как известно, резко увеличивает эффективную концентрацию фосфатазы. Например, концентрация фосфатаз в ядре обычно в 2-10 раз выше, чем в цитоплазме [45]. Аналогичным образом, было подсчитано, что эффективная концентрация сигнальных белков увеличивается в 1000 раз, если и фермент, и субстрат локализуются на мембране [46]. Наконец, порог S _{tot, T} (т.е. уравнение 3) также зависит от отношения каталитических констант скорости k _{cat, P} / k _{cat, K} (см. Уравнение 2), которое было экспериментально измерено для цикл фосфорилирования-дефосфорилирования Erk и, как было показано, равен 4.1–23,8 для Erk-дефосфорилирования с помощью MKP-3 и даже выше (41,3–238,1) для Erk-дефосфорилирования с помощью HePTP [47,48]. Таким образом, экспериментальные данные свидетельствуют о том, что ультрасенсибилизация из-за секвестрации субстрата происходит in vivo. Соответственно, сообщалось, что ассоциация фосфопротеинов с каталитическими ферментами ингибирует передачу клеточного сигнала [49–51].

Как показано на рисунке 2, ультрасенсибилизация может быть даже более выраженной для промежуточных уровней стимула по сравнению с очень сильной стимуляцией.В этом случае дополнительный механизм, который не зависит от секвестрации субстрата, способствует выраженной ультрасенсибилизации при промежуточной стимуляции (см. Рисунок 4): повышенная экспрессия субстрата вызывает сверхчувствительный переход от высокой общей активности фосфатазы (S ₁ → S ₀ ) до высокой общей киназной активности (S ₀ → S ₁ ), если выполняются уравнения 4 и 5. Эта ультрасенсибилизация из-за переключения активности, вероятно, будет физиологически значимой, поскольку она просто требует, чтобы катализ киназы был значительно менее насыщенным, чем катализ фосфатазы (уравнение 5), в дополнение к достаточно сильной стимуляции (уравнение 4).

Кроме того, мы доказали, что скоординированная экспрессия нескольких промежуточных продуктов в каскаде киназ (см. Рисунок 5A) приводит к ультрасенсибилизации из-за синэкспрессии (рисунок 5B), которая тем более выражена, чем больше количество промежуточных продуктов, которые экспрессируются координированно (см. Протокол S2. ). Доступные экспериментальные данные подтверждают ультрасенсибилизацию из-за синэкспрессии, поскольку титрование перванадатом, общим ингибитором протеинтирозинфосфатаз, увеличивает фосфорилирование Mek сверхчувствительным образом [30], скорее всего, за счет одновременной активации нескольких белков, фосфорилированных тирозином, включая рецепторы, адаптеры и Сам Мек.Наши исследования моделирования демонстрируют, что скоординированная экспрессия нескольких каскадных белков, например, благодаря геномной организации в оперонах, позволяет более эффективно контролировать передачу клеточного сигнала по сравнению с экспрессией одного ограничивающего скорость белка. Это может быть одной из причин, почему функционально родственные белки часто экспрессируются в так называемых группах синэкспрессии [52].

Наконец, мы показали, что индуцированная экспрессия фосфатаз также влияет на передачу клеточной информации, т.е.е., быстрая регуляция посредством циклов фосфорилирования-дефосфорилирования (см. рис. 1B) очень сверхчувствительным образом (ультрадесенсибилизация), особенно если катализ фосфатаз сильно насыщен (уравнение 6). Важно отметить, что сверхдесенсибилизация может учитывать специфичность и модульность передачи клеточного сигнала: небольшое увеличение экспрессии фосфатазы может координированно выключать высокочувствительные события фосфорилирования, которые мы все вместе называем высокочувствительным модулем (красная линия на рисунке 6), в то время как менее чувствительным. модули (зеленые и синие линии на рисунке 6) практически не затронуты.Таким образом, в зависимости от уровня экспрессии фосфатазы, клеточная передача сигнала может проявлять несколько бинарных (включенных / выключенных) регуляторных состояний (вертикальные пунктирные линии на рисунке 6). Модульная модель действия фосфатаз позволяет очень гибко регулировать передачу клеточного сигнала, поскольку каждая фосфатаза имеет характерный набор субстратов, который частично перекрывается с таковыми других фосфатаз, так что большинство фосфопротеинов дефосфорилируются множеством фосфатаз [31]. Таким образом, в зависимости от фосфатазы, которая индуцируется транскрипционно, каждый фосфопротеин может корегулировать с разными фосфопротеинами; то есть модульная организация отличается для каждой фосфатазы.

В статье представлена ​​теоретическая основа для более количественных экспериментальных измерений с целью выяснения регуляции передачи клеточного сигнала. Более конкретно, количественные измерения того, как экспрессия белка влияет на передачу клеточной информации, очень желательны для понимания того, как возникают гаплонедостаточность, специфичность, эффективность, бистабильность, колебания, подавление шума и клеточная гетерогенность. Мы предлагаем, чтобы предсказания, сделанные в этой статье, должны быть проверены экспериментально, контролируя транскрипцию с помощью рекомбинантных векторов или используя трансфектанты с определенным числом копий трансгена.Важно отметить, что недостаточно проанализировать статус фосфорилирования исследуемого белка в качестве меры передачи сигнала, поскольку тогда потенциально инактивирующая секвестрация субстрата на фосфатазе (S ₁ P-комплекс на рисунке 1B) не принимается во внимание. Таким образом, необходимы анализы активности киназы, подобные тому, который ранее был описан для активности Erk, который использует Erk-индуцированное фосфорилирование MBP в качестве считывания [53]. Мы предлагаем проверить наши предсказания экспериментально, проанализировав влияние экспрессии фосфатазы на Erk-опосредованную передачу сигнала и по другим причинам.Во-первых, индукция фосфатаз Erk вследствие транскрипционной обратной связи [29] или перекрестных помех [3], как известно, имеет физиологическое значение. Во-вторых, комплекс Erk-фосфатаза (S ₁ P на рисунке 1B), как известно, является каталитически неактивным (например, [22]), что способствует ультрасенсибилизации из-за секвестрации субстрата. В-третьих, ультрасенсибилизация (согласно уравнению 3) также может наблюдаться из-за низкой константы Михаэлиса-Ментен MKP-3 [48] и того факта, что k _{cat, P} >> k _{cat, K} ( см. выше).

Поскольку достижение скоординированной экспрессии множественных фосфопротеинов в экспериментах по трансфекции может оказаться трудным, следует дополнительно проверить ультрасенсибилизацию, обусловленную синэкспрессией, с использованием общих ингибиторов действия киназы или фосфатазы. Например, экспериментальное исследование влияния гипоксии, то есть кислородного истощения, на передачу сигналов выживания клеток может быть физиологически интересным. Гипоксия приводит к резкому снижению клеточной концентрации аденозинтрифосфата с ~ 1 мМ до ~ 20 мкМ [54], что значительно ниже константы Михаэлиса-Ментен для аденозинтрифосфата многих киназ, так что скорость фосфорилирования киназ снижается во всем мире. [55,56].Наши аналитические результаты (Протокол S2) предсказывают, что передача сигналов выживания, опосредованная протеинкиназами, демонстрирует резкую реакцию «все или ничего» в отношении клеточных уровней аденозинтрифосфата (то есть концентрации кислорода), так что внеклеточные факторы выживания больше не спасают клетки от проникновения. в апоптоз, как только концентрация кислорода упадет ниже критического уровня.

Наши результаты также подчеркивают, что влияние экспрессии генов на индуцированную гормонами передачу сигнала должно быть дополнительно изучено теоретически, чтобы получить представление о том, как другие сигнальные модули реагируют на измененную экспрессию их составляющих.Например, явные расчеты (данные не показаны) показывают, что передача сигнала в стационарном состоянии через белки, подверженные многосайтовому фосфорилированию, намного более чувствительна к индуцированной экспрессии фосфатазы по сравнению с односайтовым механизмом, предполагаемым на рисунке 1B. Такой дальнейший анализ может быть проведен с помощью анализа метаболического контроля (рассмотренного в [57]), который недавно был применен для понимания влияния экспрессии генов на клеточную передачу сигналов [58,59]. Сигналы в живых клетках часто преходящи (например,g., вследствие подавления рецепторов). Хотя наши дополнительные расчеты показывают, что сверхчувствительность сохраняется для таких переходных сигналов (протокол S3), необходимы дальнейшие исследования. Интересно, что сильная секвестрация субстрата в цикле фосфорилирования-дефосфорилирования (т. Е. S _tot tot, T в уравнении 1) не всегда полностью отменяет передачу сигнала, но приводит к переходным сигналам из-за адаптации (F. Bruggeman and N. Blüthgen, личное сообщение), если скорость катализа киназы (k _{cat, K} ) значительно выше, чем скорость секвестрации субстрата на фосфатазе (k _{on, P} ).В этом случае ультрадесенсибилизация из-за измененной экспрессии фосфатазы в основном влияет на продолжительность сигнала, а не на амплитуду сигнала (данные не показаны), так что дальнейший анализ ультра (де) сенсибилизации может дать представление о том, как клетки регулируют митогенез по сравнению с дифференцировкой [60].

Материалы и методы

Численное моделирование было выполнено с использованием вычислительной среды MATLAB (The Mathworks, Натик, Массачусетс, США). Аналитические результаты были подтверждены с использованием Maple 7 (Waterloo Maple, Waterloo, Онтарио, Канада).Компьютерные коды можно получить у авторов по запросу.

Дополнительная информация

Регистрационный номер

Номера доступа Swiss-Prot (http://www.ebi.ac.uk/swissprot) для белков, обсуждаемых в этой статье: BRCA1 (P38398), Erk (P27361), h3AX (P16104), HePTP (P35236), инсулин (P01308), рецептор инсулина (P06213), IRS-1 (P35568), MBP (P02686), Mek (Q02750), MKP-1 (P28562), MKP-3 (Q16828), p53 (P04637), PP1B (P62140) ), PP2A (P67775), PP2B (P16298), PP2C (P35813), pRb (P06400), PTB-1B (P18031) и PTEN (P60484).

Благодарности

Эта работа была поддержана Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 618) и Министерством исследований и образования Германии. Мы благодарим Франка Брюггемана, Бранку Каявека, Томаса Хёфера, Рене Хоффмана, Майкла Ронелленфича и Кристину Серс за полезные обсуждения.

Вклад авторов

SL разработала и выполнила начальное моделирование. SL, NB, RS и HH обсудили предварительные результаты, предложили дальнейшие расчеты и написали статью.

Ссылки

1. 1. Ху Х, Эрреро С., Ли В.П., Антонив Т.Т., Фальк-Педерсен Э. и др. (2002) Сенсибилизация передачи сигналов IFN-гамма Jak-STAT во время активации макрофагов. Nat Immunol 3: 859–866.
2. 2. Ilangumaran S, Ramanathan S, Rottapel R (2004) Регулирование иммунной системы с помощью адаптерных белков семейства SOCS. Семин Иммунол 16: 351–365.
3. 3. Pilz RB, Casteel DE (2003) Регулирование экспрессии генов с помощью циклического GMP.Circ Res 93: 1034–1046.
4. 4. Ян Э., ван Нимвеген Э., Заволан М., Раевский Н., Шредер М. и др. (2003) Скорость распада мРНК человека: корреляция с функциональными характеристиками и атрибутами последовательности. Genome Res 13: 1863–1872.
5. 5. Futcher B, Latter GI, Monardo P, McLaughlin CS, Garrels JI (1999) Выборка протеома дрожжей. Mol Cell Biol 19: 7357–7368.
6. 6. Swameye I, Muller TG, Timmer J, Sandra O, Klingmuller U (2003) Идентификация нуклеоцитоплазматического цикла в качестве удаленного датчика в клеточной передаче сигналов путем моделирования на основе данных.Proc Natl Acad Sci U S A 100: 1028–1033.
7. 7. Schoeberl B, Eichler-Jonsson C, Gilles ED, Muller G (2002) Вычислительное моделирование динамики каскада киназ MAP, активируемого поверхностными и интернализованными рецепторами EGF. Nat Biotechnol 20: 370–375.
8. 8. Sesti G, Federici M, Hribal ML, Lauro D, Sbraccia P и др. (2001) Дефекты системы субстрата рецептора инсулина (IRS) при метаболических нарушениях у человека. FASEB J 15: 2099–2111.
9. 9.Mellstrom B, Achaval M, Montero D, Naranjo JR, Sassone-Corsi P (1991) Дифференциальная экспрессия членов семейства jun в мозге крысы. Онкоген 6: 1959–1964.
10. 10. Видманн С., Гибсон С., Джонсон Г.Л. (1998) Зависимое от каспазы расщепление сигнальных белков во время апоптоза. Механизм отключения антиапоптотических сигналов. J Biol Chem 273: 7141–7147.
11. 11. Миллер С., Ясуда М., Коутс Дж. К., Джонс Ю., Мартон М. Э. и др. (2002) Нарушение дендритной трансляции CaMKIIalpha нарушает стабилизацию синаптической пластичности и консолидацию памяти.Нейрон 36: 507–519.
12. 12. Whitfield ML, Sherlock G, Saldanha AJ, Murray JI, Ball CA и др. (2002) Идентификация генов, периодически экспрессируемых в клеточном цикле человека, и их экспрессия в опухолях. Mol Biol Cell 13: 1977–2000.
13. 13. Ахтар Р.А., Редди А.Б., Мэйвуд Э.С., Клейтон Д.Д., Кинг В.М. и др. (2002) Циркадный цикл транскриптома печени мыши, как показывает микроматрица кДНК, управляется супрахиазматическим ядром. Curr Biol 12: 540–550.
14. 14. Блюм-Дженсен П., Хантер Т. (2001) Передача сигналов онкогенной киназы. Природа 411: 355–365.
15. 15. Fero ML, Randel E, Gurley KE, Roberts JM, Kemp CJ (1998) Мышиный ген p27Kip1 гапло-недостаточен для подавления опухоли. Природа 396: 177–180.
16. 16. Santarosa M, Ashworth A (2004) Гаплонедостаточность генов-супрессоров опухолей: когда вам не нужно идти до конца. Biochim Biophys Acta 1654: 105–122.
17. 17. Fambrough D, McClure K, Kazlauskas A, Lander ES (1999) Разнообразные сигнальные пути, активируемые рецепторами факторов роста, вызывают в основном перекрывающиеся, а не независимые, наборы генов.Ячейка 97: 727–741.
18. 18. Hazzalin CA, Mahadevan LC (2002) MAPK-регулируемая транскрипция: непрерывно изменяющийся генный переключатель? Nat Rev Mol Cell Biol 3: 30–40.
19. 19. Робертс К.Дж., Нельсон Б., Мартон М.Дж., Стоутон Р., Мейер М.Р. и др. (2000) Передача сигналов и схемы множественных путей MAPK, выявленных с помощью матрицы глобальных профилей экспрессии генов. Наука 287: 873–880.
20. 20. Legewie S, Blüthgen N, Herzel H (2005) Количественный анализ сверхчувствительных ответов.FEBS J 272: 4071–4079.
21. 21. Коэн П. (2001) Роль фосфорилирования белков в здоровье и болезнях человека. Лекция о медали сэра Ганса Кребса. Eur J Biochem 268: 5001–5010.
22. 22. Tanoue T, Adachi M, Moriguchi T, Nishida E (2000) Консервативный докинг-мотив в киназах MAP, общий для субстратов, активаторов и регуляторов. Nat Cell Biol 2: 110–116.
23. 23. Ламмерс Р., Боссенмайер Б., Cool DE, Тонкс Н.К., Шлессингер Дж. И др. (1993) Дифференциальная активность протеинтирозинфосфатаз в интактных клетках.J. Biol Chem. 268: 22456–22462.
24. 24. Goldbeter A, Koshland DE Jr (1981) Повышенная чувствительность, возникающая в результате ковалентной модификации биологических систем. Proc Natl Acad Sci U S A 78: 6840–6844.
25. 25. Розен Э.Д., Шпигельман Б.М. (2000) Молекулярная регуляция адипогенеза. Annu Rev Cell Dev Biol 16: 145–171.
26. 26. Маккей В.Л., Ли Х, Флори М.Р., Теркотт Э., Ло Г.Л. и др. (2004) Экспрессия генов проанализирована с помощью анализа массива состояний с высоким разрешением и количественной протеомики: Ответ дрожжей на феромон спаривания.Протеомика клеток Mol 3: 478–489.
27. 27. Феррелл Дж. Э. Младший (1996) Фантастическое отключение переключателя: как каскад протеинкиназ может преобразовывать ступенчатые входные данные в выходные сигналы, подобные переключателю. Тенденции Biochem Sci 21: 460–466.
28. 28. Йунг К., Зейтц Т., Ли С., Янош П., Макферран Б. и др. (1999) Подавление активности киназы Raf-1 и передачи сигналов киназы MAP с помощью RKIP. Nature 401: 173–177.
29. 29. Цанг М., Давид И.Б. (2004) Продвижение и ослабление передачи сигналов FGF через путь Ras-MAPK.Sci STKE 2004: pe17. PMID: 15082862.
30. 30. Zhao Z, Tan Z, Diltz CD, You M, Fischer EH (1996) Активация пути митоген-активируемого протеина (MAP) киназы перванадатом, мощным ингибитором тирозинфосфатаз. J Biol Chem 271: 22251–22255.
31. 31. Тонкс Н.К., Нил Б.Г. (2001) Комбинаторный контроль специфичности протеинтирозинфосфатаз. Curr Opin Cell Biol 13: 182–195.
32. 32. Фукада Т., Тонкс Н.К. (2003) Идентификация YB-1 как регулятора экспрессии PTP1B: значение для регуляции передачи сигналов инсулина и цитокинов.EMBO J 22: 479–493.
33. 33. Janssens V, Goris J (2001) Протеиновая фосфатаза 2A: строго регулируемое семейство серин / треониновых фосфатаз, участвующих в росте клеток и передаче сигналов. Biochem J 353: 417–439.
34. 34. Боллен М. (2001) Комбинаторный контроль протеинфосфатазы-1. Тенденции Biochem Sci 26: 426–431.
35. 35. Tanoue T, Moriguchi T, Nishida E (1999) Молекулярное клонирование и характеристика новой фосфатазы с двойной специфичностью, MKP-5.J Biol Chem 274: 19949–19956.
36. 36. Tanoue T, Yamamoto T, Maeda R, Nishida E (2001) Новая фосфатаза MAPK MKP-7 действует преимущественно на JNK / SAPK и p38 альфа и бета MAPK. J Biol Chem 276: 26629–26639.
37. 37. Fiering S, Whitelaw E, Martin DI (2000) Быть или не быть активным: стохастическая природа действия энхансера. BioEssays 22: 381–387.
38. 38. Рао С.В., Вольф Д.М., Аркин А.П. (2002) Контроль, использование и толерантность внутриклеточного шума.Природа 420: 231–237.
39. 39. Кук Д.Л., Гербер А.Н., Тапскотт С.Дж. (1998) Моделирование стохастической экспрессии генов: последствия для гаплонедостаточности. Proc Natl Acad Sci U S A 95: 15641–15646.
40. 40. Ferrell JE Jr, Machleder EM (1998) Биохимическая основа переключения клеточной судьбы по принципу «все или ничего» в ооцитах Xenopus. Наука 280: 895–898.
41. 41. Холоденко Б.Н. (2000) Отрицательная обратная связь и сверхчувствительность могут вызывать колебания в каскадах митоген-активируемых протеинкиназ.Eur J Biochem 267: 1583–1588.
42. 42. Браун Г.К., Холоденко Б.Н. (1999) Пространственные градиенты клеточных фосфо-белков. FEBS Lett 457: 452–454.
43. 43. Goldberg Y (1999) Протеиновая фосфатаза 2A: Кто должен регулировать регулятор? Biochem Pharmacol 57: 321–328.
44. 44. Price NE, Mumby MC (2000) Влияние регуляторных субъединиц на кинетику протеинфосфатазы 2A. Биохимия 39: 11312–11318.
45. 45. Боллен М., Беулленс М. (2002) Передача сигналов протеинфосфатазами в ядре.Тенденции Cell Biol 12: 138–145.
46. 46. Холоденко Б. Н., Хук Дж. Б., Вестерхофф Х. В. (2000) Почему цитоплазматические сигнальные белки должны быть задействованы в клеточных мембранах. Тенденции Cell Biol 10: 173–178.
47. 47. Mansour SJ, Candia JM, Matsuura JE, Manning MC, Ahn NG (1996) Взаимозависимые домены, контролирующие ферментативную активность митоген-активированной протеинкиназы киназы 1. Биохимия 35: 15529–15536.
48. 48. Zhou B, Wang ZX, Zhao Y, Brautigan DL, Zhang ZY (2002) Специфичность регулируемого внеклеточным сигналом дефосфорилирования киназы 2 протеинфосфатазами.J Biol Chem 277: 31818–31825.
49. 49. Klingmuller U, Lorenz U, Cantley LC, Neel BG, Lodish HF (1995) Специфическое привлечение SH-PTP1 к рецептору эритропоэтина вызывает инактивацию JAK2 и прекращение пролиферативных сигналов. Ячейка 80: 729–738.
50. 50. Machide M, Kamitori K, Kohsaka S (2000) Дифференциальная активация фосфолипазы c гамма 1 и фосфатидилинозитол 3-киназы, индуцированная фактором роста гепатоцитов, регулируется тирозинфосфатазой SHP-1 в астроцитах.J Biol Chem 275: 31392–31398.
51. 51. Окамура Х., Гарсия-Родригес Ч., Мартинсон Х., Цинь Дж., Виршуп Д.М. и др. (2004) Консервативный док-мотив для связывания CK1 контролирует ядерную локализацию NFAT1. Mol Cell Biol 24: 4184–4195.
52. 52. Niehrs C, Pollet N (1999) Группы синэкспрессии у эукариот. Nature 402: 483–487.
53. 53. Sturgill TW, Ray LB, Anderson NG, Erickson AK (1991) Очистка митоген-активированной протеинкиназы из обработанных эпидермальным фактором роста фибробластов 3T3-L1.Методы Enzymol 200: 342–351.
54. 54. Dagher PC (2000) Моделирование ишемии in vitro: Избирательное истощение пулов нуклеотидов аденина и гуанина. Am J Physiol Cell Physiol 279: C1270 – C1277.
55. 55. Браунтон Дж. Л., Вонг В., Ван В., Солтер М. В., Родер Дж. И др. (1998) Снижение активности тирозинкиназы и дефосфорилирования тирозина протеина путем аноксической стимуляции in vitro. Неврология 82: 161–170.
56. 56. Kobryn CE, Mandel LJ (1994) Снижение фосфорилирования белка, вызванное аноксией в проксимальных почечных канальцах.Am J Physiol 267: C1073 – C1079.
57. 57. Генрих Р., Шустер С. (1996) Регулирование клеточных систем. Нью-Йорк: Чепмен и Холл. 372 с.
58. 58. Хорнберг Дж. Дж., Брюггеман Ф. Дж., Биндер Б., Гест С. Р., де Ваате А. Дж. И др. (2005) Принципы, лежащие в основе разнообразного контроля передачи сигналов. Фосфорилирование ERK и контроль киназы / фосфатазы. FEBS J 272: 244–258.
59. 59. Lee E, Salic A, Kruger R, Heinrich R, Kirschner MW (2003) Роли APC и аксина получены из экспериментального и теоретического анализа пути Wnt.PLoS Biol 1: e10 .. DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pbio.0000010.
60. 60. Marshall CJ (1995) Специфичность передачи сигналов рецепторной тирозинкиназы: временная или длительная активация киназы, регулируемая внеклеточными сигналами. Cell 80: 179–185.

Водители по сигналам, которые не выключают указатели поворота

В колонках от 15 и 19 августа говорилось о том, почему люди в нашем районе не используют поворотники. Основная причина, по которой читатели указывали, заключалась в том, что сигналы просто предупреждают других автомобилистов о необходимости закрыть пробки в движении, чтобы потенциальный сменщик не мог перестроиться.

Ряд читателей могут больше сказать по этому поводу, а также о том, что делать с противоположной проблемой: как подать сигнал автомобилистам о том, что их шоры, кажется, застряли во включенном положении. Вот и мы:

Уважаемый доктор Гридлок:

Я езжу по нашему мегаполису в течение 20 лет, и единственное, что меня раздражает больше, чем водителей, которые не используют поворотники для смены полосы движения, — это те, кто оцепенел. , неслышащие люди, которые забывают выключить сигнал после смены полосы движения.

Мне нервничает каждый раз, когда я оказываюсь позади одного из них. Мне всегда интересно, закончили ли они свою очередь.

Это очень раздражает при движении по общественным улицам. На каждом перекрестке, к которому приближаются эти автомобили, автомобилисты за ними замедляют скорость в ожидании предстоящего поворота, которого никогда не бывает.

Джимми Пессагно

Лорел

Уважаемый доктор Гридлок:

Вы спрашивали, как подать кому-то сигнал о том, что его поворотник включен, хотя этого не должно быть.

Ваше наблюдение, которое вы, вероятно, не стали бы пробовать, в целом хорошее, но я нашел одну вещь, которая работает при подходящих условиях.

Если вы можете оказаться впереди проблемного транспортного средства и вручную быстро щелкнуть правой кнопкой поворота два или три раза, а затем сделать то же самое с левой, это даст сигнал, который отличается от скорости или последовательности обычного указателя поворота и должен привлечь внимание водителя.

Клифф Бедор

Колледж Парк

Уважаемый доктор.Gridlock:

Иногда можно заставить драйверы отключать мигающие сигналы. Несколько раз перекладывайте собственный сигнал из стороны в сторону. Эта техника, кажется, заставляет их смотреть на свой собственный сигнал поворота.

Джон Ф. Флеминг

Белтсвилль

Уважаемый доктор Гридлок:

Я из очень маленького городка, где у нас не было скоростных автострад. Когда я переехал в район Вашингтона, я обнаружил, что движение было очень пугающим, и мне было трудно ориентироваться.

Как указывают ваши читатели, водители действительно ускоряются, когда вы подаете сигнал поворота, сообщая о своем намерении сменить полосу движения.Я решил эту проблему 20 лет назад. Я всегда использую свой указатель поворота и всегда меняю полосу движения очень плавным скольжением к следующей полосе.

Если машина набирает скорость и пытается меня сбить, я просто продолжаю плавное скольжение в намеченное пространство, предполагая, что машина, наезжающая на меня, на самом деле не ударит меня. Я почти всегда успешно меняю полосу движения, и меня ни разу не сбили.

Конечно, я руководствуюсь здравым смыслом. Я не делаю этого, если чувствую, что другая машина едет неустойчиво или агрессивно или с большим транспортным средством, например грузовиком.

Daniel R Sharp

Beltsville

Уважаемый доктор Гридлок:

Я обнаружил, что у огромного числа водителей в этом районе есть автомобили, которые оснащены — или, по их мнению, оснащены — новой частью технология, которую я называю «поворотником Моисея».

Указатель поворота этого типа дает водителю ощущение, что при простом его использовании движение на полосе, в которую он / она хочет выехать, немедленно разойдется, как на Красном море.

Такие водители не чувствуют необходимости ждать, пока их впустят, а просто проталкиваются внутрь.

Мигающий указатель Moses лучше всего использовать при попытке выехать на полосу движения от бампера до бампера, которую водитель решил игнорировать до того момента, когда он должен (или почувствует, что должен) выехать на полосу, в которой он хотел быть. все это время. Скорее всего, он не хотел ждать, как остальные люди в переулке.

Да, кстати, если вы не позволяете этому человеку выехать на свою полосу движения, вы невежливый водитель — по крайней мере, так думает водитель Моисея.

Скотт Арнольд

Херндон

Уважаемый д-р.Gridlock:

Последние письма о сигналах подтверждают мою уверенность в том, что, если бы мы только обеспечили соблюдение двух вещей, которые обычно делаются по всей Европе, это сделало бы вождение намного более управляемым.

Во-первых, сделайте экзамены по вождению намного сложнее и убедитесь, что правило о сигналах поворота усвоено и соблюдается.

Во-вторых, строго соблюдайте правило запрещения движения по левой полосе на межгосударственном шоссе, за исключением обгона.

Часто проезжая большую часть Европы, я убежден, что там водители лучше из-за очень сложных тестов по вождению.Никогда не оскорбляют, если медленно едут по правой полосе. Но даже не думайте о том, чтобы ехать по левой полосе, если у вас нет суицидальных наклонностей.

Это всегда оставляет полосу для выхода для тех, кто хочет обогнать более медленного водителя.

Я никогда не отставал от водителя в Европе, который не использовал бы сигнал поворота для всего, от фактического поворота до указания проезда.

Розмари Раузино-Хеллер

Роквилл

Уважаемый доктор Гридлок:

Как отметил один из ваших читателей в своем Августе.19 колонка, наверняка там, похоже, эпидемия людей, не догадающихся, для чего нужен рычаг на рулевой колонке. Похоже, их не волнует, что машине позади них нужно будет резко снизить скорость для поворота направо или налево.

Но если бы водители немного спланировали заранее, они могли бы выехать на другую полосу без панического движения в последнюю минуту. Это позволит никого не отрезать.

Если вы пытаетесь переехать в такое короткое пространство, которое позволяет другим водителям ускориться, чтобы помешать вашему перемещению, возможно, вы слишком долго ждете.Указатели поворота не предназначены для разметки полосы движения.

Аллен Фельдман

Северный Потомак

Уважаемый доктор Гридлок:

Я предлагаю четыре причины нежелания водителей использовать поворотники: лень; незнание последствий своего поведения; невнимательность / эгоизм, отличительные черты подрастающего поколения; и (слишком часто верное) восприятие того, что моргание побудит другого парня ускориться.

Задолго до того, как я стал врачом скорой помощи, я преподавал водительское образование.Я надеюсь, что сегодня инструкторы ввернут водителям ту же мантру, что и мы тогда: подайте сигнал о своем намерении повернуть (или сменить полосу движения), посмотрите в зеркала и затем сделайте свой поворот.

Многие водители сегодня смотрят первыми и сигнализируют, только если видят на своем пути другого водителя. Они упускают важную функцию указателя поворота: предупреждают водителя о своем намерении, которого они не видят.

Если этот водитель — парень, который ждет, чтобы свернуть с улицы, на которую вы собираетесь повернуть, то не сигнализация, а грубость.Если в вашей слепой зоне окажется мотоцикл, это может привести к летальному исходу.

Stephen R. Fahey MD

Kensington

Уважаемый доктор Гридлок:

Чтобы предупредить водителей, которые, кажется, оставили на своих указателях поворота, я предлагаю следующее (работает каждый раз):

Я пытаюсь пройти такой автомобиль (при этом, конечно, не превышая установленную скорость), и когда я нахожусь прямо перед ним, я включаю свой правый указатель поворота на пять секунд, а затем левый указатель поворота на пять секунд и продолжаю делать это, пока водитель не сообщение.

Водители обычно понимают это очень быстро, и я обычно получаю благодарность, махнув рукой или мигая фарами.

Ellie Hettich

Adamstown

Уважаемый доктор Гридлок:

Находясь на флоте и находясь в Калифорнии много лет назад, я был проинформирован о том, что есть сигнал рукой, чтобы сообщить другим водителям, что их поворотник включен. Сигнал такой: быстро сожмите и разожмите правую руку на виду, управляя левой рукой.

Похоже, никто не знал, что я делаю, когда я пробовал это здесь.

Конечно, некоторые (большинство) современных автомобилей предупреждают вас звуковым сигналом о том, что ваш поворотник включен. Так что теперь забудьте о жесте рукой. Никто не узнает, что вы делаете, и решит, что вы просто еще один сумасшедший водитель.

Джон М. Хейгес

Маунт Эйри

Уважаемый доктор Гридлок:

В вашей колонке от 15 августа один из ваших читателей поинтересовался, как сообщить водителю, что его / ее указатель поворота был оставлен включенным.

Давным-давно, когда я учился в старшей школе, отец моего друга был водителем грузовика, который возил все Восточное побережье. Он был достаточно добр, чтобы научить меня водить машину. Он сказал, что дальнобойщики часто сталкиваются с этой проблемой.

Конечно, тогда еще не было автоматического выключения поворотников. Он сказал, что дальнобойщики сигнализировали другим, кто не включил свои поворотники, вставая перед нарушившим его водителем. Затем они использовали сигнал поворота, сначала левый, затем правый, и, наконец, четырехпозиционные указатели поворота для двух циклов (не имело значения, какой сигнал поворота использовался первым).

Я использовал эту маленькую уловку много раз, и она сработала.

Майк Решетар

Уолдорф

Уважаемый доктор Гридлок:

Г-н Детаранто [Dr. Gridlock, 19 августа] описание функции указателя поворота верное: «Они должны информировать других водителей о ваших планах, чтобы они могли соответствующим образом отреагировать».

Вот что можно попробовать в следующий раз, когда вы окажетесь позади автомобиля, который собирается повернуть, а водитель фактически использует свой сигнал поворота. Посмотрите, что загорается первым, сигнал поворота или стоп-сигнал.

Я обнаружил, что почти в 100% случаев я сначала вижу стоп-сигнал и должен среагировать до того, как загорится сигнал поворота.

Также обратите внимание, когда водители выезжают на полосу для поворота налево. Я обнаружил, что большинство тормозов передо мной тормозят, выезжают на полосу левого поворота и затем включают сигнал.

Ира А. Фридрих

Вудсток

Мостовые проездные

Уважаемый доктор Гридлок:

Я езжу из Гейтерсбурга на Восточный берег несколько раз в год.К кому мне обратиться, чтобы получить смарт-тег — или как он там называется — для перехода через мост через залив?

Клэр Нихтер

Гейтерсбург

В Мэриленде раньше был проездной со скидкой для пассажиров, называемый M-Tag, но он был включен в программу E-ZPass. E-ZPass хорош на пунктах взимания дорожных сборов в Мэриленде и шести других штатах: Нью-Йорке, Нью-Джерси, Делавэре, Пенсильвании, Массачусетсе и Западной Вирджинии. Вирджиния и Мэн будут на борту к концу года.Ожидается, что Нью-Гэмпшир также присоединится к этому соглашению.

Программа E-ZPass использует транспондер на вашем транспортном средстве для электронного списания дорожных сборов с вашего счета и проведения вами через пункты взимания дорожного сбора быстрее, чем автомобилисты платят наличными.

Чтобы получить E-ZPass, войдите на www.ezpassmd.com.

Мэриленд также предлагает скидки по предоплате для постоянных пользователей своих платных услуг, но я считаю, что вам придется пересекать мост через залив несколько раз в неделю, чтобы это окупилось. Чтобы узнать больше о скидках на Bay Bridge, войдите на сайт www.mdta.state.md.us.

Похвала гаишнику

Уважаемый доктор Гридлок:

Я хотел бы выразить мою признательность за прекрасную работу, проделанную офицером в вечерние часы пик на М-стрит и Висконсин-авеню в Джорджтауне.

Полицейский обеспечивает бесперебойное движение транспорта в этой подверженной тупикам зоне, особенно отворачивая автомобилистов, которые хотят сделать незаконный левый поворот с М-стрит на Висконсин.

Есть знак запрета левого поворота, но он часто игнорируется, что приводит к остановке движения.

Если вы подскажете, как отправить эти комментарии в его участок, дайте мне знать.

Кэти Хантер

Арлингтон

Напишите Роберту Конти, командиру полиции 2-го округа, по адресу 3320 Idaho Ave. NW, Вашингтон, округ Колумбия, 20016.

Также отправьте копию начальнику полиции Чарльзу Х. Рэмси, штат Индиана, 300 Ave. NW, Вашингтон, округ Колумбия, 20001.

Ужасно приятно с вашей стороны хвалить полицию за помощь в проезде через ключевые перекрестки в часы пик.

Я хотел бы услышать о любых других перекрестках, где это происходит, а также о перекрестках, где читатели хотели бы видеть дислоцированного офицера.

Исследователь транспорта Дайан Мэттингли внесла свой вклад в эту колонку.

Доктор Гридлок появляется в воскресенье в разделе «Метро» и в четверг в разделе «Экстра». Вы можете написать доктору Гридлоку по адресу 1150 15th St. NW, Вашингтон, округ Колумбия, 20071. Он предпочитает получать электронную почту по адресу [email protected] или факсы по номеру 703-352-3908. Укажите свое полное имя, город, округ, дневные и вечерние номера телефонов.

Щелкнуть выключателем и отключить изъятия? Новое исследование предлагает, как отключить неконтролируемую передачу сигналов в мозге

Мозг — точный инструмент. Его функция зависит от точно откалиброванной электрической активности, запускающей передачу химических сообщений между нейронами.

Но иногда тщательный баланс мозга выходит из-под контроля, как при эпилепсии. Электроэнцефалография, или ЭЭГ, визуализирует электрическую активность мозга и может показать, как эпилептический припадок отличается от предсказуемой волновой картины типичной мозговой активности.