Незамерзайка состав какой должен быть: Из чего должна состоять не ядовитая незамерзайка

Из чего должна состоять не ядовитая незамерзайка

Автор Андрей На чтение 3 мин. Просмотров 358 Опубликовано 11.03.2011

От ядовитых незамерзаек болит голова, слезятся глаза и притупляется внимание. Салон машины они превращают в газовую камеру. Несколько советов автолюбителям о том, как отличить безобидную химию от подкапотной мины. Каков состав хорошей незамерзайки?

Любая стеклоочистительная жидкость содержит два главных компонента: воду и спирт. Именно спирт не дает воде замерзнуть и помогает удалить грязь со стекол. Он может быть этиловый, изопропиловый или метиловый. Последний запрещен, так как его пары опасны для здоровья. В салон машины они попадают через воздухозаборники.

Первые отравления метанолом случились из-за употребления знаменитого тройного одеколона. Его придумали в 1910 году на одной из московских парфюмерных фабрик. По одной из версий свое название одеколон получил благодаря тройной очистке вредного метилового спирта.

Копеечный парфюм моментально стал популярным у любителей горячительных напитков и домохозяек. Он отлично отмывал оконные стекла и зеркала.

Как же действуют на водителя ядовитые пары? Если залить запрещенную незамерзайку с метиловым спиртом, то уже минут через 5 езды наблюдаются первые симптомы: у водителя начинает болеть голова, повышается артериальное давление.

Еще через полчаса головная боль усиливается, в горле начинает першить, глаза слезятся. При этом посторонних запахов в салоне автомобиля не чувствуется. Еще через 20 минут езды становится совсем паршиво, внимание рассеяно. Такое ощущение, что пьян или сильно уставший. Лучше остановится от греха подальше.

Производство метаноловых жидкостей в России запрещено. Метиловый спирт – сильнейший яд. Выпив всего пол чайной ложки, человек получит сильнейшее отравление, а столовая ложка уже смертельная доза.

Визуально отличить, запрещенная это жидкость или хорошая незамерзайка, практически невозможно. Даже запах у них примерно одинаковый. Чтобы вода не замерзала в тридцатиградусный мороз достаточно всего одной трети метанола. К тому же он самый дешевый из спиртов. Именно поэтому метаноловые незамерзайки до сих пор в продаже.

Пары изопропилового спирта практически безвредны. Самые лучшие незамерзайки производят на основе этилового спирта, но и стоят они значительно дороже.

Теперь вы знаете про состав хорошей незамерзайки. А головная боль, слезящиеся глаза, першение в горле – это реакция организма на отраву, которая находится под капотом. Немедленно слейте такую незамерзайку. Экономия на здоровье обходится очень дорого!

Видео

Рекомендации по эксплуатации и другие советы автолюбителям:

Оцените статью: Поделитесь с друзьями!

какой спирт должен быть – три типа

О спирте, который должен быть в незамерзающей жидкости для омывателя автомобиля, сложено немало мифов: один ядовит, второй замерзает, третий пьянит. Так какой на самом деле должен быть спирт в незамерзайке?

Есть три спирта, которые можно использовать в незамерзающей жидкости для омывателя – в смеси с водой и ароматизаторами. Собственно, все они и используются производителями, причем иногда в одной жидкости есть два вида спиртов.

От типа спирта, который есть в основе незамерзайки, в морозы зависит чистота стекла, а еще – аромат в салоне

Этиловый спирт (этанол)

Данный продукт известен также как пищевой или медицинский спирт. В качестве основы для омывайки он хорош всем: наименее вреден для организма, обладает высокими моющими свойствами, не теряет текучести при сильном морозе.

Также интересно: Сколько градусов должна быть незамерзайка

Это самый распространенный из спиртов в нашей стране, и в отличие от других стран, у нас он один из самых дешевых. В крайнем случае не исключено использование вместо незамерзающей жидкости этанола домашнего приготовления – самогона. Конечно, годится и водка фабричного производства.

Изопропиловый спирт (изопропанол)

Именно из этого спирта изготавливают абсолютное большинство жидкостей, которые поступают в официальную продажу в Украине. Между тем, у изопропанола есть существенные недостатки: имеет худшие во всей тройке моющие свойства, вреден для человека, а самое главное – на морозе он густеет, (не кристаллизуется, а именно густеет – меняет плотность). Это очень важно для автомобилей с новомодными форсунками маленького диаметра, которые распыляют жидкость тонким веером – когда совсем холодно, изопропиловая омывайка не достает до лобового стекла.

Современные форсунки, распыляющие жидкость веером, более всего чувствительны к плотности незамерзайки на морозе

Метиловый спирт (метанол)

Этим спиртом давно пугают людей – мол, ядовит настолько, что как минимум можно потерять зрение. Правда, надо добавить: если выпить 10 граммов. Интересно, что если выпить изопропиловый спирт, результат будет примерно тот же. Но остальные качества метанола как специально подобраны для его “работы” в качестве омывайки: имеет высокие моющие свойства, не имеет неприятного запаха, не густеет на морозе и стоит откровенно дешево.

Также интересно: Незамерзайка для авто: можно ли залить в бачок спирт или водку

Что интересно, пары метанола менее токсичны, чем пары изопропанола: предельно допустимой концентрации в салоне последний достигает за 5 – 10 секунд, а метанол – за 300 секунд. Однако, в легальных незамерзающих жидкостях в Украине не используется, причина – высокая токсичность при употреблении внутрь организма. Тем не менее, в развитых странах с холодным климатом именно метиловый спирт является основой жидкостей для омывателя лобового стекла.

Как видим, получается, что метиловый спирт наиболее удобен для использования его в качестве основы незамерзающей жидкости для омывателя. Но в реальности все наоборот: обычно производители берут за основу изопропиловый спирт – тот, что наименее пригоден для этого.

Метиловый спирт, несмотря на недобрую славу, имеет наилучший комплекс характеристик для “работы” в качестве незамерзайки.

Рекомендация Авто24

По большому счету, автомобилисту должно быть безразлично, на какой основе сделали омывайку, плещущуюся в бачке под его капотом. Принципиальных отличий между всеми тремя спиртами нет ни в плане безопасности для организма, ни в плане эффективности. Есть разве что один нюанс насчет изопропанола – при сильном морозе он становится гуще, и заметно теряет текучесть уже при – 15^оС. Но если вы живете не на севере страны, для вас это вряд ли будет иметь значение. Ну а поскольку наилучший баланс характеристик имеет метанол, в идеале было бы использовать именно его.

ТАКЖЕ ИНТЕРЕСНО: Как выбрать незамерзайку: мифы и правда о метанол

Состав незамерзающей жидкости для омывания стекол пропорции

Главная » Разное » Состав незамерзающей жидкости для омывания стекол пропорции

Состав незамерзайки для авто и пропорции компонентов

Незамерзающая жидкость — средство для удаления грязи и борьбы с оледенением автомобильных стёкол, а также фар. В зависимости от состава и пропорций выпускают стеклоомывающие жидкости с различной температурой замерзания и водо-грязеотталкивающими свойствами. Главными компонентами незамерзайки являются одноатомные спирты. Рассмотрим подробный состав незамерзайки для авто и пропорции компонентов.

Из чего состоит незамерзайка?

Спирты

Для предотвращения замерзания стёкол в зимнее время требуется понизить температуру кристаллизации воды. Простейшие алифатические спирты — рациональные вещества для решения подобной проблемы. Используются 3 вида одноатомных спиртов, как в смеси, так и в моно:

Не ядовит; кристаллизуется при температуре -114 °C. Применялся до 2006 года, однако в силу дороговизны и частых случаев применения внутрь в виде суррогатов был исключён из состава.

В отличие от этанола изопропиловый спирт дешевле, но обладает токсическим действием и запахом ацетона.

Отличается лучшими физико-химическими показателями. Однако сильно ядовит и запрещён к использованию в ряде стран.

Содержание технических спиртов в незамерзайке варьируется от 25 до 75%. С увеличением концентрации температура замерзания смеси снижается. Так, состав незамерзайки до -30°C мороза включает не менее 50% изопропилового спирта.

Детергенты

Следующая функция незамерзающей жидкости — удаление грязи и разводов. В качестве моющих компонентов применяют анионные ПАВ, которые действуют независимо от температуры. Также поверхностно-активные вещества улучшают смешение малорастворимых компонентов и спиртов с водой. Процентное содержание — до 1%.

Денатураты

Для борьбы с употреблением внутрь омывающих жидкостей вводят специальные добавки с неприятным запахом. Чаще добавляют пиридин, сложные эфиры фталевой кислоты или обычный керосин. Подобные соединения обладают отталкивающим ароматом и плохо разделяются в спиртовых смесях. Доля денатурирующих добавок — 0,1–0,5%.

Стабилизаторы

В целях сохранения эксплуатационных свойств в незамерзайку добавляют токсичный этиленгликоль либо безвредный пропиленгликоль. Подобные соединения повышают растворимость органических компонентов, продлевают срок использования, а также сохраняют текучесть жидкости. Содержание — менее 5%.

Ароматизаторы

Для устранения «ацетонового» аромата в стеклоомывайках на основе изопропанола используются отдушки — ароматические вещества с приятным запахом. Компонентная доля — около 0,5%.

Красители

Окраска выполняет декоративную функцию, а также указывает на процентное содержание спирта. Обычно встречаются незамерзайки с голубоватым оттенком, что соответствует 25-процентной концентрации изопропанола. Избыток красителя приводит к образованию осадка. Поэтому его содержание не должно превышать 0,001%.

Вода

Применяется деионизированная вода без каких-либо примесей. Водный дистиллят выполняет роль теплоносителя, растворителя, а также отводит загрязняющие вещества вместе с поверхностно-активным веществами. Процент воды составляет 20–70% в зависимости от спиртовой доли.

Состав незамерзайки по ГОСТу

В настоящее время в России не существует регламентированных документов по составу и изготовлению стеклоомывающих жидкостей. Однако к отдельным компонентам предъявляются нормативные требования в соответствии с безопасностью и эффективностью применения. Примерный состав зимней жидкости для омывателя стёкол со знаком соответствия РСТ по межгосударственному стандарту (ГОСТ):

• вода диминерализированная: не менее 30%;
• изопропанол: более 30%;
• ПАВ: до 5%;
• стабилизатор пропиленгликоль: 5%;
• водо-грязеотталкивающий компонент: 1%;
• буферный агент: 1%;
• ароматизаторы: 5%;
• красители: 5%.

Нормативные требования по составу

Сертификация товара учитывает степень токсичности и эксплуатационные качества средства. Так, стеклоомывайки должны эффективно справляться с загрязнениями зимой, не образовывать разводов, пятен, которые ограничивают обзор водителю. Компоненты в составе должны быть индифферентными по отношению к стеклопластиковым и металлическим поверхностям. Токсичные соединения в составе незамерзайки заменяются безвредными аналогами: метанол — изопропанолом, ядовитый этиленгликоль — нейтральным пропиленгликолем.

Незамерзайка своими руками в домашних условиях

На чтение 6 мин. Просмотров 12.1k. Опубликовано 24.10.2018 Обновлено 03.04.2020

В зимнее время очистка лобового стекла проводится при помощи специальной незамерзающей жидкости. Она позволяет эффективно удалить загрязнения и сохраняет текучесть при отрицательных температурах. Сэкономить на этом пункте затрат получиться, приготовив

незамерзайку своими руками. Для этого понадобиться несколько простых ингредиентов, а по стоимости полученный раствор существенно уступает качественной магазинной продукции.

Классический состав незамерзающей жидкости

Использование обычной воды для омывания стекол в морозы небезопасно, поэтому придуман специальный состав, сохраняющийся в жидком состоянии при отрицательной температуре.

Изначально для этих целей использовали спиртовые жидкости, а со времен перестройки на прилавках автомагазинов побывали многие вариации незамерзайки.

Компоненты состав, из чего сделана незамерзайка:

• Вода, выполняющая непосредственную функцию мойки стекол.
• Спирт, обычно изопропиловый или этиловый. Ранее его заменяли производными метанола, но сейчас доказана его небезопасность для здоровья человека и окружающей среды, поэтому официально этот компонент запрещен. В реальности можно встретить подделку на основе этого ингредиента, поэтому непроверенная продукция небезопасна.
• ПАВ или поверхностно – моющие вещества. Благодаря этому компоненту можно быстро и без дополнительного участия водителя удалить с поверхности лобового стекла жирные масляные разводы, пыль и прочие загрязнения.
• Этиленгликоль сохраняет раствор в жидком состоянии и препятствует образованию льда.
• Денатураты используются в жидкостях на основе этилового спирта. Подобная практика принята в целях избежание попыток приема жидкости внутрь. Это требование отечественных нормативов, в странах ЕС подобного нет.
• Ароматизаторы, цель которых — смыть возможный остаточный запах «химии» и презентовать продукцию с привлекательной стороны.
• Красители обеспечивают визуальную привлекательность состава, а также легкую идентификацию. Традиционно жидкость для омывателя имеет голубой оттенок. Покупка чересчур насыщенных составов может привести к окрашиванию капота, поэтому этот фактор также следует учитывать при покупке.

Несмотря на большой выбор покупных составов, вопрос, как сделать незамерзайку своими руками, актуален, как и во времена тотального дефицита.

Сомнительное первенство по фальсификации автомобильных расходников принадлежит именно жидкости для стекол, поэтому можно снизить возможный риск, приготовив состав самостоятельно.

Подобные составы не совершенны, но доступны и проверены годами.

Как сделать незамерзайку в домашних условиях

Рецептам приготовления жидкости для стеклоомывателя посвящены многие темы на форумах автолюбителей. Подобное решение не рекомендуется производителями авто, но в большинстве случаев правильно приготовленная незамерзайка способна заменить аналогичный купленный товар.

Выделив основные рецепты приготовления, можно ориентироваться на приведенную информацию. Автолюбители делают незамерзайку быстро своими руками.

Незамерзайка своими руками из спирта

Подобный рецепт можно смело считать «классическим», ведь он использовался еще в те времена, когда о специальной жидкости для бачка омывателя многие владельцы авто даже не слышали. Приготовить его просто, достаточно смешать медицинский спирт с предварительно очищенной водой (в идеале — дистиллированной). Пропорции напрямую зависят от «крепости» спирта.

Как проводится смешивание:

• Спирт 97% берется из расчета 650 мл на 3 литра воды.
• Спирта 70% концентрации необходимо взять больше — 750 мл на 3 л.воды.

Моющие способности и устранение запаха обеспечиваются добавлением в приготовленный раствор горсти стирального порошка. Перед заливкой в бачок смесь хорошо перемешать до полного растворения крупинок. Самодельная антизамерзайка готова!

Незамерзайка из водки

Многие автолюбители практикуют использовать для очистки стекла недорогую водку. Этиловый спирт, содержащийся в ней, не замерзает на морозе и отлично выполняет свою функцию. Подобный рецепт чреват дополнительными трудностями: стойким запахом перегара в салоне и повреждениями резиновых уплотнителей при непосредственном контакте с жидкостью. Избежать подобного можно, используя менее концентрированные составы и дополнительную ароматизацию. В подобных смесях часто используют и антифриз. Его добавляют из расчета 1 см³ на каждый градус ниже нуля. На пять литров готового раствора это будет 300 мл антифриза. Подобная смесь используется при температуре окружающего воздуха до -20 градусов.

Незамерзайка из средства для мытья стекол

Неплохой вариант незамерзающей жидкости получиться из обычного средства для стекол. Необходимо выбрать качественный раствор на основе спирта. Что остается сделать, так это смешать его в пропорциях 1:2 с водой. На 1 литр незамерзайки надо смешать 1 часть средства и две воды.

Незамерзайка из фейри

Простой и дешевый вариант получается из моющего средства для посуды. Для этого необходимо взять на 5 литров воды всего 1,5 столовых ложек концентрированного средства. Качество готового раствора напрямую зависит от выбранного бренда. Также важно не использовать подобные составы при температуре за окном ниже 10 градусов мороза. Чтобы жидкость и впрямь не замерзала при пониженной температуре, в состав необходимо добавить спирт.

Важный нюанс: испытать «стойкость» незамерзайки можно в домашних условиях. Для этого часть жидкости можно вынести на балкон и проверить ночное понижение температуры. Хороший раствор не должен замерзнуть или дать осадок. Если это произошло, использовать подобные смеси небезопасно для вашего авто.

Незамерзающая жидкость из изопропилового спирта

При наличии изопропилового спирта можно приготовить практически «брендовую» незамерзайку. Она будет состоять из спирта, воды и моющего средства. Традиционно спирт с водой разбавляют в соотношении 1:1, а моющее средство добавляется и разводят из расчета 1 – 2 ст.л на 3 литра полученной смеси. Полученный раствор используется при температуре до -20 градусов. Применение жидкости, выдерживающей куда более серьезные морозы, требует увеличения процентного соотношения спирта.

Инструкция по изготовлению

Бюджетный вариант незамерзайки включает в состав чистую воду (желательно отфильтрованную), моющую жидкость для посуды, спирт, жидкое мыло и средство для окон.

От качества исходных ингредиентов напрямую зависят моющие способности и стойкость к отрицательным температурам полученного состава, поэтому не стоит экономить на этом пункте.

Пропорции состава будут следующие:

• три литра воды;
• 0,5 литра спирта;
• 2 ч.л средства для мытья окон;
• 1 ч.л жидкого мыла;
• 1 ч.л средства для мытья посуды.

Для приготовления незамерзайки достаточно смешать все ингредиенты вместе. Перед применением непосредственно для авто, стоит испытать состав, оставив на ночь на морозе или в холодильной камере. Если с полученной смесью на утро ничего критичного не сталось: жидкость в составе не замерзла, на дне не выпал осадок, ее смело можно использовать.

Видео рецепты незамерзающей жидкости (для себя или продажи):

Наглядный процесс приготовления раствора для стеклоомывателя авто представлен на видео.

Незамерзайка своими руками: фото, как сделать, состав

В осенне-зимний период погодные условия резко меняются, на улице холодает и выпадает снег. Использовать летний вариант жидкости для омывателя стекол уже нельзя, если она замерзнет, то может повредить всю систему. В большинстве случаев водители стараются покупать незамерзайку в автомобильных магазинах. Однако такая жидкость может иметь низкое качество, поэтому лучше сделать ее самостоятельно.

Из чего состоит магазинная жидкость для омывателя

Как правило, в магазинах можно найти несколько категорий омывайки:

• Готовая смесь – такая жидкость будет отличаться не только предельной температурой использования, но и цветом, запахом. Можно встретить составы, которые выдерживают температуру от 10 до 40 градусов мороза.
• Концентрат – стоит на порядок дороже, но его можно разбавлять в определенных пропорциях очищенной водой. Так каждый автолюбитель может сам смешивать состав с водой и делать незамерзайку для любых погодных условий.

В целом состав всех жидкостей примерно одинаковый:

• Спиртовая основа – в таких жидкостях могут использовать как этиловый, так и изопропиловый спирт. Некоторые производители стараются не добавлять спирт, так как он влияет на запах готового продукта.
• Дистиллированная вода – служит основой для состава.
• Активные добавки.
• Этиленгликоль – позволяет готовому составу оставаться в состоянии жидкости даже при критических температурах.

Кроме того, в составе каждой незамерзайки имеются красители, которые позволяют создавать разный окрас. Также производители добавляют различные ароматизаторы, скрывающие неприятный запах спиртовой основы.

На заметку! В дешевых незамерзайках используют некачественные пищевые красители, которые могут забивать сеточку насоса омывателя. При постоянном использовании такого состава насос быстро выходит из строя. Иногда достаточно одной зимы, чтобы система пришла в негодность.

Незамерзайка своими руками

Ассортимент современных жидкостей для стекол просто огромен. Причем можно купить 5-6 литровую канистру по хорошей цене. Но, как мы уже писали, дешевые составы могут не только неприятно пахнуть, но и негативно влиять на работу системы. Поэтому многие автовладельцы предпочитают самостоятельно делать незамерзайку.

Спирт и водка

Самую простую незамерзайку для зимней очистки стекол можно создать на основе «дедовского» способа. Для этого необходимо взять 3 л дистиллированной воды и примерно 600-650 мл 97%-го спирта. При меньшей крепости основы следует добавлять спирт по следующей схеме:

• 70%-й спирт (водка) 700-750 мл;
• 1,2 литра 40%-й водки.

Лучше всего использовать более чистый медицинский спирт, так как он меньше пахнет и лучше сохраняет характеристики при минусовой температуре. Спирт и воду необходимо смешать в подходящей посуде и добавить примерно 1-2 столовых ложки любого порошка для стирки (автомат). Состав необходимо хорошенько смешать, чтобы порошок полностью растворился.

Незамерзайка на основе жидкости для мытья стекол

Еще один неплохой состав можно сделать из обычного жидкого средства для мытья стекол. Необходимо взять 2 л чистой воды и добавить 1 л любого средства для мытья стекол. Подойдет только тот в вариант, где в составе есть любой спирт.

Более простой вариант незамерзайки можно приготовить с применением средства для мытья посуды. Необходимо взять 1-2 ложки моющего вещества и разбавить в 5 л воды. В этот состав заливается один флакон медицинского спирта. Такая жидкость подойдет для регионов с очень теплой зимой.

Для заморозков

Если осень застала врасплох, а жидкость купить не успели, на помощь придет обычный столовый уксус. Необходимо смешать 9%-й столовый уксус с очищенной водой (лучше брать дистиллированную воду) в одинаковых частях. При низкой температуре воздуха такой раствор не поможет, но с заморозками справится.

Идеальный состав на основе изопропилового спирта

Лучшими составами считаются жидкости, в которые входит изопропиловый спирт. Такая незмерзайка остается в жидком состоянии даже при 40 градусах мороза. Для приготовления состава необходимо взять примерно 5 л чистой воды и добавить 500 мл 90%-й спиртовой основы.

Выводы

Сделать зимнюю жидкость для омывателя стекол собственноручно очень просто. Вы будете точно понимать, какой состав заливаете в бачок. Главное – соблюдать указанные пропорции, и никакие морозы вам будут не страшны!

Загрузка…

Незамерзайка своими руками для авто: как приготовить стеклоомывающую жидкость

Для очистки лобового стекла автомобиля от наледи, снега и грязи в холодное время года в систему стеклоомывателя заливается незамерзайка — специальная жидкость, сохраняющая свои физические и моющие свойства при температурах до -35С.

На современном рынке можно найти большое количество недорогих «незамерзаек». Как минимум 10-15% из них – подделка под продукцию известных брендов, которая не соответствует требуемым стандартам, не выдерживает температуры ниже -15С, некачественно очищает стекла и часто оставляет подтеки и масляные разводы на стекле.

Качественная же незамерзающая жидкость для стеклоочистителя обычно стоит достаточно дорого и расходуется быстро, чувствительно увеличивая расходы на обслуживание авто, которые в зимнее время и без того достаточно высоки.

Единственный выход из положения – изготавливать эффективную незамерзайку своими руками из недорогих подручных средств. Как это можно сделать, и какие компоненты необходимы для смешивания?

 

Обычные составы незамерзаек

Любая заводская незамерзайка для стеклоочистителя имеет в основе все ту же воду. Однако на морозе вода замерзает и может разорвать бачок, водоводы и форсунки. Поэтому в воду добавляются примеси (спирты), которые увеличивают морозоустойчивость жидкости и обладают эффективными очищающими свойствами.

Большинство современных незамерзающих жидкостей создается на основе смеси воды и одного из трех спиртов:

• Метилового – самая дешевая незамерзайка, которая почти не выпускается (только контрафакт) из-за токсичности испарений метила для человека и целостности элементов и систем автомобиля. Обычно не имеет никакого запаха.
• Изопропилового – наиболее популярная, безопасная и недорогая смесь с легким запахом ароматизатора.
• Этилового – дорогая жидкость на основе этила с характерным «водочным» запахом.

Кроме того, в составе заводской незамерзайки могут присутствовать моющие вещества. Наиболее важными характеристиками жидкости являются температура замерзания, кинематическая вязкость (условия загустевания) и коэффициент поверхностного натяжения создаваемой смесью защитной пленки на стекле.

Поэтому, покупайте незамерзайку только известных брендов у проверенных продавцов, и при покупке всегда внимательно читайте этикетки и паспорт изделия! А если хотите сэкономить, изготавливайте незамерзающую жидкость для стеклоочистителя своими руками – это несложно и недорого.

Как приготовить незамерзайку

Заняться производством низкотемпературного стеклоочистителя для автомобиля имеет смысл, если вам приходится постоянно эксплуатировать машину в суровом зимнем климате. Собственное производство жидкости позволит прилично сэкономить на покупке заводской качественной незамерзайки и гарантированно получить смесь, которая не замерзнет «вдруг» и даст хороший очистительный эффект.

Существует несколько нетрудозатратных и экономически недорогих способов приготовления жидкости для стеклоочистителя:

С этиловым спиртом/водкой

В идеале, конечно, лучше использовать недорогой изопропиловый спирт, но он не всегда есть под рукой. Вместо него можно смешать воду со спиртом или водкой. Для этого достаточно добавить в пятилитровую бутыль с водой три стакана медицинского или питьевого спирта. Если он уже разбавлен до 70% — можно добавить 4 стакан и засыпать одну столовую ложку обычного порошка для стирки. Имейте в виду: чем меньше плотность спирта, тем больше должна быть его доля в воде, чтобы смесь не загустевала и не замерзала в -25С.

С уксусом

Уксус также не дает стеклоочистной жидкости замерзать при температурах до -10С. Для приготовления смеси необходимо добавить в воду уксусную кислоту в пропорции 1:1. При сильных морозах уксусную кислоту лучше не использовать или следует добавить в жидкость еще стакан уксуса. Главная проблема в резком запахе – чем выше содержание уксуса в воде, тем сильнее он будет чувствоваться в салоне.  

Незамерзайки на основе бытовых чистящих средств

Если уксус и спирт отсутствуют под руками, или вы опасаетесь неприятных запахов в салоне, можно попробовать стеклоочистители на основе бытовой химии с минимальными ароматическими свойствами.

 

Со средством для мытья окон

Смесь можно приготовить на основе обыкновенного недорогого очистителя для окон Главное, чтобы он был на спиртовой основе. Для приготовления одного литра незамерзайки необходимо добавить 0.5 литра средства для мытья окон (то есть, пропорция 2:1).

Со средством для мытья посуды

Средство для мытья посуды следует выбирать только концентрированное, с приятным запахом и гарантированными чистящими свойствами. Перед смешиванием с водой следует выставить емкость со средством на мороз и убедиться, что оно не загустевает и не замерзает.

Чтобы получить 5 литров стеклоомывателя-незамерзайки, в воду следует добавить всего 1-1.5-2 столовых ложки чистящего средства, тщательно его размешать и растворить.

На основе аммиака

Аммиак в смеси с водой также существенно снижает температуру замерзания жидкости. Добавлять его в воду следует в пропорции 1:3 и тщательно перемешать до полного растворения. Перемешивать следует осторожно, чтобы не образовывалась пена.

Эта смесь хороша тем, что ее можно адаптировать к усиливающемуся морозу: в жидкость нужно просто добавить полстакана уксуса на литр, а резкий запах можно забить ароматизаторами.

Что важно помнить?

При изготовлении всех вышеперечисленных вариантов незамерзающих жидкостей следует соблюдать некоторые общие правила:

• Можно использовать только дистиллированную или питьевую воду из емкостей – она лишена водопроводных примесей и хлора, которые могут изменить физические и химические свойства жидкости.
• Любой вариант смеси следует изготовить сначала в небольшом количестве и опробовать ее функциональность, чистящие свойства, температуру замерзания, наличие неприятного запаха, а также моющий эффект и отсутствие разводов и пятен на стекле после высыхания стеклоочистителя.
• Заливать полный бачок «домашней» незамерзайки не следует. Лучше сначала добавлять ее небольшими порциями в заводской стеклоочиститель, постепенно доливая и заменяя его. Так вы сможете понаблюдать за тем, как ведет себя жидкость и насколько она эффективна.
• Смеси лучше готовить на свежем воздухе, а готовые незамерзайки не следует держать в закрытых жилых помещениях.
• Если на морозе жидкость начнет густеть, ее можно разбавить уксусом или небольшим количеством спирта.

В заключении следует отметить, что зимняя стеклоомывающая жидкость на основе незамерзающих присадок способна сохранять свою текучесть, быстро топить наледь и очищать лобовое стекло от грязи при температурах до -35С.

Однако «фирменная» незамерзайка известных брендов стоит немало, а в зимний период года расходуется быстро. Чтобы сэкономить на частой покупке незамерзающего стеклоочистителя, вы можете изготавливать такую жидкость своими силами из подручных средств – спирта (водки), уксуса, моющих средств для окон или посуды, аммиака в смесях с водой в разных пропорциях.

Предложенные рецепты таких незамерзающих смесей изобретены давно и доказали свою надежность, эффективность и действенность. Главное использовать чистую воду, добавлять в нее компоненты в точных пропорциях, и проверять морозостойкость, чистящие свойства и безопасность для человека до того, как она будет залита в бачок стеклоомывателя.

 

лучшие рецепты изготовления с использованием моющих средств и спиртов

Из доступных компонентов и по простым способам можно сделать незамерзайку своими руками в домашних условиях. Для самостоятельного изготовления потребуется подготовить состав, приближенный к жидкостям от ведущих производителей. Вам понадобится следовать пошаговой рецептуре, соблюдать пропорции и подобрать объемную емкость для смешивания.

Приготовление незамерзающей жидкости

Чистота лобового и боковых стекол, зеркал – важная составляющая безопасного вождения. Видимость на дороге и ориентирование в дорожной ситуации зависит от прозрачности стеклянных элементов автомобиля. Использование заводских жидкостей не исключает образование ледяного нароста из-за попадания на стекла антигололедных реагентов.

Стеклоомывающая жидкость для зимнего использования необходима для безопасного и комфортного вождения. Нанесение незамерзающей жидкости на стекла исключит обледенение, образование конденсата в результате разности температур.

Заводские жидкости имеют стандартный состав. Они изготовлены из спирта с добавлением:

• поверхностно-активных веществ;
• отдушки;
• дистиллированной воды;
• замедлителей коррозии;
• красящего пигмента.

Пропорции каждого компонента зависят от температурного режима, для которого изготавливают незамерзающий стеклоомыватель.

Стандартный состав незамерзайки

Незамерзающая жидкость препятствует обледенению стекол при отрицательных температурах (до -30 градусов), исключает образование подтеков, бликования, обработка ею обеспечивает комфортные условия для вождения зимой.

Заводские составы изготавливают на основе спиртов:

• изопропилового. Изопропанол характеризуется резким запахом, способным обжечь слизистые носоглотки и органов зрения. Обработка с его использованием исключает ледяной нарост на стекле, эффективно очищает пыль, жирный налет;
• этилового. Безопасен для человека. Его используют в пищевой промышленности. Эффективен в борьбе с обледенением и жирными пятнами;
• метилового. Древесный спирт токсичен. Высокая концентрация компонента при попадании в дыхательные пути способна вызвать ожог, аллергические реакции, отравление. Хорошо отмывает грязь, препятствует образованию радужной пленки.

Используйте для заливки качественные стеклоомывающие составы, в производстве которых используется безопасный спиртовой компонент. Изготовление незамерзайки в домашних условиях позволит сделать нетоксичную жидкость, не оказывающую негативного воздействия на организм водителя и пассажиров.

Стандартный состав для зимнего автомобильного омывателя стекол, эффективного при температуре до -30 градусов	Пропорции на 10 л незамерзающего жидкого средства, мл
Антифриз	1000
Изопропиловый спирт	7000
ПАВ	40
Красящий пигмент	500
Водный дистиллят	1500

В готовых составах используют спиртовые смеси – порядка 40% этилового спирта, 30% метанола, более 60% изопропилового спиртового раствора. Безопасные зимние стеклоомыватели на этаноле в продаже встречаются редко. Утвержденных стандартов по производству незамерзающих средств не существует. Поэтому рекомендуется самостоятельно сделать незамерзайку самому по простым рецептам приготовления. В зарубежных жидкостях преобладает неопасный метилкарбинол. Доля опасных веществ в иностранных омывайках не превышает 1%.

Большинство зимних жидких составов для исключения обледенения стекол производят на основе изопропанола. Чем ниже температура, при которой планируют использовать жидкость, тем больше компонента потребуется для производства стеклоомывателя.

Изопропиловый спирт, объем в мл на приготовление готового средства в канистрах по 5 л	500	1250	2500	3000	3500	4000
Температурный режим, градусы	-5	-10	-20	-25	-30	-40

Простые рецептуры незамерзайки

Незамерзающий раствор для авто целесообразно приготовить самостоятельно. Это связано не с поиском экономической выгоды, а ради сохранения здоровья. Большинство зимних стеклоомывателей имеют в своем составе высокую концентрацию токсичных компонентов. Самостоятельное изготовление жидкости позволит получить состав с нужными свойствами, безопасное для окружающих.

Важное!

Для приготовления незамерзайки своими руками понадобится спирт. Этот компонент является основой стеклоомывающего средства для зимнего использования. Подбор главного ингредиента определит итоговую стоимость домашнего раствора для автомобильных стекол.

Изготовление незамерзающей жидкости своими руками потребует:

• расчета пропорций;
• тары большого объема;
• спецодежды;
• средств защиты органов дыхания, зрения, кожи.

Смешивание компонентов проводите в хорошо освещенном, проветриваемом помещении. Заранее рассчитайте количество ингредиентов, закупите составляющие смеси, приготовьте спецодежду.

На спирту

Главный модификатор незамерзающих растворов – это спиртсодержащий ингредиент. Чем больше спирта в смеси, тем лучше свойства незмерзайки. Используйте для самостоятельного приготовления жидкости этанол, диметилкарбонол или денатурат. Компоненты имеют разные характеристики по вязкости, запаху и температурному пределу замерзания. Наиболее эффективен против обледенения метанол.

Медицинский спирт дороже других спиртсодержащих ингредиентов и поможет справляться с появлением ледяной корки только до -20 градусов. Денатурат запрещен для свободной продажи. Поэтому готовьте домашний незамерзающий раствор из изопропанола, эффективный при температурном диапазоне до -30 градусов, по следующему алгоритму:

• в большую полипропиленовую емкость налейте 4 л дистиллированной или отфильтрованной воды;
• залейте в тару 4 л диметилкарбонола;
• добавьте 20 мл безхлорного средства для мытья посуды;
• аккуратно перемешайте жидкости;
• плотно закройте бутыль.

Регулируйте концентрацию изопропанола. Если в вашем регионе зимой столбик термометра не опускается ниже -15 градусов, уменьшите количество компонента в 2 раза.

Температурный предел замерзания, градусы	Крепость спиртового ингредиента, %	Концентрация спирта, %
-4	10	8
-7	20	17
-15	30	26
-21	50	44
-23	60	54
-30	70	65
-35	80	75

Залейте готовый раствор против обледенения в соответствующий отсек. Проверьте жидкость в действии. Наблюдайте за чистотой стекла в процессе эксплуатации автомобиля.

Из стеклоомывателя

Бытовое средство для мытья домашних окон может стать основным компонентом в самостоятельном приготовлении незамерзающей жидкости для эксплуатации легковой машины зимой.

Следуйте алгоритму:

• возьмите 500 мл готового средства для стекол;
• смешайте с 1000 мл отфильтрованной или дистиллированной воды;
• перемешайте составы;
• закройте тару.

Готовый раствор содержит пенящиеся вещества, изопропанол, красящий пигмент и отдушки. В результате получается концентрат средства. Разведение водой уменьшит концентрацию ингредиентов, позволит безопасно использовать жидкость в автомобиле.

На водке

Незамерзайка из водки – бюджетный вариант против обледенения автомобильных стекол. Для приготовления возьмите любой по цене и качеству алкогольный 40-градусный напиток. Приготовление раствора позволит создать безопасные условия для вождения машины при температуре до -27 градусов.

Готовьте смесь по следующему рецепту:

• возьмите 0,25 л водки любой марки;
• добавьте 1 л отстоявшейся, отфильтрованной или дистиллированной воды;
• выдавите к компонентам сок 1 лимона;
• перемешайте ингредиенты.

Смесь обладает ярко выраженным спиртовым запахом. Будьте готовы к объяснению с инспекторами ДПС при необходимости.

На моющем средстве для посуды

Популярный способ приготовления незамерзайки из «Фэйри» позволит получить безопасное экономичное средство против обледенения автомобильных стекол. Недостатком рецепта является отсутствие данных об эффективности применения раствора при отрицательных температурах и параметров вязкости.

Для самостоятельного изготовления домашнего незамерзающего средства на основе геля для мытья посуды воспользуйтесь пошаговым алгоритмом:

• приготовьте пластиковую чистую бутыль для смешивания жидкостей;
• влейте в тару 60 мл жидкости для мытья посуды;
• добавьте 5000 мл отфильтрованной или дистиллированной воды;
• перемешайте компоненты.

Важное!

Использование в народных рецептурах приготовления домашних незамерзаек дистиллированной воды исключит оседание солей и взвесей на деталях форсунок и внутренней поверхности насоса.

Практические наблюдения показали эффективность раствора при температурном режиме до -10 градусов. При более сильном морозе самодельная незамерзайка становится густой. Используйте самодельный состав из моющего средства для посуды только в случае острой необходимости. Вязкая жидкость и повышенное содержание поверхностно-активных веществ способны вывести насос подачи стеклоомывателя из строя.

Необычные рецептуры

Автовладельцы в целях получения эффективного незамерзающего раствора для автомобильных стекол используют разные сочетания ингредиентов. Ознакомьтесь с нестандартными методиками приготовления незамерзаек своими руками:

• на самогоне. Напиток крепостью от градусов смешайте с чистой водой в пропорциях 1:2. Состав эффективен при температуре до -25 градусов;
• на уксусе. Смешайте 500 мл уксуса 6% с 500 мл отфильтрованной воды, добавьте 100 мл геля для мытья посуды. Использует средство до -15 градусов;
• на стиральном порошке и медицинском спирте. 125 мл этанола крепостью 96% смешайте с 1500 мл дистиллированной воды, добавьте чайную ложку порошкового средства для стирки одежды. Раствор поможет бороться с обледенением стекла до -25 градусов;
• с эфирным маслом, изопропиловым спиртом, синькой. Возьмите изопропанол 500 мл, добавьте отфильтрованную воду 500 мл, налейте гель для мытья посуды 10 мл, киньте 40 г синьки, влейте антифриз и капните 1-2 капли масляной жидкости. Средство поможет против промерзания стекол при температуре до -30 градусов.

Народные рецепты, в составе которых не преобладает спиртосодержащий компонент, могут привести к поломке насосного механизма из-за оседания солей, частичек ПАВ внутри системы. Периодически промывайте стеклоочистительные каналы готовыми магазинными средствами.

Полезные советы

Самостоятельное изготовление незамерзающих растворов требует осторожного обращения с ингредиентами и соблюдения пропорций. Воспользуйтесь рекомендациями по работе с растворами в домашних условиях:

• смешивайте компоненты на удалении от пищевых продуктов, детей, растений, домашних животных;
• готовьте средство при открытых окнах;
• на глаза наденьте защитные очки, на нос и рот повязку;
• избегайте вдыхания паров ингредиентов;
• не допускайте разбрызгивания и протекания смесей;
• используйте для конечного продукта герметичную тару с плотно закручивающейся крышкой;
• готовьте не более 5 л раствора;
• храните самодельную незамерзайку в темном прохладном месте;
• исключите курение во время изготовления смеси;
• чтобы уменьшить испарение спирта, добавьте антифриз;
• при первых признаках недомогания прекратите смешивание или эксплуатацию автомобиля;
• при раздражении слизистой носа или глаз, неприятном запахе в салоне авто промойте систему стеклоомывателя дистиллированной водой и готовыми средствами для автомобильных стекол;
• тестируйте полученный раствор на коротких маршрутах;
• используйте в качестве отдушки эфирные масла с ненавязчивыми запахами. Цитрусовые и фруктовые запахи могут спровоцировать головную боль.

После заправки самодельной незамерзайки включите дворники. Дождитесь, пока щетки сделают по 4 круга. Высохшее стекло должно быть чистым, без потеков и радужных разводов.

Следование простым алгоритмам и смешивание доступных ингредиентов позволит легко сделать незамерзайку своими руками в домашних условиях. С помощью приготовления самодельного зимнего стеклоомывателя можно добиться нужных характеристик по замерзанию, запаху, вязкости.

Незамерзающий омыватель стекла (-25-30) своими руками

Незамерзающая жидкость для омывания стекол по своему химическому составу не слишком сложна. Главное, в ее приготовлении найти качественные, очищенные ингредиенты без лишних примесей, а затем соблюсти точные пропорции в их смешивании. Такие рецепты выручат в том случае, если расход жидкости слишком большой. Кроме того, подобные самодельные составы зачастую выдерживают именно ту температуру, на которую рассчитаны, в отличие от своих фабричных «конкурентов».

Изопропиловый спирт

Спиртосодержащие компоненты будут основными в любой незамерзающей жидкости. Именно с запретом на метиловые составы было связано резкое подорожание готовых смесей, а также появление у них резкого и крайне неприятного запаха.

Для самодельных незамерзаек можно использовать изопропиловую разновидность. Такой спирт имеет отличные характеристики вязкости при низких температурах, но не обладает достаточными обезжиривающими свойствами. Поэтому использовать изопропил в чистом виде бесполезно, большая часть загрязнений останется на стекле.

На заметку! 

Незамерзайка из обычной водки не подойдет для заправки бачка. Она начинает густеть при -20, окончательно замерзает при -27 при условии, что была произведена по оригинальным рецептурам без нарушений. Лучше использовать самогон, если нет альтернативы.

Для изготовления домашней смеси необходимо:

• 3,5 л спирта;
• 0,75 л дистиллированной воды;
• 10 г любых эфирных масел;
• 0,5 л антифриза;
• 0,02 л ПАВ-содержащих продуктов;
• 0,25 л «синьки».

Этого количества достаточно для изготовления пяти литров незамерзающей безопасной жидкости. Сделать смесь можно про запас, свои свойства она не потеряет в течение одного сезона. Это важно, поскольку найти изопропиловый спирт в таре объемом менее 5 литров крайне проблематично. Если нет дистиллированной воды, можно использовать фильтрованную, но это нежелательно из-за возможного налета на деталях узлов автомобиля. ПАВ – это поверхностно-активные вещества, которые и моют любой материал, в том числе стекло. Они содержатся в шампунях глубокой очистки, средстве для мытья посуды, даже в универсальных чистящих растворах. Главное, чтобы продукт был способен активно образовывать пену, тогда и на холоде он будет работать.

Количество дополнительных ингредиентов можно менять. Уровень термостойкости зависит от соотношения спирта и воды. Чтобы омывайка, сделанная своими руками, выдерживала охлаждение до -40 градусов, нужно 4 литра спирта на 1 литр воды. Для -30 градусов достаточно 3,5 литров основного компонента. Если температура не опускается ниже -25 градусов, необходимо уже 3 литра. Если необходимо провести расчет для других температур, следует пользоваться химическими таблицами, поскольку зависимость нелинейная. То есть нельзя просто поделить 40 градусов пополам и вычислить, что 2 литра спирта выдержат замораживание до -20.

«Синька» в рецепте нужна только для окрашивания общей массы. Ее стоит добавить, чтобы обозначить емкость с незамерзайкой и исключить перепутывание с другими жидкостями. Антифриз в рецепте такой незамерзайки для автомобиля призван замедлить испарение паров спирта. Даже в смеси с водой он будет буквально исчезать со стекла. Чтобы щетки успели смыть всю грязь, важно замедлить процесс. Но самому сделать безопасную для здоровья незамерзайку в омыватель можно и без него.

Этиловый спирт

Для суровых климатических условий эффективен будет состав на основе этилового спирта. Цена базового компонента намного выше в сравнении с изопропилом, однако и порог замерзания иной, около минус 500 градусов.

Для приготовления незамерзайки необходимо смешать ингредиенты в пропорциях:

• 30% спирта;
• 70% воды;
• 5 г моющего средства.

ПАВ-ов в этом рецепте нужно чуть меньше, поскольку этиловые соединения не дают им замерзать даже на сильном морозе. Важно не переборщить с пенящимися веществами. Если их будет слишком много, не избежать появления разводов на стекле автомобиля.

На заметку! 

Экономически производство такой незамерзайки в домашних условиях невыгодно. Однако только подобный состав сможет выдержать температуру ниже -40 градусов, поэтому изготовить незамерзайку высокого качества в домашних условиях стоит жителям северных регионов.  

Нередко этиловый спирт подделывают. Поэтому перед заправкой бачка важно проверить смесь. Ее выставляют на мороз на 8 часов. Признаком термостойкости будет отсутствие кристаллов и не измененная жидкая консистенция. Незамерзайка не должна превратиться в густой гель.

Уксус и аммиак

Если бюджет крайне ограниченный, можно отказаться от использования спирта в составе вообще. Аналогичными свойствами обладают уксусы и аммиак. Они практически не замерзают, но имеют неприятный запах, который долго не выветривается. Летучие вещества быстро испаряются при температурах ниже минус 50 градусов, поэтому такие жидкости хороши для Крайнего Севера.

Для приготовления первого варианта потребуется уксус в концентрации 9% и дистиллированная вода. Смешать их нужно в пропорции 1:1. Важно помнить, что вливать нужно кислоту в воду, а не наоборот. Чтобы сделать незамерзайку своими руками для авто на основе аммиака без спирта смешивают воду и активное вещество в пропорции 3:1. Жидкость не потеряет свои свойства даже при -200 градусах.

Зимняя омывайка своими руками не позволяет существенно сэкономить, поскольку готовые составы продают уже значительно дешевле. Однако при точном соблюдении пропорций можно получить смесь, которая выдержит расчетную температуру. Оптимально будет сделать незамерзайку в домашних условиях для авто на основе изопропила, однако использовать можно и более дорогой этилен. Хорошо себя показывает и самодельная незамерзайка для авто на основе уксуса, аммиака, но она отличается неприятным запахом.

Антифриз для омывателя лобового стекла

В холодную погоду система омывателя лобового стекла требует использования специальных жидкостей. Дело в том, что если налить простую воду, она просто замерзнет. Кристаллы льда вызывают повреждение системы омывателя; Кроме того, вода будет образовывать на стекле замерзшие капли и пятна, что значительно ухудшит видимость для водителя.

Когда следует использовать незамерзающую жидкость?

В таких условиях незамерзающая жидкость для стеклоомывателя становится единственным спасением для водителей. Обладает прекрасным свойством: остается жидким даже при сильном морозе.

Различные виды антифризов имеют разные пороги температуры замерзания. На практике она может варьироваться от -5 ° C до -50 ° C. Точная цифра зависит от концентрации алкоголя. Например, если в продукте содержится 70% изопропилового спирта, то такая промывочная жидкость не замерзнет даже при -30 ° C.

В первую очередь при выборе антифриза следует учитывать географические особенности региона, в котором используется транспортное средство.

Качество продукции и ассортимент

При производстве антифриза производители часто используют смеси спиртов. Такие меры необходимы для получения наилучших качественных характеристик жидкости.

Каждый из спиртов, используемых в омывающей жидкости, оказывает определенное негативное воздействие на здоровье человека.Метиловый спирт считается самым ядовитым. Всего 5 граммов этого вещества вызывают слепоту.

Чтобы улучшить эстетические свойства, производители добавляют в антифриз специальные ароматизаторы.

На сегодняшний день ассортимент омывающей жидкости для лобового стекла достаточно широк. Чтобы увидеть это, вы можете посетить любой специализированный магазин.

Что лучше купить?

Оптовая покупка антифриза требует соблюдения определенных правил. Во-первых, необходимо убедиться, что товар хорошего качества.Многие производители стараются сэкономить на упаковке, чтобы снизить затраты. При оптовой закупке необходимо заранее предусмотреть этот вопрос и тщательно осмотреть тару перед заключением сделки.

Пластиковые бутылки и банки — самая надежная упаковка. Но хранение продукта в банках имеет определенный недостаток — потерю некоторых свойств. Если контейнеры подвергаются воздействию прямых солнечных лучей или высокой влажности, это может привести к их деформации и потере герметичности. Следовательно, это может привести к испарению спирта, и омывающая жидкость потеряет свои свойства.Повышенного внимания требует также заливка жидкости в емкость для стирки. Следует следить за тем, чтобы крышка была плотно закрыта; в противном случае возможно испарение спирта и снижение порога температуры замерзания.

Антифриз жидкий без запаха

Погоня за прибылью приводит к тому, что некоторые недобросовестные производители выпускают жидкость для мытья стекол, содержащую метиловый спирт. Это очень опасно для здоровья человека.

Если использование антифриза сопровождается недугом, тошнотой, слезотечением, то обязательно вы купили средство с метиловым спиртом.Именно по этой причине производство и продажа незамерзающей жидкости, содержащей метил, запрещены во многих странах мира.

Как выбрать хорошую жидкость для омывателя лобового стекла?

На самом деле, выбор жидкостей для омывателей ветрового стекла огромен даже среди недорогих продуктов. Однако цена как единственный критерий неприемлема. Оптимальный выбор — продукт, содержащий изопропиловый спирт и этанол.

При проверке качества жидкости нужно помнить несколько простых правил:

• Некачественный антифриз обычно намного дешевле;
• В случае плохого запаха или отсутствия запаха такая промывочная жидкость может содержать метанол.Изопропиловый спирт имеет запах, напоминающий ацетон. Антифризы на изопропиловой основе обычно ароматизируются.

• Самые популярные запросы по теме

.

Как работает антифриз? (с иллюстрациями)

Антифриз — это жидкость, добавляемая в систему охлаждения автомобиля для предотвращения замерзания воды в ней. Причина, по которой он работает, заключается в том, что температура замерзания жидкости понижается, когда в ней что-то растворяется. Это что-то может быть твердым или жидким. Этот феномен был впервые открыт французским ученым Франсуа Рау в конце 19 века. Рауль также обнаружил, что степень понижения точки замерзания линейно связана с количеством молекул, растворенных в жидкости.

Добавление антифриза в машину.

Понижение температуры замерзания разбавленных растворов можно объяснить следующим образом. По мере того, как температура жидкости понижается, молекулы, составляющие ее, движутся медленнее и испытывают силу притяжения друг с другом.В чистой воде при температуре 32 ° F (0 ° C) эта сила притяжения достаточно сильна, чтобы расположить молекулы воды в виде правильного кристаллического узора, что значительно снижает их подвижность и вызывает образование льда.

Антифриз предотвращает замерзание молекул воды.

Теоретически все, что растворяется в воде, можно использовать в качестве антифриза. На практике существует несколько ограничивающих ограничений. Во-первых, вещество должно смешиваться с водой в любом соотношении. Некоторые жидкости трудно растворить или кристаллизовать при более низких температурах. Во-вторых, антифриз должен быть инертным, то есть не вступать в химическую реакцию ни с чем, с чем он вступает в контакт в системе охлаждения.В-третьих, это должно быть дешево; в-четвертых, это не должно вызывать нежелательного повышения давления в системе охлаждения — это означает, что антифриз должен иметь высокую температуру кипения.

Практически повсеместно используемое вещество, которое соответствует всем этим спецификациям, — это этиленгликоль с температурой кипения 387 ° F (197 ° C).Система охлаждения, в которой соотношение гликоля и воды составляет 1: 1, имеет температуру замерзания около -40 ° F (-40 ° C), что идеально для нормального диапазона приложений.

.

АНТИФРИЗ И ОХЛАЖДАЮЩИЙ | Американский институт качества нефти

Star brite	20.04.2018	Предварительно смешанная охлаждающая жидкость премиум-класса с увеличенным сроком службы 50/50	1 Зеленый Нет проблем
Final Charge	17.04.2018	Global 50/50 Prediluted Coolant / Antifreeze Увеличенный срок службы без нитритов	1 Зеленый Нет проблем
Durex	14.03.2018	Антифриз / охлаждающая жидкость 50/50 Pre-Mix Classic Green Formula	1 Зеленый Без проблем
Pride 500	12.03.2018	Предварительное смешивание антифриза и охлаждающей жидкости 50/50	1 Зеленый Нет проблем
HeatWave Universal	12.03.2018	Антифриз и охлаждающая жидкость «Защищает до -34 ° F»	3 Consumer Alert Red
ShopRite	17.12.2017	Готовая к использованию 50/50 Antifreeze Coolant	1 Зеленый Нет проблем
SuperTech	12/7/2017	Готовый к использованию разбавленный 50/50 антифриз / охлаждающая жидкость с увеличенным сроком службы	1 Зеленый Нет проблем
Valvoline с технологией ZEREX	07.12.2017	Разбавленный антифриз / охлаждающая жидкость 50/50	1 Зеленый Нет проблем
MENARDS	16.11.2016	Разбавленный антифриз / охлаждающая жидкость 50/50	1 Зеленый Нет проблем
O’Reilly	15.11.2016	Обычный зеленый 50/50 разбавленный антифриз и охлаждающая жидкость	1 Зеленый Нет проблем
Performance	15.11.2016	Готовый к использованию зеленый традиционный антифриз и охлаждающая жидкость 50/50	1 Зеленый Нет проблем
Performance	15.11.2016	Готовый к использованию зеленый традиционный антифриз и охлаждающая жидкость 50/50	1 Зеленый Нет проблем
Liquid Moon	15.11.2016	Обычный зеленый 50/50 предварительно разбавленный антифриз / охлаждающая жидкость	1 Зеленый Нет проблем
MidWest Guard	15.11.2016	Антифриз / охлаждающая жидкость Global 50/50	1 Зеленый Нет проблем
Parts Master	15.11.2016	Предварительно разбавленный антифриз и охлаждающая жидкость 50/50	1 Зеленый Нет проблем
PolyGuard	15.11.2016	Предварительно разбавленный антифриз / охлаждающая жидкость 50/50	1 Зеленый Нет проблем
Полярная зона	15.11.2016	Постоянная смесь антифриза / охлаждающей жидкости «Защищает до -20 ° F»	3 Consumer Alert Red
SUPER XXX	15.11.2016	«Защищает до -34 ° F» Антифриз и охлаждающая жидкость	3 Consumer Alert Red
Blue Mountain	13.04.2016	Professional Обычный зеленый 50/50 предварительно разбавленный антифриз / охлаждающая жидкость	1 Зеленый Нет проблем
SMB (Superior Motoring Benefits)	13.04.2016	Готовая к использованию 50/50 предварительно разбавленная охлаждающая жидкость-антифриз	1 Зеленый Нет проблем
Polar	12.04.2016	LONGLIFE 50/50 Разбавленный антифриз / охлаждающая жидкость	1 Зеленый Нет проблем
PolyFreeze	12.04.2016	5/150 Концентрат охлаждающей жидкости с увеличенным сроком службы	1 Зеленый Нет проблем
Shell	11.04.2016	Rotella Ultra ELC 50/50 Антифриз / охлаждающая жидкость двигателя	1 Зеленый Нет проблем
Signature Home	4/11/2016	Готовые к использованию охлаждающая жидкость и антифриз	1 Зеленый Нет проблем
SuperS	26.02.2016	50/50 Разбавленный антифриз Summer Coolant	3 Consumer Alert Red
Chevron Havoline	15.01.2016	Разбавленный универсальный антифриз / охлаждающая жидкость 50/50	1 Зеленый Нет проблем
GC	28.12.2015	Предварительно разбавленный антифриз / охлаждающая жидкость со сверхвысоким сроком службы, синий гибридный состав OAT для азиатских автомобилей с использованием синей охлаждающей жидкости	1 Зеленый Нет проблем
Road-Tech	28.12.2015	Разбавленный антифриз и охлаждающая жидкость с увеличенным сроком службы 50/50	1 Зеленый Без проблем
SuperTech	28.12.2015	Готовый к использованию разбавленный антифриз / охлаждающая жидкость 50/50	1 Зеленый Без проблем
AUTOGUARD	24.09.2015	50/50 Готовый универсальный антифриз	1 Зеленый Нет проблем
AutoZone	18.09.2015	Предварительно разбавленный универсальный антифриз / охлаждающая жидкость с увеличенным сроком службы 50/50	1 Зеленый Без проблем
CarQuest	18.09.2015	Предварительно разбавленный антифриз / охлаждающая жидкость с увеличенным сроком службы 50/50	1 Зеленый Нет проблем
PROLine	18.09.2015	Предварительно разбавленный антифриз / охлаждающая жидкость 50/50 с увеличенным сроком службы	1 Зеленый Без проблем
Royal Farms	9/2/2015	Готовые к использованию антифризы и охлаждающие жидкости 50/50
Prestone	20.08.2015	Extended Life Technology 50/50 ПРЕДВАРИТЕЛЬНО РАЗБАВЛЕННЫЙ АНТИФРИЗ / ОХЛАЖДАЮЩИЙ	1 Зеленый Нет проблем
STP	20.08.2015	Предварительно разбавленный антифриз / охлаждающая жидкость 50/50 Global Extended Life	1 Зеленый Нет проблем
Zerex	20.08.2015	G-05 Formula 50/50 Предварительная смесь АНТИФРИЗА / ХЛАДАГЕНТА	1 Зеленый Нет проблем
ULTRA GUARD	8/5/2015	ВСЕГДА ЗИМНИЙ СЕЗОН Готовая формула Хладагент от замораживания	3 Consumer Alert Red
Metro	7/24/2015	-20 ° F Formula Antifreeze / Coolant	2 Консультативный желтый
Performance	24.07.2015	Готовый к работе 50/50 Предварительно смешанный зеленый / традиционный антифриз / охлаждающая жидкость	2 Желтого консультативного
Полярная зона	24.07.2015	Постоянная смесь АНТИФРИЗ / ОХЛАЖДАЮЩАЯ смесь	3 Предупреждение для потребителей Красный
ZECOL Multi-Max	24.07.2015	Предварительно разбавленный антифриз / охлаждающая жидкость с увеличенным сроком службы 50/50
Все температуры	01.07.2015	Предварительно смешанный антифриз / охлаждающая жидкость	1 Зеленый Нет проблем
Prime	01.07.2015	ПРЕДВАРИТЕЛЬНО РАЗБАВЛЕННЫЙ ОХЛАЖДАЮЩИЙ АНТИФРИЗ 50/50	1 Зеленый Нет проблем

.

Общие продукты питания и напитки, скрывающие антифриз

Пропиленгликоль — это органическое химическое соединение, о котором мало говорили до недавнего времени, когда виски Fireball Cinnamon был снят с полок в трех скандинавских странах за то, что он содержал слишком много ингредиентов, чтобы соответствовать европейским стандартам. Стандарты Союза. Химикат используется в качестве растворителя и основного ингредиента в нетоксичных антифризах и в качестве «жидкости для электронных сигарет». Пропиленгликоль считается безопасным FDA в небольших количествах, хотя он может быть токсичным в больших дозах.И это встречается чаще, чем вы думаете. Он широко используется в продуктах питания и напитках в качестве загустителя и консерванта или для добавления сладости.

Хотя Центры по контролю и профилактике заболеваний заверили нас, что практически невозможно проглотить токсичные количества соединения через потребительские товары, в больших дозах отравление пропиленгликолем может вызвать раздражение кожи, зуд и покраснение, а также острые уровни воздействие может вызвать сердечно-сосудистые или нейротоксические проблемы.

Токсичен или нет, мы подумали, что вам может быть интересно узнать, скрывается ли этот растворитель и антифриз в продуктах, которые вы едите и пьете. В Daily Meal были обнаружены семь наиболее распространенных продуктов и напитков, содержащих пропиленгликоль.

Ароматизированный чай со льдом

Мир может работать на Dunkin ’, но Dunkin’ Donuts со вкусом холодного чая работает на пропиленгликоле. Здесь ингредиент, вероятно, используется для увеличения сладости. Хорошая новость заключается в том, что в обычном ассортименте холодного чая в Dunkin ’нет пропитки.Nestea «ароматизированные жидкие усилители воды» также содержат пропиленгликоль , а Lipton — нет.

Мороженое

Большинство сортов ванили не содержат пропиленгликоль. Но если вы не хотите проглотить пропиленгликоль, избегайте шишек Blue Bunny с любым вкусом или мороженого Edy’s с мятой. Coldstone Creamery предлагает 17 различных сортов мороженого во всех местах, где есть проп-гли.

Глазурь в упаковке

В большинстве разновидностей глазури, таких как Betty Crocker , вы обнаружите пропиленгликоль, скрывающийся внутри, вероятно, в качестве загустителя.

Смесь для торта в коробках

Если вы действительно хотите, вы можете приготовить торт с антифризом для всей семьи. Вы найдете проп-гли внутри шоколадного торта Betty Crocker и желтого торта Duncan Hines .

Коммерческий пищевой краситель

Если вы делаете свой торт с нуля, вы можете отказаться от большинства обычных искусственных красителей, таких как Ассорти пищевых красителей McCormick , где пропиленгликоль указан вторым ингредиентом после воды.

Салатные заправки

Многие заправки для салатов Крафт, включая греческий винегрет компании , , содержат пропиленгликольальгинат — разновидность пропиленгликоля, которая используется в качестве инертного пестицида — в качестве ингредиента.

Entenmann’s Everything

Ну, может, не все. Но, безусловно, многие из угощений с именем Entenmann включают пропиленгликоль, например, Little Bites, пирожных, праздничных кексов, , , и лимонно-кокосовых пирожных.

Чтобы узнать о последних событиях в мире продуктов питания и напитков, посетите нашу страницу Food News .

Джоанна Фантоцци — помощник редактора Daily Meal. Следуйте за ней в Twitter @JoannaFantozzi

.

Что такое антифриз? (с иллюстрациями)

Антифриз, также известный как охлаждающая жидкость двигателя, представляет собой жидкое вещество, которое циркулирует в двигателе внутреннего сгорания и отводит избыточное тепло. Двумя наиболее распространенными химическими веществами, используемыми для этого, являются этилен и пропиленгликоль, оба из которых имеют более низкие точки замерзания, чем вода (32 ° по Фаренгейту или 0 ° Цельсия). Это позволяет химикатам свободно течь даже в холодных зимних условиях. Антифриз также имеет более высокую температуру кипения, чем чистая вода, что делает его идеальным для использования летом.

Залитый в радиатор антифриз сохраняет двигатель в прохладном состоянии.

Двигатели внутреннего сгорания выделяют значительное количество тепла при нормальной работе. Это тепло в конечном итоге передается металлическим и синтетическим частям блока цилиндров, что, в свою очередь, вызывает трение и расширение.Моторные масла и смазочные материалы могут уменьшить трение, но тепло все равно необходимо отводить от двигателя. Здесь на сцену выходит антифриз. Замкнутая система шлангов и водяной насос циркулирует либо чистый антифриз, либо его смесь с водой по всему блоку двигателя.

Домашнее животное, проглотившее антифриз, необходимо немедленно отвезти к ветеринару.

Избыточное тепло отводится химическими веществами за счет «теплоотвода». К тому времени, когда антифриз пройдет через весь блок двигателя, он может быть близок к температуре кипения воды. Эта перегретая жидкость перекачивается в радиатор, расположенный в передней части моторного отсека. Комбинация наружного воздуха и нагнетаемого воздуха от вентилятора помогает снизить температуру.Сам радиатор имеет множество камер и каналов, которые также позволяют теплу проходить наружу. Когда антифриз достигнет другой стороны радиатора, он должен остыть достаточно, чтобы снова войти в блок двигателя и начать процесс заново.

Не все антифризы одинаковы.Некоторые из них предназначены для регионов с резкими перепадами температур, а другие разработаны для летних месяцев с более высокими температурами. Также могут быть различия в соотношении воды и антифриза для оптимальной работы. Слишком мало антифриза может привести к выкипанию или полностью замерзнуть радиатор. Слишком большое количество может не повредить работе автомобиля, но для водителей может быть слишком дорого постоянно использовать неразбавленный продукт. Химические вещества, как правило, недороги, но иногда случаются внезапные скачки цен, поскольку спрос растет, а предложения заканчиваются.

Следует иметь в виду, что этилен или пропиленгликоль ядовиты. Антифриз может пахнуть сладким и привлекательным для домашних животных и маленьких детей. Его употребление может вызвать серьезное заболевание или даже смерть, поэтому контейнеры следует хранить в охраняемых местах для хранения.Если питомец проглотил антифриз, следует немедленно связаться с ветеринаром для вызова экстренных служб. Важно предупредить детей, чтобы они не пили его, потому что, даже если родители бережно хранят его, соседи могут быть не такими добросовестными.

Для поддержания оптимальной температуры работы двигателя можно использовать охлаждающую жидкость или антифриз..

Объем антифриза и номинальная температура

Требуемое количество антифриза для защиты систем охлаждения при определенных номинальных температурах можно оценить по таблицам ниже:

• т _C = 0,56 (t _F -32) = 5/9 (т _F -32)
• 1 галлон (США) = 3,785×10 ^-3 м ³ = 3,785 дм ³ (литр) = 231 дюйм ³ = 0,13368 футов ³ = 4,951×10 ^-3 ярд ³ = 0.8327 Imp. gal (UK) = 4 кварты = 8 пинт

Никогда не используйте более 70% антифриза в системе охлаждения.

.

Незамерзайка

Каждый автолюбитель хочет, чтобы его машина была красивой и ухоженной. Именно поэтому так важно постоянно следить за тем, чтобы «железный друг» был чистым и аккуратным. Особенно важно следить за чистотой стекол, ведь именно от их состояния зависит то, насколько хорошо водитель видит дорогу.

Когда стекла машины грязные, то сквозь них сложно хорошо увидеть все происходящее на дороге. Именно поэтому водитель должен как можно чаще мыть их и приводить в порядок. Для этого необходимо приобрести незамерзающую жидкость, которая в любое время отлично омоет стекла вашей машины. 

К сожалению, сейчас на рынке представлено немало некачественных «незамерзаек», которые могут отрицательно воздействовать на здоровье водителя и пассажиров автомобиля. Как же правильно выбрать данную жидкость, чтобы она была качественной и безопасной?

В состав незамерзающей жидкости всегда входит спирт, который может быть разным. Метанол сейчас запрещен, и поэтому «незамерзайки», в составе которых есть данный вид спирта, запрещены. Однако стоит отметить, что многие производители не указывают на упаковке то, что метиловый спирт есть в омывающей жидкости, что может привести к отравлению. Также пары метанола моментально ухудшают зрение всех, кто находится в автомобиле. Если вы открыли бутылку с «незамерзайкой», и не почувствовали запах, то это может свидетельствовать о том, что в составе жидкости есть метиловый спирт. Ведь именно метанол отличается отсутствием запаха. Также стоит отметить, что незамерзающие жидкости с подобным видом спирта в составе отрицательно воздействуют на состояние резинок стеклоочистителей.

Следующим видом спирта, который может быть в составе «незамерзайки» может быть этанол. Он безвреден для водителя и пассажиров машины, потому что не выделяет вредных веществ во время использования. Однако «незамерзайки» с этанолом не пользуются большим спросом, потому что дорого стоят. 

Самым распространенным веществом в незамерзающих жидкостях является изопропиловый спирт. Он отличается невысокой стоимостью, что делает его доступным для всех автолюбителей. В его состав входят химические соединения, которые не могут нанести вред здоровью человека. 

При выборе омывающей жидкости необходимо обратить внимание на то, чтобы она была максимально жидкой. Это позволит ей проходить через форсунки при любой температуре. Также незамерзайка должна хорошо проникать в грязь и смачивать стекла. С первого раза вы это не поймете, но когда начнете пользоваться определенной жидкостью, то заметите, насколько хорошо она отмывает грязь. Потом вы можете приобретать незамерзающую жидкость только той марки, которая вам понравилась. 

Следовательно, что выбор велик  и  незамерзающая жидкость – дело несложное. Главное, убедиться в том, что в ее составе нет метанола, который оказывает пагубное влияние на здоровье человека. Самыми недорогими являются «незамерзайки» отечественного производства. Специалисты утверждают, что она не хуже, чем жидкости иностранного производства. Также помните о том, что качественная незамерзающая жидкость не должны густеть при температуре до — 30 градусов. И помните, что если жидкость совсем не пахнет, это свидетельствует о наличии в ней метилового спирта, опасного для человека. Откажитесь от такой покупки, несмотря на то, что она будет стоить недорого, ведь здоровье дороже всего. Удачного выбора!

Без узоров на стекле. Как выбрать незамерзайку | АВТОМОБИЛИ

В Оренбуржье зима длится обычно 5 месяцев, причем, начинается в ноябре, а в нынешнем году и вовсе в конце октября, а заканчивается уже в начале апреля. И даже если природа не балует снегом, хотя и это тоже не всегда, то морозы приходят с завидной регулярностью, а значит и стекла в автомобиле тоже будут замерзать постоянно. И как здесь не вспомнить о незамерзайке – средстве, препятствующем этому обычному зимнему процессу? Обыкновенная дистиллированная вода замерзает при отрицательной температуре, это может привести к выходу из строя омывателя вашего автомобиля и сделать вас беспомощным на грязной или заснеженной дороге. Куда опаснее ситуация, когда жидкость замерзает на лобовом стекле автомобиля при сильном потоке встречного воздуха, в результате чего на стекле образуется ледяная корка, препятствующая обзору.

Корреспондент АиФ Оренбург разбирался в том, по каким принципам нужно выбирать незамерзайку и как обезопасить себя от вредного влияния контрафактной продукции.

Что в составе?

Незамерзайка, несмотря на свое говорящее название, все-таки замерзает. Только превращается она не в лед, а в непригодную «кашу» — при определенных, весьма низких, температурах (они обычно указываются на канистрах). Большинство незамерзающих жидкостей отлично эксплуатируются вплоть до минус 25 градусов; однако некоторые концентраты в неразбавленном состоянии способны «держаться» до минус 40 градусов.

На вопрос, какая хорошая незамерзайка, чаще всего от продавца вы услышите встречный вопрос — на какую сумму вы рассчитываете. В первую очередь качество незамерзайки – это безопасность для здоровья. О безопасности вы сможете судить, после того как посмотрите на состав жидкости. На этикетке всегда указано, какой тип спирта здесь содержится. Современные производители в своих незамерзайках могут использовать один из трех типов спирта:

• Этиловый;
• Изопропиловый;
• Метиловый.

Но в российском законодательстве запрещается применять метанол в автомобильных очистительных жидкостях.

Вот как комментирует наличие возможного метанола в незамерзайке специалист по связям с общественностью АЦ CLIFFORD Мария Кирьяк: «Опасность, которую таит в себе незамерзайка с метанолом, нисколько не преувеличена. На самом деле, вредные пары, выделяемые жидкостью, содержащей метиловый спирт, пагубно влияют на нервную и сосудистую систему человека, тем более, если контакт с метанолом носит продолжительный или постоянный характер. Крайне опасен метанол и для глаз – страдает сетчатка глаза. При регулярном нахождении под воздействием испарения может насупить дистрофия глазного нерва. Тот факт, что от  вредной жидкости водителя защищает лобовое стекло, несостоятелен: омыв стекло незамерзайка стекает в подкапотное пространство, откуда испарения безо всякого труда попадают в салон. Если в автомобиле работает печка или кондиционер, либо опущено боковое стекло, контакт с ядом становится еще более ощутимым. Из почти моментальных последствий контакта с метанолом можно выделить головную боль, резь в глазах, раздражение слизистых (симптомы как при аллергии), у некоторых – и кожных покровов, а также повышенную утомляемость. Само собой разумеется, все это снижает концентрацию водителя на дороге и, как следствие, может привести к самым разным последствиям. В Автоцентре CLIFFORD продается только безопасная незамерзайка: она не содержит метанола и произведена на основе изопропилового спирта. При этом она отлично справляется со своими функциями, имеет нерезкий приятный запах и выдерживает температуру до – 30 градусов, как и заявлено производителями. Мнение, что безопасная, эффективная и лишенная резкого запаха незамерзающая омывающая жидкость не может стоить дешево, ошибочно: у нас такое средство уже который год радует покупателей более, чем невысокой ценой».

Зимы в Оренбурге — непредсказуемы: то снегопады и морозы, то оттепель. Фото: pixabay.com

В качественных смесях доля спирта может составлять от 25% до 75% в зависимости от минимальной температуры, при которой препарат будет использоваться. То есть если нужен конечный продукт, который выдержит температуру до -10 градусов, используют всего 25%, а если вам нужно ехать в морозы до – 30, — 35 то могут добавить от 50 до 75%.

Сейчас появляется так называемый – «биоэтанол» это также спирт, сделанный из химических составов, однако он не является отравляющим, но и пить его нельзя!

Следующий компонент незамерзайки – поверхностно-активные вещества. В результате наличия такого компонента продукция прекрасно справляется с удалением загрязнений со лобового стекла: грязи, копоти, выхлопных газов и тому подобного. В случае качественной незамерзающей смеси, где процентное содержание ПАВ подобрано правильно, всего за пару секунд после применения незамерзайки на поверхности не останется даже никаких разводов. Содержание такого компонента – до 1%.

Еще одна неотъемлемая часть любого такого продукта высокого качества – этиленгликоль, который обеспечивает жидкости текучесть даже при низких температурах. Как известно, в мороз спирты не замерзают, но начинают постепенно загустевать. Как раз для устранения такого недостатка и используется этиленгликоль. Кстати его используют и в антифризах и тосолах.

Внимательно читайте этикетку! Фото: АиФ

Согласно отечественным стандартам, в составе незамерзайки обязательно должно быть денатурирующее вещество. Обычно используется в том случае, если основой продукта является этиловый спирт. Это вещество изменяет вкус, цвет и запах пищевого спирта для предотвращения попыток принять его внутрь. Его содержание – до 0,5%.

Красители. Чаще всего вещество для омывания стекол автомобиля в зимнее время имеет голубой оттенок. Нередко производители повышают концентрацию красителя, в результате чего жидкость становиться синей. При ее использовании на капоте могут оставаться характерные разводы. Повышением концентрации красителя обычно производители стараются скрыть некоторые недостатки продукта, к примеру, осадок. Содержание красителей в незамерзайке – около 0,001%.

Отдушка. Для устранения запаха спирта в стеклоомыватель вводят всевозможные ароматизаторы. Чаще всего в качественных незамерзайках используются отдушки, произведенные в странах ЕС. Такие вещества не вызывают аллергических реакций, имеют приятный запах.  Содержание отдушки – в среднем 0,8%.

Признаки качественной незамерзайки. Фото: АиФ

И, наконец, последней частью незамерзающего вещества, что используется в стеклоомывающей системе автомобиля в зимнее время, является вода. При производстве стеклоомывателя обязательно должна использоваться чистая жидкость без каких-либо примесей, иначе качество мытья лобового стекла будет оставлять желать лучшего. Кроме того, в случае использования некачественной воды ее осадок может привести к засорению форсунок стеклоомывающей системы. Содержание воды может быть разным в зависимости от количества всех остальных компонентов.

Какую бы жидкость для стеклоомывателя вы ни выбрали, главное правило использования – не разбавлять готовые к применению незамерзайки водой. Это существенно влияет на эффективность стеклоомывателя. А вот концентрат разбавлять можно и нужно – иначе жидкость может воспламениться прямо на ходу автомобиля.

На качественном продукте обязательно должна быть ровная этикетка с четким текстом, наименованием фирмы-изготовителя, описанием правил применения, адресом производства, датой выпуска и сертификатами, составом.

Очень важная характеристика – запах стеклоомывающей жидкости. Если запах прямо бьет в нос, ни в коем случае не покупайте продукт – отравитесь метанолом; если запах резкий, ацетоновый – в незамерзайке содержится менее опасный, но все равно раздражающий глаза и дыхательные пути изопропиловый спирт. К сожалению, проверить это в магазине чаще всего не получается – ну нет на прилавках пробников незамерзайки!

Защита от смертельной химии

Есть ли способы защиты от «химического оружия»? Прежде всего, не пользуйтесь омывателем в пробках: когда автомобиль стоит на месте, вероятность попадания вредных паров в салон максимальна. Кроме того, в городской толчее к испарениям «незамерзайки» неизбежно добавляются выхлопные газы от передней машины. Поэтому не забывайте про режим рециркуляции воздуха в салоне (если, конечно, он есть в системе вентиляции) — во многих ситуациях это спасение.

Помните, что при воздействии на организм человека некоторые спирты проявляют так называемую кумулятивную реакцию (своеобразный «эффект памяти»), то есть полученные ранее и «свежие» дозы накапливаются, усугубляя отравление. Свойство это очень коварное, так что при длительных и устойчивых расстройствах обязательно обратитесь к медикам.

Немаловажное качество незамерзающей стеклоомывающей жидкости – это насколько удобно наливать ее из канистры в бачок автомобиля. На сегодняшний день очень небольшое количество жидкостей для омывания стекол могут похвастаться этим свойством.

И напоследок – совет от одной из наших читательниц. Ольга Дубровина, автолюбитель с 10-летним стажем вождения, говорит о том, что никогда не покупает незамерзайку ни на дороге, ни у кустарных производителей: «Главное для меня – это должен быть вызывающий доверие крупный производитель. Я всегда покупаю незамерзайку для максимальной температуры -35-40 градусов, во-первых, потому что оренбургская погода, действительно, непредсказуема, а во-вторых, очень часто производитель, извините, обманывает автовладельца: купишь до -20, а он в кашу превращается уже при -5, и вымыть его потом очень сложно. И еще один момент – бывают жидкомти с маслянистым компонентом – потом стекло просто не отмоешь».

Смотрите также:

для чего нужна, как приготовить и когда заливать.

Зима с её дорожной слякотью и грязью не за горами. Самое время запастись хорошим омывателем для стёкол машины. Мы расскажем вам, какими жидкостями можно пользоваться без опаски, а какие обходить за версту.

Летом можно было обойтись и простой водой с добавлением небольшого количества средства для мытья посуды, но для зимних условий вода не подойдёт — она замёрзнет при первом же морозе, в результате чего форсунки выйдут из строя, а бачок стеклоомывателя треснет. Поэтому до наступления холодов необходимо удалить воду из системы и залить туда незамерзающий омыватель, безопасный для водителя и автомобиля.

Некоторые водители не задумываются о качестве омывающей жидкости и берут ту, что подешевле. А таковую предприимчивые торговцы часто продают прямо у обочин дорог. Однако тут надо держать ухо востро! Ведь дешёвые омыватели сомнительного происхождения, как правило, содержат ядовитые вещества- их пары через систему вентиляции проникают внутрь машины и могут привести к отравлению водителя.

При покупке жидкости встряхните канистру — на поверхности должна образоваться устойчивая плотная пена (это активные вещества). Жидкость должна быть прозрачной и не образовывать на дне осадка. Проверьте, чтобы пробка была качественной. Этикетка должна содержать полную информацию о продукте (состав жидкости, температура замерзания, производитель и его адрес).

Внимание на состав незамерзайки!

Главные ингредиенты незамерзающих омывателей — это спирт и вода. При выборе «незамерзайки» обязательно обратите внимание на вид спирта, использованный в качестве главного ингредиента. В зимних составах могут применять метиловый, этиловый или изопропиловый спирт.

Метиловый спирт (метанол) запрещён действующим законодательством. Это ядовитое вещество! Вдыхание его паров способно привести к отравлению организма, в том числе к ухудшению, а то и к потере зрения. Кроме того, метанол быстро выводит из строя резиновые части стеклоочистителей. На непрогретом стекле раствор на его основе только размажет грязь, но не удалит её. Понятое дело, что на этикетке омывателя на основе метанола о последнем ничего написано не будет. Тогда как же всё-таки распознать его присутствие в растворе? Помимо низкой цены главный признак присутствия метанола — отсутствие запаха у жидкости.

Этиловый спирт был бы самым оптимальным компонентом для стеклоомывающей смеси. Он хорошо всем известен как основа вино-водочных изделий. В этом и заключается проблема: поскольку продажа этого спирта облагается высоким акцизом, произведённая на его основе незамерзающая жидкость стала бы просто золотой. Сейчас «омывайки » с этанолом изготовляют исключительно из конфискованного спирта на единичных предприятиях России — это один из способов утилизации контрафактного продукта.

Изопропиловый спирт — самый ходовой ингредиент в незамерзающих растворах, он присутствует практически во всех составах, предлагаемых рынком. Концентрация химического соединения, которая используется в них, не способна навредить человеку. Определить присутствие изопропилового спирта можно по характерному «ацетоновому» запаху.

Однако одно отрицательное качество у изопропила всё-таки есть: он способен повредить пластмассовые детали и лакокрасочное покрытие (ЛКП) автомобиля. В первую очередь это касается поликарбонатных плафонов фар головного света, снабжённых системой омывания: на них жидкость воздействует пагубно, поскольку плафоны нагреваются от включённых ламп, а нагретый омывающий раствор особенно агрессивен. Возможно появление трещин и замутнений на оптике, что отрицательно сказывается на формировании светового пучка.

Интернет-портал «АвтоДела» (autodela.ru) регулярно проводит тесты незамерзающих омывателей для автомобилей, уделяя особе внимание воздействию растворов на ЛКП и пластмассовые детали автомобиля, в том числе на поликарбонатные плафоны фар головного света. Опираясь на результаты своих тестов, портал рекомендует для автомобилей с системой омывания фар следующие жидкости: Liqui Moly Antifrost, Sonax Xtreme Nano Pro, CoolStream, Sapfire Windshield Washer и «Автобанщик зимний». А вот агрессивными по отношению к поликарбонатному стеклу фар показали себя стеклоомывающие жидкости Hi-Gear Winter, «Spectr Лимон light», Luxe Windshield, растворы марок Pingo, «Лукойл» и Fintippa.

Концентрат или готовый раствор?

Омывающие жидкости продаются в виде готовых растворов или в виде концентратов. Готовую жидкость можно сразу заливать в бачок омывателя, а концентрированную разбавляют дистиллированной водой. В каких пропорциях это делать, зависит от погодных условий. Как правило, информация о пропорциях дана на упаковке средства.

Концентрированные растворы более экономичны, чем готовые. Ещё одно их преимущество: раствор, приготовленный самим водителем, будет точно соответствовать температурному режиму его эксплуатации, ведь, как показывает практика, ни один из готовых омывающих растворов для стёкол не соответствует заявленным температурам замерзания и кристаллизуется.

Важно! Никогда не наливайте неразбавленный концентрат в бачок! Эта жидкость может вспыхнуть под капотом в самый неподходящий момент .

К счастью, можно утверждать, что абсолютное большинство омывающих жидкостей, продающихся сегодня в легальной торговой сети, хорошо справляются со своей задачей, приятно пахнут и не причиняют вреда здоровью. Главное — не покупать жидкости в сомнительных местах и у случайных торговцев. Старайтесь приобретать омывающие жидкости в крупных специализированных магазинах, салонах, гипермаркетах.

ЖИДКОСТЬ «НЕЗАМЕРЗАЙКА» СВОИМИ РУКАМИ

Самой безвредной и эффективной омывающей жидкостью будет та которую вы приготовите сами из водки или пищевого спирта Она обойдётся, конечно, несколько дороже, чем растворы, продающиеся в магазинах, но зато вы будете точно знать, что вашему здоровью ничего не угрожает. Внизу приведена таблица, которая поможет вам смешать жидкости в правильных пропорциях. Правда, есть одно «но»: запах спирта может привлечь внимание инспекторов ГИБДД.

Объёмное соотношение с водой	Температура замерзания, °С
Водка
чистая	24.5
1:0,5	12,5
1:2
1:3
Этиловый спирт
чистый	114.0
	31,5
	17,0
	10,0

(1 оценок, среднее: 5,00 из 5)

Осенью, зимой и ранней весной очень важно соблюдать чистоту стекол автомобиля, от этого зависит безопасность вождения. Если летом их можно помыть обычной водой, зимой этот способ не сработает из-за низких температур. Водители используют специальную жидкость для омывания лобового стекла. Такая незамерзайка для авто продается в любом специализированном магазине, а можно сделать ее самостоятельно.

Обычно автолюбители в магазине руководствуются ценой или температурой замерзания жидкости. По этим двум параметрам они и делают свой выбор.

Отличить качественную незамерзайку можно по цене. Чем дороже стоимость, тем более качественные ингредиенты находятся в составе. Не стоит экономить на незамерзающей жидкости. Хороший продукт эффективно очистит стекла от грязи, не застынет ледяной коркой при езде и не принесет вред водителю и пассажирам.

Выгоднее покупать в пластиковых бутылях по 3-5 литров. Тогда стоимость 1 литра обходится дешевле на 10% по сравнению с другими упаковками. Но именно в них чаще всего продают разведенную или ядовитую жидкость.

Качественный продукт сразу видно по этикетке. На ней должно быть указано:

• название производителя и его адрес;
• правила применения;
• дата выпуска;
• состав.

На каждой этикетке производители пишут температуру, при которой незамерзающая жидкость теряет свои свойства. Вся информация должна быть написана четким шрифтом и легко читаться.

Еще одно важное качество для омывающей жидкости – это удобство наливания в бачок. Большинство продуктов выпускаются в неудобной таре, поэтому водителю нужно держать в машине воронку.

Каков состав зимней жидкости для омывателя лобового стекла?

Еще один важный критерий выбора незамерзайки – безопасность для водителя и пассажиров. Дело в том, что в состав большинства незамерзаек для авто входит метанол – яд, чрезмерное вдыхание паров которого опасно для здоровья. Его отличительное качество – отсутствие запаха. Поэтому пахучесть незамерзайки говорит о ее безопасном составе.

Легальные и чистые незамерзающие жидкости делают на основе изопропилового спирта. Это вещество с сильным запахом, которое может раздражать кожу и дыхательные пути. Но оно не так ядовито, как метанол.

Чтобы не отпугивать покупателей неприятным ароматом, производители добавляют отдушки и ароматизаторы в состав. Это увеличивает стоимость качественной жидкости по сравнению с незамерзайкой на основе метанола.

Состав незамерзайки всегда рассчитан так, чтобы она не замерзла при отрицательной температуре до состояния льда. На критической отметке жидкость приобретает кашеобразную консистенцию. Для большинства брендов это 25 градусов ниже нуля. Существуют незамерзайки, отлично работающие при -40 градусов.

Меры предосторожности:

1. Не рекомендуется работать с такой жидкостью для омывателя лобового стекла людям, которые носят контактные линзы.
2. Вдыхание едких паров жидкости может спровоцировать обострение язвенной болезни желудка.
3. Не рекомендуется вдыхать пары незамерзайки аллергикам, химические отдушки и ароматизаторы могут спровоцировать приступ.
4. Не используйте омывание лобового стекла при длительных остановках, например, в пробках. В такие моменты наиболее вероятно попадание опасных паров в салон авто.

Изобретательные автолюбители изобрели несколько рецептов приготовления незамерзайки в гаражных условиях. Главное правило – чем больше спирта в составе, тем более низкие температуры она выдерживает.

Первый способ приготовления:

1. Возьмите этиловый спирт, дистиллированную воду и средство для мытья посуды.
2. Смешайте ингредиенты в пропорциях: 20% спирта и 80% воды. Добавьте несколько капель моющего средства.
3. Перемещайте состав и залейте в бачок.

Второй способ приготовления:

1. Возьмите водку и средство для мытья посуды.
2. К водке добавьте пару капель средства и залейте в бачок.
3. Лучше не разбавлять состав водой, так как она может замерзнуть при низкой температуре. Но если на улице нет сильного мороза, в целях экономии можно добавить 20% воды.

Как залить жидкость в бачок омывателя?

Обычно незамерзающая жидкость продается в виде концентрата. В этом случае ее нужно разбавить водой по инструкции на этикетке. Нельзя заливать в бачок омывателя концентрат, так как это может привести к возгоранию под капотом.

Если вы купили готовую к применению жидкость, ее нельзя разбавлять водой. При низкой температуре вода замерзнет, это приведет к поломке механизма омывателя.

Как залить жидкость в бачок омывателя:

1. Прокачайте омывающую систему и убедитесь, что в ней не осталось воды.
2. Найдите под капотом бачок омывателя, открутите крышку.
3. Налейте жидкость в бачок до уровня. Не стоит заливать полный бачок, так как при низких температурах вода в составе начнет расширяться, и объем увеличится.

В обычном автомобиле водитель узнает, что у него закончилась жидкость для омывания стекол, по факту: на стекло ничего не распрыскивается. В современных машинах устанавливают датчик уровня жидкости в бачке омывателя, который предупреждает водителя заранее, чтобы он мог заехать в магазин и докупить незамерзайку.

Если в вашей машине такого датчика нет, вы можете установить его самостоятельно. Существует несколько способов вывода информации об уровне жидкости для водителя:

• Светодиод, врезанный в любое удобное место – самый простой способ;
• Цифровой или стрелочный датчик;
• Перепрограммирование штатной приборной панели.

Последний способ самый сложный, он требует от автолюбителя умения паять электросхемы. Для осуществления этого способа нужно на схеме приборной панели найти значок, который не используется в вашем автомобиле. На него и запитывается датчик уровня незамерзайки. Он срабатывает при остатке в бачке 1 литра жидкости.

Незамерзающая жидкость незаменима в холодную погоду. Лучше всего покупать ее в проверенных магазинах и не экономить. Но если вам быстро нужно залить жидкость в бачок омывателя, а магазин далеко, приготовить ее можно самостоятельно.

Что еще нужно знать о незамерзайке, покажем на видео:

Народная смекалка безгранична — рождаются различные способы и рецепты, которые помогают уберечься от лишних трат. Незамерзайка своими руками — это один из таких способов экономии.

Основа незамерзайки

Раньше для основы жидкости для зимней очистки стекол использовали этиловый спирт. Теперь же при производстве таких составов применяют только изопропиловый спиртовой состав. Он обладает рядом качеств, которые необходимо учесть при работе с ним в процессе изготовления самодельной незамерзайки.

• При высокой концентрации изопропилового спирта он может негативно повлиять на изделия из резины и на лакокрасочные покрытия.
• Этот вид спирта высокотоксичен.
• Многие растворители и химические вещества делаются на его основе.
• Изопропанол имеет удушливый неприятный запах — его нейтрализуют с помощью добавления в состав большого количества ароматизаторов высокой концентрации.

Какой должна быть незамерзайка?

• Состав незамерзайки для авто не должен иметь посторонних примесей, которые способствуют образованию осадка.
• Так как жидкость имеет в своем составе моющие средства, при встряхивании на ее поверхности образуется небольшое количество пены.
• Если незамерзающая жидкость приобретается, то лучше покупать ее в автомобильных салонах или магазинах. Покупая товар у неизвестных продавцов, в погоне за низкими ценами, можно поплатиться собственным здоровьем, вдохнув пары некачественной подделки.

Изготовление состава

Чтобы избежать опасных для здоровья подделок, можно задаться вопросом о том, как сделать незамерзайку своими руками.

Для производства незамерзающей жидкости потребуется этиловый или изопропиловый спирт, хорошо очищающий стекло. Кроме спирта, для лучшего моющего эффекта, в состав входит одно из моющих средств.

Концентрат незамерзайки необходимо рассчитывать, исходя из зимних температур региона, где будет применяться данный раствор, а также от возможной загрязненности стекол в этот период. Обычно десяти литров незамерзайки вполне хватает на всю зиму.

Очень важно, чтобы вода, используемая в составе, была хорошо отфильтрована, во избежание появления на стекле солевых отложений и разводов.

Проверка раствора

Купленный или изготовленный самостоятельно раствор требует проверки его качества. Немного состава заливается в бачок, и его подают на стекло. Этот процесс поможет проверить незамерзайку и освободить бачок и трубки от воды перед зимним периодом.

Процесс проверки очень важен для приобретенной жидкости. Вы сможете сразу почувствовать неприятный или удушливый запах. Если такое произошло, следует отказаться от этого состава, так как впоследствии вдыхание ядовитых паров может привести к аварийным и даже трагическим ситуациям.

Рецепт незамерзайки

Народные умельцы самостоятельно изобретают рецепты незамерзайки, используя для нее свойства некоторых жидкостей.

Возможно, их разработки помогут многим автолюбителям сохранить часть средств, чтобы потратить их на другие аксессуары для своей машины.

Чтобы знать, как самому сделать незамерзайку надежной и безопасной, рассмотрим несколько рецептов.

• Для данного раствора применяется неспиртовая стеклоочистительная жидкость с ароматом яблока (ее потребуется семь литров) и обычный медицинский спирт 96%, около 3,5 литров. Его количество будет зависеть от температуры на улице. Если она доходит до минус 25–30 градусов, лучше использовать все 3,5 литра, а если зимний климат более щадящий, достаточно 3, а то и 2,5 литров.

  Их смешивают с ароматизированной стеклоочистительной жидкостью в канистре. Средство получается безопасным и надежным для использования, даже в суровых холодных условиях.

• В этом варианте используется бытовая спиртовая жидкость для очищения стекол и отфильтрованная или дистиллированная вода, которые смешиваются между собой в пропорциях 1:2.

  Например, если необходимо сделать один литр незамерзайки, нужно смешать 350 граммов стеклоочистительной жидкости с 650 граммами очищенной воды, соответственно, для 10 литров, понадобится 3,5 литра спиртового состава и 6,5 литра воды. Такой состав хорошо будет работать при температурах минус 20-25 градусов.

• Этот раствор незамерзающей жидкости состоит из качественного средства для мытья посуды и очищенной воды. Для изготовления понадобится 50-70 граммов моющего средства и 4 литра воды.

  Функциональность незамерзайки будет зависеть от качества моющего средства — если применить дешевый вариант раствора, он не даст незамерзающего эффекта и просто испортит бачок омывателя стекол.

  Не спешите заливать готовую смесь в бачок, сначала проверьте правильность ее приготовления, т.е. подобранные пропорции и качество. Для этого необходимо выставить незамерзайку на балкон, когда на улице будет низкая температура. Если она останется жидкой, то смело можете использовать ее для стеклоомывателя.

• Этот рецепт незамерзайки можно использовать только в зимнее время, когда температура опускается ниже 10 градусов, так как в изготовлении раствора используют уксус. При жаркой погоде он будет давать неприятный запах на весь салон автомобиля.

  Делая эту незамерзающую жидкость, смешивают в пропорциях 1:1 уксус и дистиллированную воду. Чтобы получить десять литров незамерзайки берут 5 литров 9% уксуса и 5 литров воды.

• Для приготовления еще одного варианта незамерзайки, понадобится 3,5 литра аммиака и 6,5 литров очищенной воды. Производя смешивание жидкостей, нельзя допускать пенообразования, поэтому нужно действовать крайне аккуратно. При использовании этого раствора при очень низких температурах в него следует добавить 100-150 граммов уксуса. Чтобы улучшить его запах можно долить ароматизирующую жидкость.
• Этот рецепт основан на применении изопропилового спирта. Его потребуется 200 граммов, если он 70% и 150 граммов, если он 90%. К нему добавляют 4 литра воды. В таких пропорциях готовится нужное количество незамерзайки. Она хорошо работает при температурах ниже 20 градусов мороза.
• Еще один рецепт с использованием медицинского спирта, так как он является традиционной основой для незамерзающего состава, сделанного в домашних условиях. Для изготовления 5 литров раствора понадобится 4 стакана 70% спирта, (при использовании 96% спирта, его нужно 2,5 стакана или 625 грамм). Он добавляется в 4,5 литра воды.
• Возможно, но нежелательно, изготовление незамерзайки на основе метанола. Нужно помнить, что метанол является страшным ядом. При изготовлении зимней жидкости для омывательного бачка нужно быть крайне осторожным с его применением, не допускать попадания вещества в дыхательные пути и на слизистые оболочки глаз. Берется одна часть метанола, которая разводится в девяти частях воды. Для лучшего очистительного эффекта в раствор добавляют большую ложку порошкового средства для мытья посуды.

Из чего делают незамерзайку вы теперь знаете, но в заключение хотелось бы напомнить несколько важных советов, которые помогут применить и изготовить ее правильно.

• Чтобы не допустить повреждения стеклоочистителей, используйте при изготовлении незамерзайки только дистиллированную воду. Обычная вода может оставить налет и ржавчину на форсунках и в насосе бачка.
• После изготовления незамерзающей жидкости не забудьте проверить ее морозом.
• Приобретенной незамерзайке также не повредит такой эксперимент.
• Храните приготовленную незамерзающую жидкость в недоступном для детей месте, так как она может быть для них опасна.

Все рецепты доступны для изготовления как технически, так и по вложению средств. Поэтому стоит поэкспериментировать и убедиться в том, что они работают, и тем самым сэкономить на их применении некоторую сумму.

В холодное время года любой автомобиль требует особого ухода. В связи с этим затраты средств на обслуживание транспорта значительно возрастают, и многие автовладельцы ищут более экономичные, но не менее безопасные альтернативы различным расходным материалам. К такой альтернативе относится самодельная незамерзайка.

Зимой качественная незамерзающая жидкость для омывания стекол просто необходима. Она обеспечивает хорошую очистку лобового стекла, обеспечивает хорошую видимость и, соответственно, безопасность водителя и пассажиров. Некачественные моющие средства для стекол способны не просто оставить разводы, но и замерзнуть, тем самым, вывести из строя весь омыватель. Чтобы этого не происходило, добросовестные изготовители производят жидкость с добавлением изопропилового спирта. А остальные могут сократить себестоимость продукта, используя крайне опасный для здоровья метанол.

Но как сэкономить средства и быть уверенным в качестве и безопасности зимнего моющего средства для стекол? Незамерзайка своими руками — отличное решение такого вопроса. Только самостоятельно подбирая нужные компоненты для очистительной жидкости, автовладелец сможет ясно проконтролировать ее состав.

Тонкости самостоятельного изготовления

Итак, как самому сделать незамерзайку просто, доступно и качественно? Чтобы ответить на этот вопрос, необходимо хорошо разобраться с ее составом и фукциональностью каждого элемента.

1. Этиловый спирт. Как известно, эта жидкость не имеет сильно выраженного запаха, не токсична, а, следовательно, на основе ее можно создать безопасную, для здоровья и жизни водителя, незамерзайку. Что касается очистительных способностей: незамерзайка на основе этилового спирта и дистиллированной воды легко справляется с брызгами грязи из-под колес, периодически появляющимися на лобовом стекле. Нормальный температурный режим для работы такой незамерзайки — 30 градусов ниже нуля, а то и больше. Это зависит только от концентрации данного спирта в растворе. Единственный значительный минус, который стал причиной отказа от этилового спирта в промышленном производстве незамерзайки — это его цена.

2. Изопропиловый спирт. Сегодня широко применяется в производстве различных растворителей, лаков и красок. Имеет достаточно сильный специфический запах, токсичен. Несмотря на это, незамерзайки на его основе считаются вполне безопасными и производятся в больших количествах. Если возникает желание включить изопропиловый спирт в состав незамерзайки для авто, то следует знать, что слишком большая концентрация может привести к повреждениям лакокрасочных покрытий и резиновых элементов автомобиля. Стоимость такой жидкости на основе этого спирта ниже, чем стоимость того же объема незамерзайки из этилового спирта. Но здесь понадобится большое количество концентрированного ароматизатора, чтобы заглушить истинный запах изопропилового спирта.

3. Метиловый спирт. Очень токсичный и ядовитый. Вдыхание его паров приводит к отравлению организма, что чревато головокружением, тошнотой, головной болью и общим недомоганием. Это особенно опасно при возникновении симптомов отравления за рулем, поскольку может привести к аварийным ситуациям. Поскольку метанол практически не имеет запаха, а точнее его запах такой же как и у этанола, его легко можно принять за этиловый спирт. Поэтому следует крайне осторожно отнестись к незамерзайке без ярко выраженного запаха. Лучше перестраховаться, и воздержаться от использования данного спирта в составе самодельной незамерзайки. А если все-же рецепт незамерзайки подразумевает использование метанола, то следует проявить осторожность и аккуратность в работе с этим ядом, и строго соблюдать все правила техники безопасности.

Как внешне отличить качественную незамерзайку?

Во-первых, чтобы жидкость не оставляла разводы, она должна быть прозрачной, без ненужных примесей. Наличие какого-либо осадка на дне емкости — повод насторожиться. Чтобы и самодельная очищающая жидкость была чистой и без каких-либо осадков, в ее состав должна входить только дистиллированная вода, или необходимо качественно фильтровать незамерзающую смесь и ее компоненты.

Во-вторых, для хорошей очистки стекол, жидкость должна содержать немного моющего вещества. Это вещество создаст небольшое количество пены на поверхности смеси при встряхивании закрытой емкости. Если пены не образовалось или получилось слишком много, то следует задуматься.

В-третьих, незамерзайка потому так и называется, что при очень низких температурах, она должна остаться жидкой и справиться со своими функциями. Чтобы проверить купленную или приготовленную самостоятельно жидкость перед ее заливкой в бочок омывателя, ее следует налить в небольшую тару и выставить на мороз на 8-12 часов. Если она осталась жидкой, без кусочков льда и продолжает хорошо растекаться по стеклу, то такую незамерзайку можно смело заливать в омыватель.

Несколько рецептов незамерзайки, сделанной своими руками в домашних условиях

Для начала, разберемся: из чего делают незамерзайку в домашних условиях.

Чтобы самостоятельно изготовить такую жидкость, необходимо иметь хорошо очищенную воду (или дистиллированную), этиловый или изопропиловый спирт и хорошее моющее средство (в некоторых случаях подойдет средство для мытья посуды, стекол или обычный стиральный порошок). При этом, концентрацию того или иного компонента подбирают индивидуально, ориентируясь на температурный режим местности, количество и характер возможных загрязнений. Если все выполнить правильно, то 10 литров такой незамерзающей моющей жидкости хватит до весны.

Путем проб и ошибок, автолюбителями было разработано множество рецептов и технологий приготовления незамерзайки своими руками. Рассмотрим некоторые из них.

1. Безопасная незамерзайка из смеси неспиртовой ароматизированной стеклоочистительной жидкости (7 л) и медицинского спирта (3-3,5 л). Данная жидкость смешивается в обыкновенной канистре. Выдерживает температуру до 30 градусов ниже нуля. Если климат в регионе позволяет, можно сократить количество спирта до 2-х литров.

2. Для работы омывателя при -25 градусов, можно использовать жидкость из смеси бытовой спиртовой жидкости для очистки стекол (3,5 л) и дистиллированной воды (6,5 л).

3. Смесь из качественного моющего средства для посуды (50-70 грамм) и очищенной воды (4 л). Здесь именно моющее средство не позволит замерзнуть жидкости, поэтому к его качеству предъявляются особые требования.

4. Раствор пяти литров 9% уксуса в пяти литрах дистиллированной воды можно также использовать для заправки бачка стеклоомывателя, но только при температурном режиме ниже -10 градусов. Иначе запах уксуса будет по всему салону.

5. Раствор аммиака (3,5 л) в очищенной воде (6,5 л) следует изготавливать с осторожностью, не допуская пенообразования. Если в него добавить 150 грамм 9% уксуса, то его использование станет возможным при более низких температурах.

6. Надежно работает в условиях ниже -20 градусов раствор 70% изопропилового спирта (200 грамм) в 4-х литрах воды.

7. Смесь 2,5 стакана (625 грамм) этилового спирта, 4,5 л очищенной воды и ложки стирального порошка хорошо перемешивают и фильтруют, после чего используют в качестве незамерзайки.

8. Смешав в пропорции 1:9 метанол и воду можно также получить незамерзайку, но ее токсичность и опасность для здоровья делают ее использование крайне нежелательным.

Как сделать незамерзайку своими руками? Очень просто. Надежную, качественную и, самое главное, безопасную для жизни и здоровья людей, незамерзайку можно приготовить самостоятельно в домашних условиях, используя материал данной статьи.

Ресурс работы щеток лобового стекла напрямую зависит от того, какая жидкость залита в омыватели. Сегодня на рынке представлен большой выбор моющих средств, однако некоторые их них токсичны или слишком дорогие.

В весенне-летний период, когда на улице стоит теплая погода, можно обойтись и без специализированной жидкости, заправив омыватели дистиллированной водой. Но, стоит учитывать, что такая жидкость не обладает высокими моющими и растворяющими характеристиками, поэтому серьезные загрязнения и останки насекомых будут оставаться на лобовом стекле. Чтобы сэкономить и получить более качественное моющее средство достаточно понять, что входит в состав магазинных незамерзаек. К счастью, в этих жидкостях нет сложных химических компонентов, поэтому изготовить их можно и своими руками.

Что входит в состав незамерзайки

Чтобы стекла машины качественно очищались от пыли, грязи и прочих загрязнений, в составе моющего средства присутствуют:

• ПАВ (поверхностно-активные вещества). Очень быстро смачивают пыль и загрязнения органического происхождения.
• Компоненты для повышения смазывающих характеристик и вязкости жидкости.
• Спиртовая основа.

На последнем пункте стоит остановиться подробнее. Сегодня в качестве спиртовой основы используется несколько типов жидкостей:

• Этиловый спирт (пищевой). Считается самым лучшим благодаря своим характеристикам, отсутствию запаха и тому, что он не наносит вреда человеку. Однако стоимость этанола довольно высока, поэтому производители редко используют такую спиртовую основу.

• Метиловый спирт. Метанол стоит намного дешевле этанола, поэтому он широко используется в промышленности. Этот спирт способен выдерживать температуру до -96 градусов и не обладает неприятным едким запахом. Однако при его испарении оказывается негативное влияние на человеческий организм. Из-за высокой токсичности жидкости ее запрещено использовать для производства бытовых и автомобильных моющих средств. Кроме этого метанол оказывает пагубное влияние на патрубки авто.

• Изопропиловый спирт (одноатомный). Является довольно дешевым продуктом, который не несет такой опасности для здоровья, как метанол. Однако изопропиловый спирт отличается резким неприятным запахом, что вынуждает производителей добавлять в состав незамерзайки многочисленные ароматизаторы (хотя даже это не помогает).

Для самостоятельного изготовления автовладельцы используют разные основы. Однако, лучше всего применять самый безвредный, этиловый спирт. Хоть он и дороже, его пары не несут серьезной угрозы.

Незамерзайка с этиловым спиртом

Для приготовления жидкости понадобится сам спирт, чистая дистиллированная вода (если нет под рукой, то можно прокипятить обычную воду из-под крана), эфирное масло и этиленгликоль. Последний компонент необходим для того, чтобы придать жидкости необходимую концентрацию и предотвратить быстрое испарение состава.

После этого необходимо смешать 2 части воды и одну часть спирта. Однако соотношение может быть изменено в зависимости от климата. Например, для приготовления 5-литровой бутылки незамерзайки будет достаточно 600 мл спирта, если температура «за бортом» редко опускается ниже -5. При -10 градусах понадобится уже 1,1 литр этанола. Если холода доходят до -15, то объем спирта увеличивается до 1,2 л. При температуре -20, -25, -30 потребуется 1,6, 2,2, 2,6 литров спирта соответственно.

На следующем этапе необходимо смешать жидкость с этиленгликолем. Его объем также зависит от холода. На каждый отрицательный градус понадобится 15 г этиленгликоля. Например, для холодного региона, где морозы опускаются до -30 потребуется 450 г этого компонента. Некоторые заменяют этиленгликоль антифризом. Оба этих состава довольно токсичны. Поэтому нужно работать в перчатках и маске или заменить этиленгликоль безвредным пропиленгликолем.

Чтобы от самодельной незамерзайки не исходил неприятный спиртовой запах, нужно добавить в нее пищевой ароматизатор, специальный гель или эфирное масло. Последнее обойдется дешевле всего. На 5 л моющей жидкости достаточно 3 мл «пахучего» состава.

После этого остается только тщательно перемещать жидкость и начать ее использовать или приготовить более дешевый состав.

Совет! Чтобы незамерзайка обладала еще и очищающими характеристиками в жидкость можно добавить стиральный порошок (порядка 35 г на 5 литров).

Незамерзайка с изопропиловым спиртом

Одноатомный спирт обойдется дешевле и не требует серьезных расчетов. Для приготовления состава нужно подготовить дистиллированную воду, спирт и средство для мытья посуды (без хлора). После этого в 5-литровую пластиковую бутылку заливаем 2 литра чистой воды и такое же количество спирта. Далее:

• Тщательно взбалтываем все компоненты.
• Аккуратно снимаем крышку бутылки и вливаем порядка 60 мл средства для мытья посуды.
• Снова закрываем тару и взбалтываем состав.

Такая жидкость подходит для использования при температурах до -20 градусов. Если зима более суровая, то достаточно увеличить долю изопропилового спирта.

Важно! Если концентрация спирта будет слишком большой, то важно, чтобы средство не попало на резиновые детали и лакокрасочные покрытия. Такой состав способен разъедать эти материалы.

Если использовать спирт не хочется, то его можно заменить и другими «ингредиентами», которые стоят еще дешевле и не наносят вреда человеку.

Другие методы приготовления незамерзайки

Особенно отчаянные автовладельцы смешивают 9 частей воды и 1 часть метанола, добавляя немного стирального порошка. Однако уже на этапе приготовления такой незамерзайки нельзя вдыхать ее пары и важно обязательно защитить глаза и кожные покровы.

Лучше воспользоваться более безопасными способами приготовления моющей жидкости с использованием компонентов, которые найдутся в любом доме:

• Уксус. Это средство приготовить легче всего. Для этого нужно смешать 9-процентный столовый уксус с чистой водой в равных количествах. После этого остается добавить в состав 30 мл средства для чистки посуды и тщательно взболтать незамерзайку. Она будет эффективной при температуре не ниже -15 градусов.
• Аммиак. Еще наши бабушки использовали нашатырный спирт для мытья окон и других стеклянных поверхностей. Чтобы приготовить жидкость для мытья лобового стекла потребуется 1 часть аммиака и 3 части дистиллированной воды. Вливать нашатырь нужно очень медленно (лучше по стенке емкости), чтобы не появлялась пена. Готовый состав можно использовать при температуре до -10.

Если смешать 3 л чистой воды, 300 г средства для мытья посуды и тщательно взболтать компоненты, то такого состава будет достаточно для того, чтобы поддерживать стекла в чистоте до температуры -5 градусов.

Если нужно что-то более морозоустойчивое, то можно воспользоваться медицинским спиртом (96%). Для этого нужно смешать 250 мл жидкости с 3 литрами чистой воды и столовой ложкой порошка для стирки. После этого состав отфильтровывается и используется при температурах до -25 градусов.

Некоторые просто смешивают обычную водку, воду и свежевыжатый лимонный сок. Однако нужно учитывать, что горячительные напитки, в которых содержится не более 40% спирта, замерзают при температуре от -22 градусов.

В заключение

Таким образом, можно не тратиться на дорогостоящие и небезопасные магазинные незамерзайки. Главное правильно подобрать компоненты, чтобы жидкость не превратилась в лед в баке омывателя.

как сделать своими руками, состав и пропорции компонентов, из чего делают жидкость без запаха, срок годности

Лобовое стекло машины сохраняет чистым и не обледеневшим специальная жидкость, которая впрыскивается из омывателя. Отказаться от ее использования нельзя, ведь это неизбежно приведет к ухудшению обзора, значит, многократно повысит риск попасть в аварию.

Незамерзайка для авто должна быть качественной, и ее можно изготовить самостоятельно. О том, как это сделать, читайте далее в статье.

📌 Содержание статьи

Зачем нужна незамерзайка для авто

Летом лобовое стекло машины можно омыть водой. Зимой водитель должен видеть дорогу так же хорошо, но это возможно только с использованием незамерзающего средства для очистки от пыли и грязи. Ведь в холодное время года стекло не только пачкается, но из-за разницы температур в салоне машины и на улице покрывается коркой льда.

Особый состав незамерзайки для авто избавит его от грязи, разводов на поверхности и предотвратит появление морозных узоров.

Состав жидкостей для авто

Готовые средства для омывания стекла зимой бывают трех видов:

• На основе метилового спирта. Это полулегальные жидкости, которые вообще-то запрещены к использованию в России. Но их можно купить дешево, и они хорошо справляются в грязью, обледенением.
• Только нужно учесть, что метанол вреден для здоровья, даже если автомобилист не собирается пить такую незамерзайку. Вдыхать пары вещества нежелательно, это может привести к появлению тошноты и головокружения.
• На основе этилового спирта. Это качественные, но очень дорогие жидкости для стеклоомывателя. Этанол не наносит вреда здоровью, используясь по прямому назначению, хорошо устраняет загрязнения, предохраняет поверхность от образования ледяного пласта. Но не всегда можно купить такую незамерзайку, так как из-за дороговизны средства не очень распространены.
• На базе изопропилового спирта. Это самые используемые жидкости для стекол. Они недорогие, хорошо справляются со своей задачей. Но имеют и минусы: изопропил сильно пахнет и при сильном морозе увеличивает вязкость средства. Последнее делает его непригодным к использованию. Чтобы незамерзайка на основе изопропила работала при низких температурах, в ней должна быть высокая концентрация вещества. Значит, запах станет еще более резким.

Мнение эксперта

Надежда Смирнова

Эксперт по автомобильному праву

Чем на более высокую температуру рассчитано средство, тем меньше оно пахнет. Поэтому тем, кто не живет на крайнем севере, стоит брать жидкость, сохраняющую свои свойства при минус 20-25 градусов.

Как сделать незамерзайку своими руками

Стандартов для жидкости, предназначенной к заливанию в омыватель, нет. Поэтому незамерзайка своими руками для авто вполне доступна всем, тем более что ингредиенты можно купить.

Состав и пропорции компонентов

Есть несколько рецептов приготовления средства для омывания лобового стекла:

• На основе жидкости для чистки окон. Но не каждая из имеющихся в продаже подойдет, нужно выбрать средство, содержащее спирт. Состав незамерзайки для авто и пропорции компонентов такие: 33% жидкости для мытья окон, остальное – дистиллированная вода.
• На основе медицинского спирта. Подойдет вещество крепостью в 95 или 70 градусов. Но от этого показателя зависят пропорции. Если спирт 95 градусов, его нужно 650 г, 70-градусного антисептика берут 750 г. Воды в каждом случае отмеряют 3 литра. После ее смешивания со спиртом добавляют еще 1 ст.л. стирального порошка и все взбалтывают.

• На основе уксуса. Чтобы долго не искать, из чего делают незамерзайку для авто, берут этот доступный продукт и смешивают с водой в пропорции 1:1. Рецепт лучше использовать при температуре за окном не меньше минус 10 градусов. Только в этом случае станет слабее запах.
• На основе аммиака. На 2 л воды берут 1 л вещества. Их смешивают, используя ложку или прутик, чтобы предотвратить образование пены. Трясти емкость нельзя. Чтобы средство работало при сильном морозе, в нее добавляют 100-150 г уксуса. Эта жидкость очень эффективна, но имеет резкий запах, поэтому рецептом может воспользоваться не каждый автомобилист.

Мнение эксперта

Надежда Смирнова

Эксперт по автомобильному праву

Предложенные способы приготовления незамерзайки не раз опробованы. Но все же не стоит сразу готовить большое количество. Лучше сделать немного, чтобы проверить, не останется ли после использования разводов на стекле, сможет ли водитель переносить запах средства. Во всех случаях воду стоит брать бутилированную, а не из-под крана, если только по рецепту не требуется дистиллированная.

Как сделать жидкость без запаха

Чувствительным людям не стоит использовать для очищения стекла сильно пахнущее средство. Иначе дискомфорт и головная боль им обеспечены, а за рулем это опасно. Нужна незамерзайка для авто без запаха, такую тоже можно приготовить в домашних условиях.

В качестве основы берут жидкость для мытья посуды. Качественные средства содержат минимум отдушек, в них нет негативно влияющих на здоровье веществ. Важное качество базы – невосприимчивость к низкой температуре, что легко проверяется.

Для приготовления незамерзайки подойдет концентрированная жидкость «Фейри». Нужно отмерить 1,5 ст.л. и размешать в 5 л воды. Если предполагается использовать другое средство для мытья посуды, пропорции нужно выявлять экспериментальным путем.

Достаточно нейтральный запах имеют также незамерзайки на основе этанола и жидкости для чистки окон. А если средство нужно на короткое время, и нет возможности долго возиться с приготовлением, можно смешать водку с водой. Запах от нее быстро выветривается, и при несильном холоде средство хорошо работает.

Срок годности

Многие покупают средство для омывателя впрок. Но срок годности незамерзайки для авто ограничен. Он зависит от состава и условий хранения. В среднем это 2-3 года с даты изготовления. Но нужно учитывать, что в тепле спирт, например, может испаряться, и эффективность жидкости снизится. Это более вероятно, если емкость вскрыта, а крышка неплотно завинчена.

Перед новым сезоном использования оставшейся с прошлого года незамерзайки лучше протестировать ее. Только потом следует наполнять емкость омывателя. Об испортившемся продукте может свидетельствовать изменение консистенции, цвета или запаха.

О том, как приготовить незамерзайку самостоятельно, смотрите  в этом видео:

Качественные марки средства для омывателя

Если нужна готовая жидкость незамерзайка для авто, следует обратить внимание на следующие:

• «Effect Plus». Средство отечественного производства, сохраняет свойства и при минус 30. В его составе изопропил и вода.
• «Hi clear». Импортная, дорогая жидкость. Пригодна и при минус 25 градусах, расходуется экономно.
• «Чистая миля». Еще один отечественный продукт, зарекомендовавший себя на «отлично». Запах слабый.
• «Pringo». Заявлено, что средство предназначено для температуры до минус 20 градусов. Но оно способно сохранить свойства и при более сильном холоде.

Перечисленные жидкости часто подделывают, поэтому нужно быть внимательнее при покупке.

Рекомендуем прочитать о штрафе за светодиодные фары. Из статьи вы узнаете о том, какие можно поставить лампочки для фар, допустимых вариантах применения светодиодных фар, штрафе за нарушение установки.

А здесь подробнее о том, как выбрать номера на автомобиль.

Незамерзайка для авто – предмет, с которым продавцы часто хитрят. Чтобы не нарваться на некачественную жидкость, лучше покупать ее в холодное время года и в специализированном магазине. Или приготовить самостоятельно, но сначала опробовать, не уезжая далеко от дома.

Полезное видео

О том, какую незамерзайку выбрать для своего автомобиля, смотрите в этом видео:

Состав среды для эффективного медленного замораживания линий эмбриональных клеток, полученных из морской медаки (Oryzias dancena)

Cytotechnology. 2016 Янв; 68 (1): 9–17.

, , , и

Мин Сунг Ким

Кафедра биологии рыболовства, Национальный университет Пукён, департамент Пусан, 608-7372

Кореи Морские биоматериалы и аквакультура, Национальный университет Пукён, Пусан, 608-737 Корея

Сын Тэ Ли

Кафедра биотехнологии животных, Кангвонский национальный университет, Чхунчхон, 200-701 Корея

Чон Мук Лим

Специальность Биомодуляция и кафедра сельскохозяйственной биотехнологии, Сеульский национальный университет, Сеул, 151-921 Корея

Сеунг Пё Гонг

Кафедра биологии рыболовства, Национальный университет Пукён, Пусан, 608-737 Корея

Кафедра морских биоматериалов и Аквакультура, Национальный университет Пукён, Пусан, 608-737 Корея

Лаборатория клеточной биотехнологии, Департамент морских биоматериалов и аквакультуры, Колледж рыбоводства, Национальный университет Пукён, Пусан, 608-737 Корея

Кафедра биологии рыболовства, Национальный университет Пукён, Пусан, 608-737 Корея

Кафедра морских биоматериалов и аквакультуры, Национальный университет Пукён, Пусан, 608-737 Корея

Кафедра биотехнологии животных, Кангвонский национальный университет, Чхунчхон, 200-701 Корея

Специалист в области биомодуляции и кафедры сельскохозяйственной биотехнологии, Сеул Национальный университет, Сеул, 151-921 Корея

Лаборатория клеточной биотехнологии, Департамент морских биоматериалов и аквакультуры, Колледж рыбоводства, Национальный университет Пукён, Пусан, 608-737 Корея

Автор, отвечающий за переписку.

Поступило 27 января 2014 г .; Принято, 2014 г. 28 мая.

Copyright © Springer Science + Business Media Dordrecht 2014

Abstract

Это исследование было проведено для определения оптимального состава среды для замораживания Oryzias dancena линий эмбриональных клеток. Были приготовлены различные среды для замораживания, состоящие из диметилсульфоксида (ДМСО), фетальной бычьей сыворотки (FBS) и трегалозы с различной концентрацией, и линия долгосрочных культивированных эмбриональных клеток была заморожена в каждой среде для замораживания с помощью стандартной программы медленного замораживания в течение 7 дней.Путем измерения жизнеспособности и роста клеток после размораживания, замороженных в каждой замораживающей среде, было определено, что оптимальным составом из трех компонентов является 10% ДМСО, 20% FBS и 0,1 М трегалоза. Клетки после оттаивания, замороженные в оптимальной среде для замораживания, показали сходную морфологию и скорость роста с незамороженными клетками. Затем это условие было применено к двум различным сериям экспериментов; (1) замораживание тех же клеток в течение расширенного периода (57 дней) и (2) замораживание краткосрочных культивированных клеток из других партий в течение 7 дней.Жизнеспособность клеток после размораживания была значительно низкой и сопоставимой в наборе 1 и 2, соответственно, по сравнению с результатом длительного культивирования клеток, замороженных в оптимальной замораживающей среде в течение 7 дней, и аналогичной морфологии и скорости роста с незамороженными аналогами. были обнаружены в клетках после оттаивания из обоих наборов. В заключение, в этом исследовании сначала сообщается об оптимальном составе среды для замораживания эмбриональных клеток O. dancena , который может способствовать сохранению видов рыб, а также совершенствованию клеточной биотехнологии, обеспечивая стабильное хранение клеток.

Ключевые слова: Oryzias dancena , Эмбриональные клетки, Замораживающая среда, Криопротекторы

Введение

Криоконсервация клеток позволяет создать банковскую систему клеток, которая позволяет исследователям управлять множеством различных типов клеток для исследований , сохранение и транспортировка (Dash et al. 2008; Higaki et al. 2013; Mauger et al. 2006). С целью управления и сохранения биоразнообразия рыб была разработана технология криоконсервации эмбрионов, яиц и спермы различных видов рыб (Kopeika et al.2005). Однако существуют ограничения в успешной криоконсервации эмбрионов и яиц рыб из-за их большого размера, большой доли желтка, высокого содержания воды и толстого хориона (Chao and Liao 2001; Kobayashi et al. 2007; Strussmann et al. 1999) . Чтобы преодолеть это ограничение, компетентные в отношении развития клетки, такие как эмбриональные клетки, первичные половые клетки и стволовые клетки, были предложены в качестве отличной альтернативы диплоидным эмбрионам для криоконсервации (Kobayashi et al. 2007; Strussmann et al.1999). Кроме того, высокий потенциал развития клеток может способствовать совершенствованию клеточной биотехнологии, такой как трансгенные исследования (Bail et al. 2010; Yan et al. 2013). Для успешного достижения этих целей следует предпочтительно осуществлять оптимизацию видоспецифичных условий замораживания для компетентных в отношении развития клеток рыб, чтобы обеспечить стабильное хранение и поставку клеток. На сегодняшний день во многих исследованиях предпринимались попытки оптимизировать условия замораживания компетентных в отношении развития клеток различных видов рыб, включая бластомеры рыбок данио Danio rerio и первичные половые клетки (Higaki et al.2013; Копейка и др. 2005), medaka Oryzias latipes бластомеров (Strussmann et al. 1999), радужной форели Oncorhynchus mykiss первичных зародышевых клеток (Kobayashi et al. 2007; Okutsu et al. 2006), белил Sillago japonica blastomeres (Strussmann et al. . 1999), бластомеры pejerrey Odontesthes bonariensis (Strussmann et al. 1999) и эмбриональные стволовые клетки rohu Labeo rohita (Dash et al. 2008). Marin medaka, Oryzias dancena , является хорошей экспериментальной модельной рыбой, такой как D.rerio и O. latipes , которые являются хорошо известными экспериментальными модельными рыбами из-за нескольких свойств, включая ежедневный нерест, быстрый рост, приводящий к короткому времени генерации, и простое управление в лабораторных масштабах (Lee et al. 2013a). В дополнение к этим преимуществам, переносимость солености пресной и морской воды сделала их хорошей морской модельной рыбой. В нашем предыдущем исследовании сообщалось об установлении линий эмбриональных клеток O. dancena (Lee et al. 2013a), которые проявляют активность, подобную эмбриональным стволовым клеткам (неопубликованные данные), но условия их эффективного замораживания еще не установлены.В этом исследовании, чтобы разработать эффективные условия замораживания эмбриональных клеточных линий O. dancena , мы исследовали оптимальный состав замораживающей среды при стандартной программе медленного замораживания с использованием двух эмбриональных клеточных линий O. dancena ; уже установленный в предыдущем исследовании (долгосрочное культивирование) и новый в этом исследовании (краткосрочное культивирование). Различные среды для замораживания с добавлением различных концентраций диметилсульфоксида (ДМСО), фетальной бычьей сыворотки (FBS) и трегалозы использовались для разработки оптимальных условий замораживания линий эмбриональных клеток, а жизнеспособность и скорость роста замороженных-размороженных клеток были измерены для проверки эффективности. условия замораживания.

Материалы и методы

Культура клеток

В этом исследовании были использованы две линии эмбриональных клеток O. dancena . Одна представляла собой клеточную линию в 200-й субкультуре, которая уже была создана и описана в нашем предыдущем отчете (долгосрочное культивирование; Lee et al. 2013a), а другая была приготовлена ​​в этом исследовании, как описано ранее, и культивировалась в 49-й субкультуре (короткое -рокультивированный). Культуральная среда представляла собой среду Игла, модифицированную Дульбекко (DMEM; Gibco, Grand Island, NY, USA), с добавлением 4.5 г / л d-глюкозы, 20 мМ HEPES, 1% (об. / Об.) Заменимых аминокислот (Gibco), 15% (об. / Об.) FBS (Cellgro, Манассас, Вирджиния, США), 1% (об. / v) рыбная сыворотка, 50 мкг / мл экстракта эмбриона, 1% (об. / об.) смесь пенициллин-стрептомицин (Gibco), 10 нг / мл рекомбинантного человеческого основного фактора роста фибробластов (bFGF; Gibco), 100 мкМ β-меркаптоэтанол ( Gibco), 2 нМ селенита натрия (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) и 1 мМ пирувата натрия (Gibco). Рыбная сыворотка и экстракт эмбриона были приготовлены, как описано ранее (Lee et al. 2013a).Клетки культивировали на покрытых 0,1% желатином (Sigma-Aldrich) планшетах для тканевых культур с культуральной средой в инкубаторе 28 ° C с воздушной атмосферой и субкультивировали каждые 2 или 3 дня, когда они достигли 80-90% слияния.

Замораживание и оттаивание эмбриональных клеток

Для замораживания эмбриональных клеток культивируемые клетки дважды промывали фосфатно-солевым буфером Дульбекко (DPBS; Gibco), трипсинизировали 0,05% трипсин-ЭДТА (Gibco) и собирали центрифугированием ( 400 г, 4 мин).Осадки клеток суспендировали в замораживающей среде, состоящей в основном из DMEM (Gibco) с добавлением различных концентраций ДМСО (0, 10, 20 и 40%; Sigma-Aldrich), FBS (0, 20, 40 и 60%; Cellgro) и / или трегалоза (0, 0,1, 0,2 и 0,4 М; Вако, Осака, Япония). Из клеточной суспензии 1 × 10 ⁶ клеток переносили в криогенные флаконы объемом 1,2 мл (Sigma-Aldrich), которые затем переносили в морозильный контейнер (Thermo Scientific, Вернон-Хиллз, Иллинойс, США) со скоростью охлаждения — 1 ° C / мин.Через 12 часов в морозильной камере при -75 ° C криогенные флаконы хранили в жидком азоте (-196 ° C) в течение 7 или 57 дней. Для размораживания замороженных эмбриональных клеток криогенные флаконы помещали в водяную баню при 37 ° C на 2 мин. После исчезновения кристаллов льда суспензию клеток переносили в пробирки на 15 мл (SPL Life Sciences, Pocheon, Корея) с 3 мл культуральной среды, и размороженные клетки собирали центрифугированием при 400 g в течение 4 мин.

Жизнеспособность и ростовая активность замороженных-размороженных клеток

Для оценки жизнеспособности клеток 1 × 10 ⁵ клеток после размораживания были засеяны сразу после размораживания в лунку 96-луночного микропланшета (Thermo Scientific) с культуральной средой и Их жизнеспособность оценивали с помощью набора для подсчета клеток-8 (Dojindo, Kushu, Japan) в соответствии с инструкциями производителя.Незамороженные клетки использовали в качестве контроля. Жизнеспособность рассчитывали как оптическую плотность _{образца} / оптическую плотность _{контроля} × 100. Для измерения активности роста замороженных-оттаявших клеток 1 × 10 ⁵ клеток после оттаивания засевали в лунку с 0,1% -м желатиновым покрытием 24- лунку культурального планшета (SPL) заполняли питательной средой и культивировали в течение 48 ч в инкубаторе при 28 ° C с воздушной атмосферой. После этого культивированные клетки собирали с использованием 0,05% трипсина-ЭДТА (Gibco) и подсчитывали количество клеток с помощью гемоцитометра (Marienfeld, Lauda-Königshofen, Германия).Эти эксперименты были повторены трижды независимо.

Измерение скорости роста

Для измерения скорости роста сначала 1 × 10 ⁶ клеток после размораживания стабилизировали путем культивирования в обычных условиях культивирования клеток в течение 48 часов. Затем 2 × 10 ⁴ клеток после оттаивания или незамороженных клеток на лунку засевали в покрытые 0,1% желатином 48-луночные чашки MultiDish (Thermo Scientific), заполненные культуральной средой, и культивировали в течение 9 дней в инкубаторе при 28 ° C с воздушная атмосфера.Среду для культивирования меняли каждые 3 дня после первой смены в 1 день культивирования. С 1 по 9 день культивирования пролиферирующие клетки подсчитывали ежедневно с помощью гемоцитометра (Marienfeld). Этот эксперимент был повторен трижды независимо.

Статистический анализ

Для анализа числовых данных использовалось программное обеспечение системы статистического анализа (SAS). Когда дисперсионный анализ (ANOVA) выявил значительный первичный эффект, методы лечения впоследствии сравнивали по методу наименьших квадратов или по методу Дункана. P <0,05 считались показателем значимых различий.

Результаты

Оптимизация среды для замораживания

O. dancena эмбриональных клеток

Для определения оптимальных условий замораживания O. dancena эмбриональных клеточных линий, различные концентрации ДМСО, FBS и трегалозы были использованы для приготовления замораживающей среды. который в основном состоит из DMEM, содержащего криопротекторы (ДМСО или трегалозу) и FBS. Сначала 0, 10, 20 и 40% ДМСО добавляли в замораживающую среду, содержащую 40% FBS, и длительно культивируемые эмбриональные клетки замораживали в каждой замораживающей среде.Через 7 дней жизнеспособность замороженных-размороженных клеток в каждой замораживающей среде показала значительные различия (рис. А, p <0,0001), при этом самая высокая жизнеспособность (64,3 ± 12,6%) была обнаружена в клетках, замороженных 10% ДМСО. . В следующей серии экспериментов в среду для замораживания, содержащую 10% ДМСО, добавляли 0, 20, 40 и 60% FBS, и эмбриональные клетки, культивируемые в течение длительного периода времени, замораживали в каждой среде для замораживания в течение 7 дней. Не было обнаружено значительных различий в жизнеспособности клеток среди групп замороженных-размороженных клеток (рис. B; 42.От 3 ± 7,7 до 60,1 ± 8,7% жизнеспособности, p = 0,0796). Наконец, к замораживающей среде добавляли 0, 0,1, 0,2 и 0,4 М трегалозы, которая имела фиксированные концентрации 10% ДМСО и 20% FBS, и оценивали тот же параметр. Клетки, замороженные 0,1 М трегалозой, показали самую высокую жизнеспособность по сравнению с другими группами (от 73,5 ± 10,2% против 31,9 ± 12,3 до 57,9 ± 11,9%, p <0,0001), но довольно высокую концентрацию (0,4 М) трегалозы. значительно подавлял жизнеспособность клеток после размораживания.

Определение оптимального состава среды для замораживания Oryzias dancena длительно культивируемые эмбриональные клетки. Клетки замораживали в среде для замораживания, содержащей различные концентрации диметилсульфоксида (ДМСО), фетальной бычьей сыворотки (FBS) или трегалозы, в течение 7 дней, и жизнеспособность клеток после оттаивания измеряли с помощью набора для подсчета клеток-8. Незамороженные клетки использовали в качестве контроля, и жизнеспособность рассчитывали как оптическую плотность _{образца} / оптическую плотность _{контроля} × 100.Значения указывают среднее ± стандартное отклонение. A Жизнеспособность клеток в зависимости от различных концентраций ДМСО в замораживающей среде, содержащей 40% FBS. Был обнаружен значительный модельный эффект ( p <0,0001), и самая высокая выживаемость была выявлена ​​в клетках, замороженных 10% ДМСО. B Жизнеспособность клеток в зависимости от различных концентраций FBS в замораживающей среде, содержащей 10% ДМСО. Между группами лечения не было обнаружено значительных различий ( p = 0,0796). C Жизнеспособность клеток в зависимости от различных концентраций трегалозы в замораживающей среде, содержащей 10% ДМСО и 20% FBS.Был обнаружен значительный модельный эффект ( p <0,0001), и самая высокая выживаемость была обнаружена в клетках, замороженных 0,1 М трегалозой. A — C Различные буквы на графике указывают на существенные различия

Рост эмбриональных клеток после оттаивания

Для подтверждения результатов жизнеспособности клеток после замораживания-оттаивания и определения того, сохраняют ли клетки после оттаивания потенциал роста, клетки Количество замороженных-размороженных клеток из всех групп обработки, которые использовали ДМСО, FBS и трегалозу, подсчитывали после культивирования в течение 2 дней в обычных условиях культивирования (рис.). Как и ожидалось, группы с 0 и 40% DMSO с 40% FBS, которые имели очень низкую жизнеспособность клеток после оттаивания, не росли вообще, а группа 0,1 M трегалозы с 10% DMSO и 20% FBS, которые имели наивысшую жизнеспособность клеток после оттаивания, показали значительно большее количество клеток, чем другие (30,7 ± 3,1 × 10 ⁴ по сравнению с 0 до 26,5 ± 2,29 × 10 ⁴ клеток, p <0,0001). Хотя среди групп было обнаружено различное количество клеток, было установлено, что все замороженные-размороженные клетки, за исключением двух групп, сохраняли потенциал роста.

Рост после оттаивания Oryzias dancena длительно культивируемых эмбриональных клеток. 1 × 10 ⁵ клеток после оттаивания из всех групп обработки, которые использовали диметилсульфоксид (ДМСО), фетальную бычью сыворотку (FBS) или трегалозу, культивировали в течение 2 дней и подсчитывали количество клеток в каждой. Значения указывают среднее ± стандартное отклонение. Все клетки после оттаивания, за исключением двух групп (группы 0 и 40% ДМСО при 40% FBS), были способны расти в культуре, и самый высокий уровень извлечения клеток был достигнут в клетках после оттаивания, которые были заморожены в замораживающей среде, содержащей 10% ДМСО, 20% FBS и 0.1 M трегалозы. Эффект модели был <0,0001 и a — h разные буквы указывают на существенные различия

Клетки после оттаивания, которые были заморожены в замораживающей среде, содержащей 10% ДМСО, 20% FBS и 0,1 M трегалозы, были дополнительно культивированы и сравнивались с незамороженные клетки на морфологию клеток и скорость роста. Как показано на фиг. А, сходная морфология клеток была идентифицирована до и после замораживания-оттаивания. Время удвоения эмбриональных клеток после размораживания и незамороженных эмбриональных клеток составило 26.64 и 26,24 ч соответственно, не показывая разницы между двумя популяциями клеток (рис. B).

Сравнение морфологии клеток и активности роста незамороженных клеток и клеток после размораживания. Долгосрочные культивированные эмбриональные клетки замораживали в замораживающей среде, содержащей 10% диметилсульфоксида, 20% фетальной бычьей сыворотки и 0,1 М трегалозы, в течение 7 дней, и их морфология ( A ) и скорость роста ( B ) после оттаивания были по сравнению с незамороженными клетками. Две группы клеток не показали никаких различий ни в морфологии, ни в скорости роста. Шкала = 50 мкм

Подтверждение оптимальных условий замораживания

Для подтверждения оптимальных условий замораживания с использованием 10% ДМСО, 20% FBS и 0,1 М трехаолозы были разработаны два различных экспериментальных набора; (1) эмбриональные клетки, культивируемые в течение длительного периода времени, замораживали в течение периода увеличения продолжительностью 57 дней и (2) эмбриональные клетки, культивируемые в течение короткого периода времени из другой партии, замораживали в течение 7 дней в тех же условиях замораживания. В результате 50,7 ± 6,8 и 57,7 ± 8,3% жизнеспособности клеток после оттаивания были идентифицированы в наборе 1 и наборе 2 соответственно (рис.а). По сравнению с предыдущим результатом замораживания клеток длительного культивирования в течение 7 дней, клетки, замороженные в течение периода размножения, показали значительно более низкую жизнеспособность (73,5 ± 10,2 против 50,7 ± 6,8%, p <0,05), в то время как клетки, культивируемые кратковременно. из другой партии не показали значительных различий в жизнеспособности клеток после размораживания (73,5 ± 10,2 против 57,7 ± 8,3%, p > 0,05). Морфология клеток после оттаивания была сходной с морфологией незамороженных клеток в обеих популяциях клеток после оттаивания из двух экспериментальных наборов (рис.б), и аналогично, скорости роста существенно не различались до и после замораживания-оттаивания в обеих популяциях клеток (рис. c, d).

Проверка оптимальных условий замораживания с использованием 10% диметилсульфоксида, 20% фетальной бычьей сыворотки и 0,1 М трегалозы. Были разработаны два разных набора экспериментов; (1) замораживание долго культивируемых клеток в течение расширенного периода (57 дней) и (2) замораживание краткосрочных культивируемых клеток из другой партии в течение 7 дней. A Сравнение жизнеспособности клеток после размораживания с жизнеспособностью клеток, подвергнутых длительному культивированию, замороженных в течение 7 дней.Жизнеспособность клеток после оттаивания была значительно ниже и сопоставима в наборах 1 и 2, соответственно. B — D Морфология и скорость роста клеток после размораживания. Сходные морфологии были идентифицированы до (B1 для набора 1 и B3 для набора 2) и после (B2 для набора 1 и B4 для набора 2) замораживания-оттаивания из обоих наборов. Шкала = 50 мкм. Аналогичным образом, клетки после оттаивания из обоих экспериментальных наборов показали сравнимую скорость роста с незамороженными аналогами (C для набора 1 и D для набора 2). термин культивируемая линия эмбриональных клеток от O.dancena , что впоследствии было подтверждено на тех же клетках, замороженных в течение периода размножения, и в другой партии эмбриональных клеток, культивируемых на короткое время. Оптимальный состав замораживающей среды представлял собой DMEM с добавлением 10% ДМСО, 20% FBS и 0,1 М трегалозы. В программе медленного замораживания клеток определение состава замораживающей среды является наиболее важной задачей, поскольку замораживающая среда играет ключевую роль в предотвращении повреждения клеток во время процесса замораживания (Hunt 2011).Профилактика криоповреждений фактически достигается с помощью криопротектора, добавленного к замораживающей среде, путем подавления образования кристаллов льда во время процесса замораживания (Fuku et al. 1992), и, таким образом, следует тщательно определять выбор криопротектора и его концентрацию. Кроме того, его состав следует по-разному применять к разным видам, учитывая их различные физиологические свойства. Наиболее распространенным из них является ДМСО, который повсеместно используется для криоконсервации клеток животных, таких как эмбриональные стволовые клетки человека (10%; Lee and Lee, 2011), сперматогонические стволовые клетки мыши (10%; Lee et al.2013b), примордиальные половые клетки птицы (10%, Setioko et al.2007) и эмбриональные стволовые клетки рыб (0,8 M; Dash et al. 2008). Аналогичный результат был получен из этого исследования. Оптимальная концентрация ДМСО в замораживающей среде для линий эмбриональных клеток O. dancena составляла 10%, при этом достаточное количество клеток для дальнейшего использования можно было извлечь из небольшого количества клеток после размораживания через 2 дня культивирования, что позволяет предположить, что Программа медленного замораживания с использованием ДМСО может быть хорошо применена к O.Dancena линии эмбриональных клеток для эффективной криоконсервации. FBS является основным компонентом замораживающей среды, поскольку он играет ключевую роль в снижении окислительного стресса (Freimark et al. 2011; Gutteridge and Quinlan 1993). В этом исследовании добавление FBS к среде для замораживания с содержанием 10% ДМСО не влияло на жизнеспособность клеток после оттаивания. Тем не менее, мы решили использовать минимальную концентрацию FBS (20%) в следующей серии экспериментов, основываясь на предыдущих сообщениях о полезности FBS при замораживании клеток (Marco-Jiménez et al.2006 г.). Эффективность FBS в замораживающей среде была впоследствии продемонстрирована в эксперименте, в котором измеряли рост эмбриональных клеток O. dancena после оттаивания. Отсутствие FBS в среде 10% ДМСО привело к значительному снижению количества клеток, чем другие группы, содержащие FBS, в среде 10% ДМСО после того, как клетки из каждой группы после оттаивания культивировали в течение 2 дней. Эти результаты предполагают, что добавление FBS в среду для замораживания, несомненно, необходимо для стабильного замораживания линий эмбриональных клеток из O.dancena вида. Сообщалось, что ДМСО обладает цитотоксическим действием, вызывая изменение текучести мембран и цитоскелета (Brayton 1986; Hunt 2011; Katsuda et al. 1987; Miranda et al. 1978). Чтобы еще больше повысить жизнеспособность клеток после оттаивания, мы сосредоточились на трегалозе, дисахариде, состоящем из двух единиц альфа-глюкозы, который является отличным стабилизатором мембран и белков при стрессе дегидратации (Morgan et al. 2006; Rudolph and Crowe 1985) . Как и ожидалось, добавление трегалозы значительно повысило жизнеспособность клеток после размораживания до 73.5 ± 10,2%. Этот улучшающий эффект трегалозы также подтверждается несколькими отчетами о криоконсервации клеток (Aboagla and Terada 2003; Eroglu et al. 2001). Кроме того, сообщалось, что есть много других компонентов, которые могут улучшить эффективность замораживания клеток. Обработка компонентов, обладающих антиоксидантной активностью в процессе замораживания, может удалить активные формы кислорода с последующей стабилизацией клеток после размораживания (Uchendu et al. 2010). К таким компонентам относятся витамины C и E (Uchendu et al.2010; Cabrita et al. 2011), таурин (Martínez-Páramo et al. 2013), цистеин (Tuncer et al. 2010) и так далее. Кроме того, известно, что белки-антифризы, которые могут эффективно ингибировать перекристаллизацию льда, могут улучшить выживаемость эритроцитов во время криоконсервации (Carpenter and Hansen 1992; Chao et al. 1996). Дальнейшие эксперименты с этими компонентами будут полезны для повышения жизнеспособности после оттаивания линий эмбриональных клеток от O. dancena .

Успешное замораживание ранних субкультивированных эмбриональных клеток может быть достигнуто с помощью замораживающей среды, оптимизированной в этом исследовании.Эмбриональные клетки в ранней субкультуре обладают клеточными свойствами, более близкими к свойствам исходных клеток, из которых произошли эмбриональные клетки, с точки зрения эпигенетического состояния и хромосомной нормальности (Bork et al. 2010; Kanatsu-Shinohara et al. 2005). Таким образом, криоконсервация таких клеток позволяет непрерывно использовать относительно нетрансформированные клетки для биотехнологических приложений. Более того, данные свидетельствуют о том, что оптимальный состав замораживающей среды можно универсально использовать в разных партиях клеток.Наши результаты для клеток, замороженных в течение периода размножения, показали, что оптимизированный состав разработанной замораживающей среды может быть эффективным даже при длительном криоконсервации, показывая выживаемость клеток более чем наполовину (50,7 ± 6,8%) в замороженных клетках. Однако после замораживания в течение 57 дней жизнеспособность клеток была значительно ниже, чем после 7 дней. Теоретически клетки могут быть криоконсервированы в течение длительных периодов времени без каких-либо клеточных изменений при -196 ° C, потому что фазовые изменения воды не происходят при этой температуре, и, таким образом, единственным источником повреждения является прямая ионизация фоновым излучением (Mazur 1988).Наши данные свидетельствуют о том, что может быть связано с нестабильностью клеток, вызванной неоптимальными условиями культивирования эмбриональных клеток O. dancena . В таких обстоятельствах клетки могут чутко реагировать на свое микроокружение. Несмотря на использование одного и того же протокола и тщательного управления клетками во всех независимых экспериментах, незначительные различия в начальных условиях до замораживания могут спровоцировать сильные отклонения в конечной точке. Субоптимальные условия культивирования эмбриональных клеток O. dancena могут косвенно подтверждаться относительно низкой жизнеспособностью клеток после оттаивания (73.Максимум 5 ± 10,2%) по сравнению с таковыми у высших позвоночных, в значительной степени достигающих более 80% (Ock and Rho 2011; Naaldijk et al. 2012; Lee et al. 2013c). Различные серии экспериментов, посвященные продолжительности замораживания и использующие краткосрочные культивированные клетки или другую серию клеточных линий O. dancena , предоставят более четкие доказательства. Тем не менее жизнеспособные клетки после размораживания после замораживания в течение периода размножения все еще сохраняли нормальную скорость роста, и их количество было достаточным для амплификации в культуре для дальнейшего использования.

В заключение мы сначала демонстрируем, что эмбриональные клетки O. dancena можно стабильно замораживать для криоконсервации в оптимальной замораживающей среде, состоящей из 10% ДМСО, 20% FBS и 0,1 М трегалозы. Результаты этого исследования не только могут предоставить полезную информацию для сохранения видов рыб, но также будут способствовать развитию клеточной биотехнологии, использующей преимущества этого вида клеток за счет эффективного хранения и доставки клеток.

Благодарности

Это исследование было поддержано Программой фундаментальных научных исследований через Национальный исследовательский фонд Кореи (NRF), финансируемым Министерством образования, науки и технологий (NRF-2012R1A1A1011572).

Список литературы

• Абоагла Е.М., Терада Т. Текучесть мембраны целевой сперматозоиды с повышенным содержанием трегалозы и ее защита во время замораживания. Биол Репрод. 2003; 69: 1245–1250. DOI: 10.1095 / биолрепрод.103.017889. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Бейл П.Й., Депинс А., Шене Н., Маэ С., Мейсс Г., Лаббе С. Оптимизация инъекции соматических клеток с точки зрения переноса ядер у золотой рыбки. BMC Dev Biol. 2010; 8: 64. DOI: 10.1186 / 1471-213X-10-64. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Bork S, Pfister S, Witt H, Horn P, Korn B, Ho AD, Wagner W.Характер метилирования ДНК изменяется при длительном культивировании и старении мезенхимальных стромальных клеток человека. Ячейка старения. 2010; 9: 54–63. DOI: 10.1111 / j.1474-9726.2009.00535.x. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Brayton CF. Диметилсульфоксид (ДМСО): обзор. Cornell Vet. 1986; 76: 61–90. [PubMed] [Google Scholar]
• Cabrita E, Ma S, Diogo P, Martínez-Páramo S, Sarasquete C, Dinis MT. Влияние некоторых аминокислот и витаминов на подвижность, жизнеспособность и фрагментацию ДНК сперматозоидов рыб после размораживания.Anim Reprod Sci. 2011; 125: 189–195. DOI: 10.1016 / j.anireprosci.2011.03.003. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Карпентер Дж. Ф., Хансен TN. Белок-антифриз модулирует выживаемость клеток во время криоконсервации: посредничество через влияние на рост кристаллов льда. Proc Natl Acad Sci U S. A. 1992; 89: 8953–8957. DOI: 10.1073 / pnas.89.19.8953. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Chao NH, Liao IC. Криоконсервация гамет и эмбрионов рыб и моллюсков. Аквакультура.2001; 197: 161–189. DOI: 10.1016 / S0044-8486 (01) 00586-5. [CrossRef] [Google Scholar]
• Чао Х., Дэвис П.Л., Карпентер Дж. Ф. Влияние белков-антифризов на выживаемость эритроцитов во время криоконсервации. J Exp Biol. 1996; 199: 2071–2076. [PubMed] [Google Scholar]
• Dash SN, Routray P, Dash C, Guru BC, Swain P, Sarangi N. Использование нетоксичного криопротектора трегалозы улучшает восстановление и функцию эмбриональных стволовых клеток рыб после криогенного хранения. Curr Stem Cell Res Ther. 2008. 3: 277–287.DOI: 10,2174 / 157488808786733999. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Eroglu A, Toth TL, Toner M. Криозащита ооцитов мыши и человека с помощью внутриклеточной трегалозы. Криобиология. 2001; 43: 320. [Google Scholar]
• Freimark D, Sehl C, Weber C, Hudel K, Czermak P, Hofmann N, Spindler R, Glasmacher B. Систематическая оптимизация параметров протокола Me ₂ SO- и бессывороточной криоконсервации мезенхимы человека стволовые клетки. Криобиология. 2011; 63: 67–75. DOI: 10.1016 / j.криобиол.2011.05.002. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Фуку Э, Кодзима Т., Шиоя Ю., Маркус Дж. Дж., Дауни Б.Р. Экстракорпоральное оплодотворение и развитие замороженных-размороженных ооцитов крупного рогатого скота. Криобиология. 1992; 29: 485–492. DOI: 10.1016 / 0011-2240 (92)
  -3. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Gutteridge JM, Quinlan GJ. Антиоксидантная защита нормальной человеческой плазмы от органических и неорганических кислородных радикалов: важная первичная роль железосвязывающих и окисляющих железо белков. Biochim Biophys Acta.1993; 1156: 144–150. DOI: 10.1016 / 0304-4165 (93)
  -V. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Higaki S, Kawakami Y, Eto Y, Yamaha E, Nagano M, Katagiri S, Takada T, Takahashi Y. Криоконсервация первичных зародышевых клеток рыбок данио (Danio rerio) путем витрификации желтка -интактные эмбрионы и эмбрионы с истощенным желтком с использованием различных растворов криопротекторов. Криобиология. 2013. 67: 374–382. DOI: 10.1016 / j.cryobiol.2013.10.006. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Hunt CJ. Криоконсервация стволовых клеток человека для клинического применения: обзор.Transfus Med Hemother. 2011; 38: 107–123. DOI: 10,1159 / 000326623. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Kanatsu-Shinohara M, Ogonuki N, Iwano T, Lee J, Kazuki Y, Inoue K, Miki H, Takehashi M, Toyokuni S, Shinkai Y, Oshimura М., Ишино Ф., Огура А., Шинохара Т. Генетические и эпигенетические свойства стволовых клеток мужской зародышевой линии мыши во время длительного культивирования. Разработка. 2005. 132: 4155–4163. DOI: 10.1242 / dev.02004. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Кацуда С., Окада Ю., Наканиси И.Диметилсульфоксид индуцирует образование микротрубочек в культивируемых артериальных гладкомышечных клетках. Cell Biol Int Rep., 1987; 11: 103–110. DOI: 10.1016 / 0309-1651 (87) -X. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Кобаяши Т., Такеучи Ю., Такеучи Т., Йошизаки Г. Получение жизнеспособных рыб из криоконсервированных примордиальных зародышевых клеток. Mol Reprod Dev. 2007; 74: 207–213. DOI: 10.1002 / мрд.20577. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Копейка Дж., Чжан Т., Роусон Д.М., Элгар Г. Влияние криоконсервации на митохондриальную ДНК бластомерных клеток рыбок данио (Danio rerio).Mutat Res. 2005; 570: 49–61. DOI: 10.1016 / j.mrfmmm.2004.09.007. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Lee JE, Lee DR. Эмбриональные стволовые клетки человека: получение, поддержание и криоконсервация. Стволовые клетки Int J. 2011; 4: 9–17. DOI: 10.15283 / ijsc.2011.4.1.9. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Lee D, Kim MS, Nam YK, Kim DS, Gong SP. Создание и характеристика постоянных клеточных линий из эмбрионов Oryzias dancena . Fish Aquat Sci. 2013; 16: 177–185.[Google Scholar]
• Ли Я., Ким Й., Ким Б. Дж., Юнг М. С., Ау Дж. Х., Сео Дж. Т., Пак И. С., Ли Ш., Рю Б. Криоконсервация сперматогониальных стволовых клеток мышей в диметилсульфоксиде и полиэтиленгликоле. Биол Репрод. 2013; 89: 109. DOI: 10.1095 / биолрепрод.113.111195. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Ли Ю.А., Ким Й.Х., Ким Б.Дж., Ким Б.Г., Ким К.Дж., Ау Дж.Х., Шмидт Дж.А., Рю BY. Криоконсервация в трегалозе сохраняет функциональную способность сперматогониальных стволовых клеток мыши. PLoS ONE. 2013; 8: e54889.DOI: 10.1371 / journal.pone.0054889. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Марко-Хименес Ф., Гарсон Д.Л., Пеньяранда Д.С., Перес Л., Виудес-де-Кастро МП, Висенте Дж. С., Ховер М., Астуриано Дж. Ф. Криоконсервация сперматозоидов европейского угря ( Anguilla anguilla ): влияние коэффициента разбавления, добавок фетальной бычьей сыворотки и криопротекторов. Криобиология. 2006; 53: 51–57. DOI: 10.1016 / j.cryobiol.2006.03.011. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Мартинес-Парамо С., Диого П., Динис М. Т., Соарес Ф., Сараскете С., Кабрита Э.Влияние двух серосодержащих аминокислот, таурина и гипотаурина на криоконсервацию спермы европейского морского окуня ( Dicentrarchus labrax ). Криобиология. 2013; 66: 333–338. DOI: 10.1016 / j.cryobiol.2013.04.001. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Mauger PE, Le Bail PY, Labbé C. Криобанк соматических клеток рыб: оптимизация культуры эксплантов плавников и криоконсервация плавниковых клеток. Comp Biochem Physiol B: Biochem Mol Biol. 2006; 144: 29–37. DOI: 10.1016 / j.cbpb.2006.01.004. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Mazur P.Остановка биологического времени. Замораживание живых клеток. Ann N Y Acad Sci. 1988; 541: 514–531. DOI: 10.1111 / j.1749-6632.1988.tb22288.x. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Миранда А.Ф., Нетте Г., Хан С., Брокбанк К.Г.М., Шонберг М. Изменение фенотипа миобластов диметилсульфоксидом. Proc Natl Acad Sci USA. 1978; 75: 3826–3830. DOI: 10.1073 / pnas.75.8.3826. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Morgan CA, Herman N, White PA, Vesey G. Сохранение микроорганизмов путем сушки: обзор.J Microbiol Methods. 2006; 66: 183–193. DOI: 10.1016 / j.mimet.2006.02.017. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Naaldijk Y, Staude M, Fedorova V, Stolzing A. Влияние различных скоростей замораживания во время криоконсервации мезенхимальных стволовых клеток крысы с использованием комбинаций гидроксиэтилкрахмала и диметилсульфоксида. BMC Biotechnol. 2012; 12: 49. DOI: 10.1186 / 1472-6750-12-49. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Ock SA, Rho GJ. Влияние диметилсульфоксида (ДМСО) на криоконсервацию трансплантата клеток мезенхимальных стволовых клеток свиней (pMSCs).2011; 20: 1231–1239. DOI: 10.3727 / 096368910X552835. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Окуцу Т., Яно А., Нагасава К., Шикина С., Кобаяши Т., Такеучи Ю., Йошизаки Г. Манипуляции с зародышевыми клетками рыб: визуализация, криоконсервация и трансплантация. J Reprod Dev. 2006. 52: 685–693. DOI: 10.1262 / jrd.18096. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Рудольф А.С., Кроу Дж. Х. Стабилизация мембран при замораживании: роль двух природных криопротекторов, трегалозы и пролина. Криобиология.1985. 22: 367–377. DOI: 10.1016 / 0011-2240 (85) -1. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Сетиоко А.Р., Тагами Т., Тасе Х, Накамура И., Такеда К., Нирасава К. Криоконсервация первичных половых клеток (ППК) из эмбрионов белого леггорна с использованием коммерческих криопротекторов. J. Poult Sci. 2007; 44: 73–77. DOI: 10.2141 / JPSA.44.73. [CrossRef] [Google Scholar]
• Strussmann CA, Nakatsugawa H, Takashima F, Hasobe M, Suzuki T., Takai R. Криоконсервация изолированных бластомеров рыб: влияние стадии клеток, концентрации криопротектора и скорости охлаждения на выживаемость после оттаивания.Криобиология. 1999; 39: 252–261. DOI: 10.1006 / cryo.1999.2208. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Tuncer PB, Bucak MN, Büyükleblebici S, Sarıözkan S, Yeni D, Eken A, Akalın PP, Kinet H, Avdatek F, Fidan AF, Gündoğan M. Эффект цистеина и глутатиона на сперму и параметры окислительного стресса после разморозки спермы быков. Криобиология. 2010. 61: 303–307. DOI: 10.1016 / j.cryobiol.2010.09.009. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Ученду Е.Е., Леонард С.В., Трабер М.Г., Рид Б.М. Витамины C и E улучшают отрастание и уменьшают перекисное окисление липидов кончиков побегов ежевики после криоконсервации.Отчет о растительных клетках 2010; 29: 25–35. DOI: 10.1007 / s00299-009-0795-у. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Yan Y, Hong N, Chen T, Li M, Wang T, Guan G, Qiao Y, Chen S, Schartl M, Li CM, Hong Y. Нацеливание на ген p53 с помощью гомологичных рекомбинация в ЭС клетках рыб. PLoS ONE. 2013; 8: e59400. DOI: 10.1371 / journal.pone.0059400. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Руководство по эксплуатации и управлению мясной холодильной камерой

Руководство по эксплуатации и управлению мясной холодильной камерой

---

Мясо само по себе не является живым организмом, но оно подвержено эндогенным ферментативным воздействиям. активность или протеолиз, который вызывает созревание мышечной ткани, становится нежный и с характерным вкусом.Этот процесс замедляется из-за холода.

Благодаря своему химическому составу, богатому белками, липидами и вода, мясо — особенно благоприятный субстрат для роста микроорганизмов. Содержание липидов также делает его очень чувствительным к окислению.

Здоровые животные, забитые с соблюдением правил гигиены после отдыха и голодания, обеспечивают практически асептическое мясо. Однако после бойни операции потрошения и перевязки неизбежно производят микробные загрязнение по глубине и особенно на поверхности, в результате контакта с оборудование, инструменты, руки и одежду, несмотря на все меры предосторожности.

Опять же, рост микроорганизмов зависит от температуры. К избегайте этого, абсолютно необходимо снизить температуру мяса, особенно на поверхности, сразу после одевания. Охлаждение должно поэтому проводиться на самой бойне. Эта операция известна как первичное охлаждение.

Мясо теряет вес за счет испарения с поверхности. Этот процесс зависит от разница в температуре и относительной влажности между мясом и среда.

Убойные операции и разделка туш разделяют части животного которые обладают различными гистологическими свойствами и предназначены для разных использует. Сама тушка состоит в основном из мышц, костей, жира и соединительная ткань. Субпродукты включают некоторые съедобные органы, а некоторые железы. используются в фармацевтических препаратах. Эти разные части должны быть подвергаются различным условиям охлаждения в зависимости от их восприимчивости к рост микробов, температурные воздействия и риск попадания на поверхность обезвоживание.

Для предотвращения или даже уменьшения процесса порчи, особенно микроорганизмов развитие, охлаждение должно проводиться быстро после туши обливание в конце убоя и охлажденное состояние должно быть сохраняется до тех пор, пока мясо не будет переработано для потребления.

Охлаждение можно определить как основную операцию при подаче холода на мясо, чтобы быстро снизить его температуру. Это делается в холодной камере с интенсивная тяга или движение воздуха.Быстрое охлаждение поверхности мяса не только замедляет и почти останавливает развитие поверхностных микроорганизмов но также снижает потерю веса и обесцвечивание поверхности из-за окисление гемоглобина. Используются различные системы первичного охлаждения. (включая погружение в ледяную воду, особенно для птицы), но охлаждение на воздухе самый распространенный.

Холодильные камеры, в которых происходит охлаждение, должны иметь низкий уровень воздуха. температура, высокая скорость воздуха, высокая относительная влажность и высокая холодопроизводительность.

Температура воздуха должна быть в районе 0 ° C, не опускаться ниже -1 ° C, что может привести к замерзанию поверхности мяса и ухудшению его внешнего вида.

Скорость воздуха может составлять от 0,25 до 3,0 м / с. Однако для экономичных причины, по которым наиболее часто используются скорости от 0,75 до 1,5 м / с в пустом секция холодильной камеры.

Скорость воздуха над тушами будет намного выше из-за уменьшения в циркуляции воздуха. Повышенная скорость воздуха сокращает период охлаждения, но предел, так как существует порог, выше которого увеличивается потребление энергии вентилятором больше, чем скорость охлаждения, что приводит к увеличению эксплуатационных расходов.Кроме того, чем выше скорость воздуха, тем больше потеря веса.

Относительная влажность во время операции охлаждения должна поддерживаться достаточно высокой. для предотвращения чрезмерной потери веса. Рекомендуемая скорость от 90 до 95 процентов, хотя это самый сложный фактор.

Первичное охлаждение завершено, когда самая теплая точка туши остыла. достигала температуры около 7 ° C (3 ° C для пищевых субпродуктов). С нынешним технологии эти температуры могут быть достигнуты за 16–24 часа в небольших туши и менее чем через 48 часов в крупных тушах (центр задней ноги).Средняя температура и температура поверхности, очевидно, намного ниже, достигая 0 ° C. на поверхности в течение четырех часов; это важно для замедления микробного распространение.

У быстрого охлаждения есть свои проблемы, наиболее распространенным является холодное шортенинг. Холодное масло часто можно увидеть в говядине и баранине, когда мясо еще в фазе, предшествующей окоченению, достигает температуры 10 ° C или ниже. Эти условия вызывают необратимые сокращения мышечной ткани, которые сделать мясо жестким даже после длительного созревания.

Быстрое первичное охлаждение также означает увеличение инвестиций и более высокую эксплуатационные расходы. Период охлаждения можно сократить, уменьшив подачу воздуха. температура (опасность замерзания поверхности) или увеличение скорости воздуха (более высокая эксплуатационные расходы) или и то, и другое. Иногда холодильные камеры охлаждаются в заранее, чтобы достичь более низких температур, чем при эксплуатации (-5 ° C / -6 ° C для говядина; -10 ° C / -12 ° C для свинины), используя преимущество тепловой инерции для компенсации эффект теплых мясных нагрузок.

Быстрое первичное охлаждение может выполняться в небольших камерах или при охлаждении. туннели. В холодильных камерах это осуществляется в два-три этапа. В течение на первом этапе температура воздуха поддерживается на уровне около 0 ° C, осторожно контроль риска поверхностного замерзания при сохранении движения воздуха на высоком уровне. Для крупных туш через 10–12 часов циркуляция воздуха внутри магазина снижается, поддерживая температуру и влажность условия; эта вторая фаза длится еще 6-10 часов.По истечении этого периода мясо отправляется в холодильные камеры, где туша температура стабилизируется, завершается третья фаза.

Небольшие холодильные камеры, используемые для охлаждения, должны быть спроектированы таким образом, чтобы их вместимость могут быть заполнены за два часа при нормальном режиме работы бойни. В количество камер должно быть достаточным для максимального рабочего дня. Особенно следует позаботиться о том, чтобы за этими уже охлажденный или в процессе охлаждения, так что воздух, который еще холод, достигает их, и нет риска поверхностной конденсации.

Охлаждающие туннели, используемые для охлаждения мяса, обычно бывают непрерывного типа. Здесь снова мясо подвергается двухфазному процессу с аналогичными условиями. в холодную камеру. Однако температура может достигать -5 ° C в течение короткое время. Туши говядины могут достигать средней температуры около 15 ° C. за четыре часа, в то время как свинина и баранина достигают одинаковой температуры в два-два с половиной часа. Температура поверхности снижается до 4–5 ° C. В течение второй этап, условия менее строгие, и средняя температура около 4 ° C стабилизируется через 15–16 часов во вторичном охлаждении. камера.Этот метод используется, в частности, на бойнях с высокой производительностью. для туш свиней; для говядины и баранины рекомендуется более медленное охлаждение из-за опасности холодного шортенинга.

Хранимое охлажденное мясо в основном предназначено для использования в качестве буферного запаса между производство и отгрузка и / или потребление. При хранении старение (созревание) мяса также происходит, постепенно увеличивая нежность и развитие вкуса за счет протеолитической активности мясных ферментов.Старение зависит от температуры и может быть ускорена путем ее увеличения, но для по гигиеническим причинам рекомендуется использовать температуру 4 ° C с относительной влажность 85–95 процентов. В этих условиях старение происходит за несколько часов для птицы, два-четыре дня для свинины, четыре дня для баранины и два недели для говядины. Таким образом, его можно рассматривать только как дополнительное лечение. для двух последних продуктов.

При длительном хранении охлажденного мяса более низкая температура без следует использовать риск замерзания; обычно 0 ° C — разумный выбор, хотя (как показано в Таблице 1) условия различаются в зависимости от типа мяса.

В мясных цехах используется температура около 4 ° C (для окончательной выдержки, к сложности поддержания более низких температур, поскольку холодильные камеры маленькие). Относительная влажность составляет от 80 до 90 процентов, что является компромисс между потерей веса и развитием микробов; 80 процентов это обычно используется для туш и четвертин, и 85–90 процентов для мелкого мяса порезы.

Для хранения пищевых субпродуктов требуются другие условия: -1 ° C скорее чем 0 ° C и относительной влажности, близкой к насыщению, чтобы избежать попадания на поверхность пятна.Органы, предназначенные для терапевтических целей, например щитовидная железа, поджелудочную железу, яичники, гипофиз и т. д. необходимо немедленно заморозить, чтобы сохранить свои активные принципы.

В таблице 1 указано максимальное время хранения, в течение которого продукты могут храниться. сохранность и сохранение товарного качества при последующем маркетинге период, даже если он непродолжительный и в благоприятных климатических условиях.

Однако есть потери и некоторая потеря качества и питательной ценности. при хранении мясной тушки в течение всего периода, указанного в таблице 1.Это поэтому рекомендуется, чтобы время хранения не превышало намного период созревания, необходимый для различных видов мяса.

Циркуляция воздуха внутри промышленных камер должна быть 20–35 раз в час объем пустой холодильной камеры. Когда камеры используется для хранения субпродуктов, рекомендуется использовать естественную циркуляцию воздуха для поддержания высокий уровень влажности.

Туши следует подвешивать на рельсах таким образом, чтобы они были выровнены по направление циркуляции воздуха, избегая контакта друг с другом (см. рисунки 1 и 2).

Каждый раз, когда новый продукт имеет температуру, отличную от температуры в магазине помещается в магазин, товар должен быть распределен по комнате, а не чем сосредоточено в одном месте.

Во многих странах недостаточная холодильная цепь и недостаточное хранение в холодильнике емкость иногда заставляет хранить разные продукты в одном и том же комната. Эти продукты могут быть несовместимы, поскольку для них требуются разные температуры хранения, или они представляют некоторый риск заражения из-за передача ароматов от одного к другому.Первый тип риска — не проблема с продуктами животного происхождения, поскольку они достаточно хорошо хранятся в аналогичных температурные условия (очевидно, здесь имеется в виду только охлажденное место хранения). Тем не менее, самая низкая рекомендуемая температура без риска всегда следует использовать поверхностное замораживание.

При хранении мяса или других продуктов животного происхождения с пахучие фрукты, такие как апельсины или яблоки, и риск более серьезный, когда они смешанное хранение с картофелем.Однако хранить мясо с овощи, поэтому меры предосторожности необходимы в основном при хранении смешанных животных продукты. Существует некоторая опасность перекрестного действия говядины и бекона; сыр будет портить говядину, баранину и свинину.

Защищать от загрязнения необходимо не только при смешанном хранении, но и при использовании холодильной камеры, в которой ранее хранились продукты с сильный окрашивающий потенциал. Камеры должны быть тщательно очищены перед любым другой продукт хранится.

Как старение мяса при хранении в холодильнике, например, когда мясники хранят их запасы при температуре 4 ° C и относительной влажности 85–95%, прочие дополнительные процедуры также используются для продления срока хранения, поддержание качества и снижение риска микробной порчи.

Модифицированная атмосфера — один из методов лечения, используемых в настоящее время для животных. продукты, но не в такой степени, как фрукты и овощи. Этот технология использует газовую атмосферу, которая отличается от нормальный (т.е. 21 процент O ₂ , 79 процентов N ₂ и незначительное содержание других газы).

Более распространенной дополнительной обработкой для хранения мяса является вакуумная упаковка мясных отрубов без костей. Особый чрезвычайно герметичный (кислородонепроницаемые) синтетические пленки, которые можно термосваривать. после удаления воздуха вокруг упакованного мясного отруба, таким образом сохраняя его практически вне контакта с окружающей атмосферой. Предоставлена соблюдаются гигиенические методы убоя и разделки, срок годности мяса упакованы таким образом и хранятся при 0 ° / -1 ° C, могут быть значительно расширены (до до восьми недель для говядины, четырех недель для баранины и двух-трех недель для свинина), что важно для экспорта охлажденного бескостного мяса из мясоперерабатывающих предприятий. страны.Этот вид упаковки широко используется при отправке грузов. сушеной говядины и баранины.

В особых случаях радиация используется в качестве дополнительного лечения для продления срок годности охлажденных мясных туш. Однако это лечение подлежит в соответствии с национальным законодательством о пищевых продуктах и ​​не допускается во многих странах.

Ультрафиолетовый свет (200–320 нм) также используется для уменьшения поверхностного микробного загрязнения. загрязнение мяса и мясных продуктов. Поскольку разрезы имеют неправильную форму добиться такой же интенсивности излучения довольно сложно, поэтому это нормально процедура облучения наиболее загрязненных зон.Интенсивность излучения вырабатываемой УФ-лампой мощностью 30 Вт хватает на каждые 10–12 м ² площади на бойне или в холодильной камере.

РИСУНОК 1
Высота подвески и расстояние между полутушами на крюках

РИСУНОК 2
Высота подвеса и расстояние между четвертями

Ионизирующее излучение является многообещающим дополнительным средством лечения охлажденных консервирование мяса.Низких доз радиации достаточно, чтобы уменьшить количество микробов. загрязнение и лучшие перспективы для упакованного мяса, которое не может быть повторно загрязненным. Ионизирующее излучение также можно использовать для разрушения trichinae ( Trichinella spiralis ) в свинине.

Замораживание обычно ограничивается мясом, которое используется в качестве буферного запаса, часто предназначены для экспорта или хранения с целью дальнейшей обработки.

Когда срок хранения превышает допустимый для охлажденных мясо, замораживание должно использоваться, чтобы свести к минимуму любые физические, биохимические и микробиологические изменения, влияющие на качество при хранении.Во время замораживания большинство 80 процентов воды, содержащейся в мясе, превращается в чистый лед. кристаллы, сопровождающиеся отделением растворенных твердых частиц.

Продукт можно считать замороженным, если его центр имеет температуру -12 ° C или меньше. Для достижения этой температуры продукт проходит через температурный диапазон максимальной кристаллизации (от -1 ° до -5 ° С). Скорость замораживания является очень важным фактором, так как качество замороженного мяса в основном зависит от размера образовавшегося ледяного кристалла: чем меньше скорость замораживания, тем больше размер кристаллов.

Медленное замораживание облегчает отделение раствора и миграцию вода из мышечных клеток, которая впоследствии замораживается, образуя довольно крупные кристаллы. И наоборот, при быстром замораживании образуется множество мелких кристаллов льда. в основном образуется в мышечных клетках, снижает миграцию воды и разделение раствора. Очевидно, что последняя технология сохранит мясо приближается к исходному качеству и, особенно при оттаивании, потеря влаги обычно будет ниже.

Международный институт холода (IIR) заявляет о замораживании скорость как скорость, с которой температурный фронт движется через тело продукта (см / ч). Хорошие результаты достигаются при скорости от От 2 до 5 см / ч. Медленное замерзание считается ниже 1 см / ч, а быстрое замерзание выше 5 см / ч.

Мясо можно обработать перед замораживанием, обычно его охлаждают до охлажденное состояние. Разрезание на четвертинки обычное дело, особенно для больших животных, и жир удаляется с некоторых частей, потому что, хотя он предотвращает поверхностное высыхание снижает скорость теплопередачи и подвержено повреждение при хранении в замороженном состоянии.

Соотношение между толщиной и скоростью замораживания способствует резке и обвалку перед замораживанием, как нежирное мясо, упакованное в картон коробки или разрезать на отдельные порции. У этого есть много преимуществ:

• замораживаемая масса уменьшена на 30 и более процентов;
• плотность хранения увеличена на 100 процентов;
• погрузочно-разгрузочных работ стали проще;
• обвалка после оттаивания, вызывающая гигиенические и экссудативные проблемы, избегается.

Заморозка производится в туннелях или камерах с интенсивным воздухом. циркуляцию называют взрывными камерами. Температура воздуха должна быть в пределах от -30 ° до -35 ° С; иногда используется -40 ° C. Воздух циркулирует с высокой скоростью, от 2 до 4 м / с и до 6 м / с. Коэффициент циркуляции воздуха 150–300 используется внутри морозильных камер. Относительная влажность поддерживается на уровне 95 процентов или выше.

В этих условиях полутуши или четвертины говядины замораживаются примерно в 16– 20 часов, разделанное мясо в картонных коробках размером 54 × 34 × 16 см в около четырех часов и небольшие предварительно упакованные нарезки примерно за час.

Небольшие ящики и нарезки, особенно для субпродуктов, иногда замораживают в морозильники с поверхностным контактом (пластинчатые морозильные камеры): продукт зажимается между двумя металлические пластины, охлаждаемые хладагентом прямого расширения. Для изделий 3–5 см густой, время замораживания составляет всего два-три часа.

После замораживания туши и четвертины должны быть защищены полиэтиленовой пленкой, обычно под сукно или джутовую ткань. Кусочки мяса покрывают полиэтиленовой пленкой, или в вакуумной упаковке в полиэтиленовые пакеты; они помещены в картонные коробки и обычно в них замораживаются.

При расфасовке мясных нарезок без вакуума воздушные карманы должны быть избегали. В верхней части коробки должно быть оставлено 2 см пространства, чтобы можно было для расширения. Перед замораживанием следует удалить поверхностный жир, чтобы уменьшить развитие прогорклости при хранении.

ТАБЛИЦА 2. Практический срок хранения мяса и мясопродуктов

24

Жаркое, стейки, фасованные

905 90592 905 905

Продукты	Практический срок хранения в месяцах
	-18 ° C	-25 ° C	-30 ° C
Туша говяжья	12	18
12	18	24
Фарш фасованный (несоленый)	10	> 12	> 12	12	24
Жаркое, отбивные	9	10–12	12
Баранья туша	9 24514	12	9 24514	12	10	12	24
Свиная тушка	6	12	15
Жаркое, отбивные	6	12	15
Колбаса фарш	6	10
Бекон (зеленый, некопченный)43	617
Сало	9	12	12
Птица, курица и индейки, потрошеные,
9019 905
Жареный цыпленок	6	9	12
Субпродукты съедобные	4

Правильно замороженное мясо перемещается из морозильной камеры в камеры хранения. где температура, относительная влажность и циркуляция воздуха должны быть адекватными и их можно жестко контролировать.В частности, колебания температуры должны выдерживаться в очень узком временном интервале.

Поскольку существует определенная степень ухудшения качества даже при очень низком уровне температуры, срок хранения ограничен. Обычные температуры находятся в диапазоне от -18 ° до -25 ° C при сроках хранения один год и более. Тем не мение, каждый вид мяса требует определенных условий. В таблице 2 приведены некоторые приблизительные данные относительно них. Чем выше относительная влажность, тем лучше: диапазон 95–98 процентов предотвращает обезвоживание мяса.

Для замороженного мяса и других продуктов животного происхождения несовместимость хранения низкий. Уровень температуры, необходимый в камере, одинаков для всех, и заражение незначительно из-за низкой температуры и того факта, что большая часть продуктов находится в надлежащей защитной упаковке.

Основная проблема при хранении в замороженном состоянии — ухудшение органолептических свойств. качественный. Могут быть изменения текстуры мяса, жир может стать зернистым и рассыпаться, а также может наблюдаться обесцвечивание мяса.Толстый модификация, вызванная кислородом воздуха, вызывает прогорклость и кислотность, а неприятный вкус. Микробные ферменты также остаются активными, особенно те, что которые атакуют жир.

Как и при хранении с охлаждением, также возможны потери веса из-за испарения. Это можно рассматривать как ожог от замораживания, то есть поверхностные иссушенные участки, которые могут встречаются даже в упакованном мясе, когда упаковочная пленка неплотная и температура внутри камеры колеблется. Похудение, которое можно от 1 до 4 процентов в неупакованном мясе, способствует органолептике ухудшение.Поверхность мяса становится сухой и пористой, что обнадеживает. прогорклость и передача ароматов. Кроме того, площадь сублимации поверхности замороженного мяса очень большие: 12 м ² / т для говяжьих четвертин, 11 м ² / т для свинины и 20 м ² / т баранины.

PSL — срок хранения с момента заморозки до тех пор, пока продукт сохраняет свои органолептические и питательные свойства и подходит для употребление в пищу или для дальнейшей обработки.

PSL полагается на высококачественное сырье, надлежащую производственную практику, включая гигиену и использование умеренно постоянной температуры. PSL поэтому явно зависит от факторов ППС — продукта, переработки и упаковка.

Обработка относится в основном к предварительной обработке и замораживанию. операция. Убой, разделка туш, предварительное охлаждение, разделка и обвалка, и расфасовка мелких кусков должны проводиться гигиенически и квалифицированным трудом.

Помимо личной гигиены, чистки и дезинфекции программы на бойнях, холодильных установках и разделочных цехах, особое внимание следует уделять разделке, обвалке и упаковке, сведение к минимуму загрязнения мяса. Туши должны предпочтительно резать в подвешенном состоянии или на регулярно очищаемых поверхностях с помощью инструментов часто стерилизуется во время работы, а мясо хранится в чистом контейнеры. Упаковочный материал должен быть хорошего качества и чистым.

Упаковка предназначена для предохранения продукции от микробного загрязнения, от обезвоживания и факторов окружающей среды, влияющих на качество и питание. Используемые материалы, помимо того, что они предназначены специально для пищевых продуктов, должны быть химически инертным и предотвращать передачу посторонних запахов или привкусов. Они должны быть устойчивыми при низких и высоких температурах, эластичными, прочными и прочными. защита от водяного пара, кислорода и летучих веществ. Они должны предложить защита от света, особенно УФ-излучения.Более того, они должны быть адаптируется к различным системам автоматической упаковки подходящего размера и форма для удобного хранения и распространения, и готовы к открытию.

Пластиковые пленки и бумага и картон, облицованный полиэтиленовой пленкой, часто использовал. Для специальной упаковки можно комбинировать разные пластиковые пленки, чтобы Преимущество основных свойств каждого. Пластмассы, представляющие интерес к мясу промышленность для холодильного хранения:

• полиамид (PA)
• полиэтилен (ПЭ)
• полиэстер (сложный эфир политерефталевой кислоты) (ПЭТ / ПЭТФ)
• поливинилхлорид (ПВХ)
• поливинилиденхлорид (ПВДХ).

Ежедневная потеря качества при хранении замороженного мяса является кумулятивной, т. Е. полная потеря качества из-за замораживания, хранения, транспортировки и распределения можно рассчитать, сложив потери на каждом этапе процесса. В устойчивость продукта к фиксированной температуре и времени хранения может быть определяется и выражается в цифрах. Рисунки или графики, представляющие практический срок хранения в различных условиях может быть установлен со временем исследования толерантности и толерантности (TTT).Их запускают не менее трех температуры, близкие к тем, которые обычно используются для хранения тестируемого продукта. (Например, -18 °, -25 ° и -30 ° C) и показать зависимость качества от времени и температуры. условия.

Поскольку колебания температуры сильно влияют на конечное качество замороженный продукт, необходимо знать его историю охлаждения. Это вместе с ТТТ характеристики продукта позволят остаточное время хранения быть рассчитанным.

Следует организовать ротацию запасов по всей холодовой цепи. в соответствии с правилом «первым пришел — первым ушел» (FIFO): первые партии, подлежащие хранению, первым будет выгружен.

Размораживание — еще одна важная фаза процесса замораживания, поскольку она включает переход от кристаллов льда к талой воде, которая реабсорбируется, и микробная реактивация.

Если замороженный продукт нагревается, его поверхность становится достаточно теплой. для передачи тепла внутрь и создания температурных и влажность, подходящая для развития микробов.Низкотемпературное оттаивание, ниже 5 ° C, снижает риск роста микробов и производит медленное скорость оттаивания, обеспечивающая эффективное реабсорбцию талой воды.

Рекомендуется размораживать туши при температуре от 4 ° до 6 ° C в подвешенном состоянии. положение и без какого-либо покрытия (снимается пластик или джут), внутри холодно камера с достаточно низким уровнем циркуляции воздуха — около 0,2 м / с. Относительная влажность вначале должна быть низкой (70 процентов), чтобы избежать образование инея на поверхности мяса с увеличением в конце оттаивания период до 90–95 процентов.В этих условиях оттаивание тушек говядины длится от четырех до пяти дней, а для более мелких туш — от одного до трех дней. Это должны размещаться в установках, специально предназначенных для этой цели.

Субпродукты не особо подвержены способу оттаивания, но желательно следовать тому же методу.

Размораживание считается завершенным, когда температура мяса составляет около От 0 ° до -1 ° C.

При дальнейшей переработке замороженного мяса в некоторых случаях его можно использовать. прямо в замороженном состоянии.Потребитель может начать готовить с малого фасованные отрубы без предварительного размораживания.

Новые системы быстрого размораживания, отвечающие гигиеническим требованиям. используется в мясной промышленности. Туннели быстрого размораживания туш, микроволновые печи и туннели, а также вакуумные паровые автоклавы некоторые из новинок. Размороженное мясо быстро портится, и его необходимо хранить. примерно при 0 ° C и употребить как можно скорее.

Очевидно, плохо проведенная операция замораживания и / или хранения в замороженном состоянии период (который включает транспортировку и распространение) при нерегулярном хранении условия вызовут нарушения в мясе, которые немедленно становятся проявляется после оттаивания.Экссудация указывает на гистологическое повреждение льдом кристаллы; другие нежелательные изменения уже упоминались.

---

Ячейки для замораживания и размораживания в лаборатории: 8 советов и рекомендаций

Криоконсервация имеет решающее значение для длительного обслуживания клеток в лаборатории, поэтому важно, чтобы вы знали о процессе замораживания и оттаивания клеток.

Ни один даже самый прилежный и преданный своему делу ученый не способен поддерживать линию клеток изо дня в день в течение многих лет.

Кроме того, клетки могут претерпевать генетические изменения, стареть или, ooops (!), Становиться контаминированными по мере увеличения продолжительности культивирования. Замораживание может защитить клетки от этих процессов.

Замораживание и оттаивание клеток можно легко осуществить с помощью всего лишь нескольких реагентов, а хранение клеток в жидкости N ₂ обеспечит надежный источник клеток на протяжении всей карьеры.

Здесь мы познакомим вас с особенностями замораживания и оттаивания ячеек.

Ячейки для замораживания и оттаивания

Как заморозить клетки

Необходимые специальные материалы:

• культивируемых клеток
• среда для роста клеток
• растворов для отделения клеток от планшета при использовании прикрепленных клеток (например,грамм. сбалансированный солевой раствор, трипсин / ЭДТА)
• Диметилсульфоксид (ДМСО) степени чистоты для культуры ткани
• плодная телячья сыворотка (ФБС)
• криопробирки
• камера замораживания ячеек
• Морозильная камера –80 ° C
• жидкость N ₂ емкость для длительного хранения.

1. Пассажирские клетки

Здоровые, активно растущие клетки следует использовать для криоконсервации. Я всегда стараюсь заморозить большое количество клеток, которые не подвергались пересеву в культуру слишком много раз.

Я пасую клетки за 1-2 дня до замораживания, чтобы убедиться, что они находятся в логарифмической фазе роста во время замораживания.

Некоторые лаборатории рекомендуют менять питательную среду за 24 часа до замораживания, если в это время клетки еще не пассировали.

2. Подготовка ячеек

Удалите клетки из чашек, следуя обычному методу пассирования прилипших или суспензионных клеток. Объедините все ячейки и центрифуги.

3. Ресуспендируйте клетки в замораживающей среде и поместите аликвоты в криопробирки

Замораживание клеток может быть смертельным.Чтобы избежать повреждения, которое может быть вызвано, например, образованием кристаллов льда, осмотическим стрессом или повреждением мембраны, используется криопротектор для понижения точки замерзания клеток.

ДМСО в виде 10% основного раствора является наиболее часто используемым криопротектором.

Осторожно: при работе с ДМСО надевайте перчатки, так как он легко проникает через кожу.

Наиболее распространенная среда для замораживания — 90% FBS / 10% DMSO. Для менее привередливых клеток и для культурной ткани с ограниченным бюджетом также можно использовать 10% ДМСО в среде для роста клеток.

После центрифугирования ресуспендируйте осадок клеток в 1 мл замораживающей среды на криопробирку.

Убедитесь, что у вас есть криопробирки, предназначенные для хранения жидкостей N ₂ . Я обычно планирую на 1 чашку клеток 100 мм на криопробирку. Флаконы должны быть маркированы лабораторным маркером, устойчивым к воздействию алкоголя и жидкости N ₂ .

Будьте осторожны, указывая номера проходов / партий при маркировке криопробирок.

4. Морозильные камеры

Чтобы вода могла выйти из клеток перед замораживанием, замораживайте клетки медленно.Это достигается с помощью камеры замораживания клеток. Дорогие морозильные камеры периодически подают в жидкость N ₂ для контроля скорости замораживания.

Менее дорогие варианты включают камеры, в которых используется изопропанол комнатной температуры. В камеру помещают флаконы, добавляют изопропанол и камеры помещают при –80 ° C как минимум на 4 часа.

Те из нас, у кого ограниченный бюджет (как я!), Используют самодельные камеры. Я сохраняю штативы из пенополистирола, которые поставляются с конусами на 15 мл, помещаю криопробирки в каждое отверстие, накрываю второй штативом, склеиваю штативы и устанавливаю при –80 ° C.

5. Не забывайте перемещать клетки в жидкость N

₂ Бак

Вероятно, одна из самых сложных вещей в этом протоколе — это не забыть переместить замороженные криопробирки в резервуар с жидкостью N ₂ ! Я обычно даю своим клеткам замерзнуть на ночь, а затем быстро помещаю криопробирки в емкость с жидкостью N ₂ .

Как разморозить клетки

Необходимые специальные материалы:

1. Извлеките клетки из резервуара и разморозьте

Для максимальной жизнеспособности клеток важно медленно замораживать клетки.Обратное верно для оттаивания — оттаять быстро! Извлеките криопробирки из резервуара с жидкостью N ₂ и немедленно поместите их в водяную баню с температурой 37 ° C.

Держите криопробирки на водяной бане до тех пор, пока в криопробирке не останется мельчайший кристалл льда.

2. Перенос, отжим (?) И пластина

Немедленно перенесите клетки в большой объем предварительно подогретой среды для роста клеток (аликвота клеток ~ 10 мл / 1 мл). Для следующего шага вам нужно принять решение.

Существует две точки зрения о том, следует ли немедленно удалять криопротектор из клеток:

1. В некоторых лабораториях клетки центрифугируют, а осадок клеток ресуспендируют в свежей среде для роста клеток перед помещением клеток в чашку для культивирования.Так я впервые научился оттаивать клетки.
2. Однако некоторые данные предполагают, что клетки становятся чрезвычайно хрупкими после оттаивания и что центрифугирование может увеличить гибель клеток. Поэтому рекомендуется высеять клетки и заменить питательную среду позже.

Для прикрепившихся клеток вы можете изменить среду, как только клетки прикрепятся к чашке.

Я перешел на этот метод и теперь обычно беру свои клетки перед тем, как покинуть лабораторию на ночь, а на следующее утро первым делом меняю среду.

3. Проверьте свои клетки

Примерно через 24 часа после оттаивания я внимательно изучаю свои клетки под микроскопом, чтобы убедиться, что они здоровы и ведут себя нормально.

Сводка

Эффективное замораживание и размораживание клеток избавит вас от смущения, связанного с запросом у коллеги еще одной аликвоты их клеток, или от затрат на покупку новых клеток.

И если ничего не помогает, не забудьте медленно заморозить и быстро оттаять! Подробнее о криоконсервации читайте в нашей статье о сохранении микроорганизмов.Дайте нам знать о ваших главных советах по замораживанию и оттаиванию ячеек!

Первоначально опубликовано 3 апреля 2013 г. Проверено и обновлено в мае 2021 г.

Вам это помогло? Тогда поделитесь, пожалуйста, со своей сетью.

морозильных камер | Thermo Fisher Scientific

Клеточные линии в непрерывном культивировании могут страдать от нежелательных последствий, таких как генетический дрейф, старение и микробное загрязнение, и даже в самых хорошо функционирующих лабораториях может возникнуть сбой оборудования.Установленная клеточная линия является ценным ресурсом, а ее замена требует больших затрат времени и средств. Поэтому жизненно важно, чтобы они были заморожены и сохранены для длительного хранения. Правильно поддерживаемый замороженный фонд клеток — важная часть клеточной культуры.

Как только небольшой избыток клеток становится доступным в результате субкультивирования, лучший метод консервирования — хранить их в замороженном виде, как исходный материал , защищать и не предоставлять для общего лабораторного использования. Рабочие запасы можно приготовить и пополнить из замороженных семенных запасов. Если запасы семян истощаются, криоконсервированные рабочие запасы могут затем служить источником для подготовки свежего семенного материала с минимальным увеличением числа поколений после первоначального замораживания.

Общий метод замораживания одинаков для прикрепленных и суспензионных клеток, за исключением того, что прикрепленные клетки необходимо удалить из планшетов для культивирования перед началом процедуры замораживания. Лучший метод криоконсервации культивируемых клеток — это их хранение в жидком азоте в полной среде в присутствии криозащитного агента, такого как диметилсульфоксид (ДМСО).Криозащитные агенты снижают точку замерзания среды и позволяют снизить скорость охлаждения, что значительно снижает риск образования кристаллов льда, которые могут повредить клетки и вызвать их гибель.

Примечание: Раствор ДМСО, как известно, способствует процессу проникновения органических молекул в ткани. Обращайтесь с реагентами, содержащими ДМСО, используя оборудование и методы, соответствующие опасностям, создаваемым такими материалами. Утилизируйте реагенты в соответствии с местными правилами.

Замораживающая среда
Всегда используйте рекомендованную замораживающую среду для криоконсервации ваших клеток. Среда для замораживания должна содержать криозащитный агент, такой как ДМСО или глицерин. Вы также можете использовать специально разработанную полную среду для криоконсервации, такую ​​как среда для замораживания культуры клеток Gibco Recovery или среда для криоконсервации Gibco Synth-a-Freeze.

• Среда для замораживания восстановленных культур клеток — это готовая к использованию полная среда для криоконсервации культур клеток млекопитающих, содержащая оптимизированное соотношение фетальной бычьей сыворотки к бычьей сыворотке для повышения жизнеспособности клеток и восстановления клеток после оттаивания.
• Среда для криоконсервации Synth-a-Freeze представляет собой стерильную среду для криоконсервации, не содержащую белков, химически определенную, содержащую 10% ДМСО, которая подходит для криоконсервации многих типов стволовых и первичных клеток, за исключением меланоцитов.

• Сосуды для культивирования, содержащие культивируемые клетки в логарифмической фазе роста
• Полная питательная среда
• Криозащитный агент, такой как ДМСО (используйте бутылку, отведенную для культивирования клеток; открывайте только в вытяжном шкафу с ламинарным потоком) или среду для замораживания, такую ​​как в качестве среды для криоконсервации Synth-a-Freeze или среды для замораживания восстановленных культур клеток
• Одноразовые стерильные конические пробирки на 15 или 50 мл
• Реагенты и оборудование для определения количества жизнеспособных и общих клеток (например,g., автоматический счетчик клеток Invitrogen Countess II FL или гемоцитометр, счетчик клеток и трипановый синий)
• Стерильные криогенные флаконы для хранения (т.е. криопробирки)
• Устройство для замораживания с контролируемой скоростью или камера изопропанола
• Контейнер для хранения жидкого азота

Для замораживания прикрепленных клеток, помимо вышеуказанных материалов, вам потребуются:

• Сбалансированный солевой раствор, такой как фосфатно-солевой буфер Гибко Дульбекко (DPBS), не содержащий кальция, магния или фенолового красного. как трипсин или Gibco TrypLE Express, без фенолового красного

141,15400054,150,12604013,15250061, AMQAF1000, AMQAX1000,12648010, R00550

В следующем протоколе описана общая процедура для криоконсервирования культивируемых клеток. Для получения подробных протоколов всегда обращайтесь к вкладышу продукта для конкретных ячеек.

1. Приготовьте замораживающую среду и храните при температуре от 2 ° до 8 ° C до использования. Обратите внимание, что подходящая среда для замораживания зависит от линии клеток.
2. Для прикрепившихся клеток осторожно отделите клетки от сосуда для тканевой культуры, следуя процедуре, используемой во время субкультивирования. Ресуспендируйте клетки в полной среде, необходимой для этого типа клеток.
3. Определите общее количество клеток и процент жизнеспособности с помощью гемоцитометра, счетчика клеток и исключения трипанового синего или автоматического счетчика клеток Countess.В соответствии с желаемой плотностью жизнеспособных клеток рассчитайте необходимый объем замораживающей среды.

4. Центрифугируйте суспензию клеток приблизительно при 100–200 × g в течение 5–10 минут. Слейте супернатант в асептических условиях, не нарушая клеточный осадок.

   Примечание: Скорость и продолжительность центрифугирования зависят от типа ячейки.

5. Ресуспендируйте осадок клеток в холодной замораживающей среде до рекомендуемой плотности жизнеспособных клеток для конкретного типа клеток.
6. Распределите аликвоты клеточной суспензии в криогенные флаконы для хранения. По мере того, как вы их аликвотируете, часто и осторожно перемешивайте клетки для поддержания гомогенной клеточной суспензии.
7. Заморозьте клетки в аппарате замораживания с контролируемой скоростью, снижая температуру примерно на 1 ° C в минуту. В качестве альтернативы поместите криопробирки с клетками в камеру изопропанола и храните их при –80 ° C в течение ночи.
8. Перенести замороженные клетки в жидкий азот и хранить их в газовой фазе над жидким азотом.

Следование приведенным ниже рекомендациям необходимо для криоконсервации ваших клеточных линий для будущего использования. Как и в случае с другими процедурами культивирования клеток, мы рекомендуем строго следовать инструкциям, прилагаемым к вашей клеточной линии, для достижения наилучших результатов.

• Заморозьте образцы культивируемых клеток до высокой концентрации и при как можно меньшем количестве пассажей. Перед замораживанием убедитесь, что жизнеспособность клеток составляет не менее 90%. Обратите внимание, что оптимальные условия замораживания зависят от используемой клеточной линии.
• Замораживайте клетки медленно, снижая температуру примерно на 1 ° C в минуту, используя крио-морозильник с контролируемой скоростью или контейнер для криогенного замораживания, такой как «Mr. Frosty », доступный от Thermo Scientific Nalgene labware (Nalge Nunc).
• Всегда используйте рекомендованную замораживающую среду. Среда для замораживания должна содержать криозащитный агент, такой как ДМСО или глицерин (см. What is Subculture? ).
• Образцы клеток следует хранить в парообразном жидком азоте при температуре ниже –135 ° C.
• Всегда используйте стерильные криопробирки для хранения замороженных клеток. Криопробирки, содержащие замороженные клетки, можно хранить погруженными в жидкий азот или в газовой фазе над жидким азотом (см. Примечание по безопасности ниже).
• Всегда используйте средства индивидуальной защиты.
• Все растворы и оборудование, контактирующие с клетками, должны быть стерильными. Всегда используйте надлежащую стерильную технику и работайте в вытяжном шкафу с ламинарным потоком.

Примечание по безопасности: Биологически опасные материалы должны храниться в газовой фазе над жидким азотом.Хранение закрытых криопробирок в газовой фазе исключает риск взрыва. Если вы используете жидкофазное хранилище, помните об опасности взрыва как стеклянных, так и пластиковых криопробирок и всегда надевайте защитную маску или очки.

Защита от замерзания для систем трубопроводов природного газа и измерительных приборов — WELKER

Введение

Отсутствие поставки природного газа по запросу может нанести непоправимый ущерб корпоративному имиджу компании в 21 ^-м -м веке.Стабильная и непрерывная работа трубопроводов является ключевыми и критическими факторами в современной газопроводной отрасли. Конкурентный характер бизнеса, а также строгие правила и нормы поставок природного газа обязывают компании соблюдать все операционные параметры, которые могут привести к перебоям или полному прекращению подачи природного газа потребителям. Выявление того, что в конечном итоге может вызвать проблемы, является первым шагом к контролю и устранению этих проблем для поставщика.

Естественное явление замерзания — обычное явление при эксплуатации системы трубопроводов природного газа. Независимо от того, является ли газ «добытым газом» из нефтяной скважины или «природным газом» из газовой скважины, возможность образования гидратов и связанных с этим проблем реальна. Замораживание — потенциальная и серьезная проблема, начиная с устья добывающей скважины до последней точки в системе доставки потребителю. Возникновение замерзания постоянно снижается на каждом этапе пути, но на каждом этапе необходимо проявлять осторожность, чтобы обеспечить бесперебойные рабочие условия и удовлетворение потребностей потребителей в конце линии.

Замерзание не только влияет на сам трубопровод, но также вносит значительный вклад в погрешности измерений и отказы или отказы оборудования. Все эти потенциальные проблемы в конечном итоге повлияют на работу трубопровода в целом и могут существенно повлиять на прибыльность вашей компании. Относительно небольшие затраты на профилактику принесут большие дивиденды от успешного и бесперебойного снабжения природным газом.

Каждая ситуация отличается от места к месту.По этой причине существует несколько методов борьбы с замерзанием во всем спектре газовой промышленности.

Проблема

При поиске потенциальных проблем с замерзанием оператор должен знать качество газа, состав газа, конструкцию трубопроводов, точки регулирования или ограничения, точки отбора инструментов и аналогичные особенности эксплуатации трубопровода, которые могут и будут влиять на возникновение замораживание.

Системы добычи и сбора обычно заполнены водяным паром, что увеличивает вероятность проблем с замерзанием.Линии электропередачи должны иметь меньшую вероятность замерзания, поскольку газ обычно проходит через очистные сооружения, а большая часть жидкостей удаляется. Типичный запас воды составляет 7 фунтов. за миллион Станд. Cu. Ft. (Примерно 1 галлон США), который считается относительно сухим газом. В пределах обычной местной распределительной компании (LDC) проблемы, связанные с замораживанием, ДОЛЖНЫ быть практически отсутствующими. Однако цена и спрос на природный газ также могут иметь решающее влияние на наличие жидкости в трубопроводе, как это было в 2001 и 2002 годах во многих регионах США.

Гидраты также могут образовывать «ледяные шары» при температурах значительно выше нуля. Кристаллизация гидратов может происходить с h3O и углеводородами при 60 ° F и вызывать повреждение или полное перекрытие потока в трубопроводе. Это природное явление не связано с «замораживанием», как мы его знаем, но с ним можно справиться так же, как и со стандартными проблемами замерзания.

При обсуждении замораживания следует помнить о нескольких моментах, которые обсуждаются в СПРАВОЧНИКЕ ГАЗОВОГО ИНЖЕНЕРА, раздел 4, глава 8, «Газовые гидраты и осушка газа».«Следует помнить о двух основных факторах:

.

• Газ с высоким уровнем БТЕ с большей вероятностью приведет к образованию гидратов и проблемам с замерзанием.
• Правило Джоуля-Томсона о влиянии температуры в результате понижения давления. Температура будет снижаться примерно на 7 градусов по Фаренгейту на каждые 100 фунтов на квадратный дюйм снижения давления.

На практике у вас может быть газ, протекающий по трубопроводу с температурой 60 градусов по Фаренгейту и 700 фунтов на квадратный дюйм и никаких признаков замерзания. Если вы пройдете через станцию ​​регулятора и снизите давление до 225 фунтов на квадратный дюйм, температура потока в точке регулирования упадет с 33 градусов по Фаренгейту примерно до 27 градусов по Фаренгейту.Если газовый поток насыщен водяным паром и конденсатом, вы быстро испытаете проблемы замерзания, которые мы обсуждаем. Газовый поток остался прежним, но условия изменились, и ваши проблемы начали влиять на вашу работу.

Присутствие льда или гидратов может не только перекрыть трубопровод, но и изменить измерения. Если на ободе диафрагмы образуется лед, измерение расхода будет ошибочным из-за уменьшения диаметра диафрагмы. Если в линиях подачи КИП образуется лед, контроллеры перестанут работать, что приведет к потере контроля над системой.Лед может заблокировать порты датчиков и другие важные показания приборов. Как только лед начнет таять, проблемы все равно будут.

При первоначальном запуске нового или холодного колодца датчики, тепловые колодцы, интрузивные инструменты и диафрагмы должны быть удалены из трубопровода. Большие шарики льда, движущиеся по трубопроводу, могут нанести физический ущерб самому трубопроводу и любому объекту, выступающему в трубопроводе, например, пробоотборным зондам, датчикам температуры, измерителям, диафрагмам и аналогичным интрузивным устройствам . После того, как текущий поток стабилизируется и температурные условия выше точки гидратации, эти элементы можно безопасно устанавливать.

Проще говоря, наличие льда или гидратов в системе трубопроводов природного газа не дает ожидаемой выгоды для деятельности вашей компании.

Решение

Чтобы устранить проблемы с замерзанием, возникающие в различных условиях эксплуатации, решения должны быть разработаны с учетом конкретных потребностей места, где существует проблема.Каждое решение может иметь определенные преимущества и недостатки для оператора. Единственным наиболее важным аспектом любой методологии является последовательная эксплуатация и обслуживание с выбранным подходом к проблеме замораживания.

Есть несколько вариантов предотвращения проблем с зависанием:

1. Удаление воды из газового потока дегидратацией гликоля

Одним из наиболее распространенных методов обезвоживания больших объемов газа является метод абсорбции или регенерации триэтиленгликоля.Газ проходит через гликоль внутри емкости, называемой контактором. Цель состоит в том, чтобы удалить воду (туман, пар или свободную воду) до точки, где точка росы водяного пара газа не будет достигнута при самом высоком давлении и самой низкой температуре трубопроводной системы. Чистый гликоль поступает в верхнюю часть контактора, где из емкости выходит самый сухой газ. Сухой газ не хочет выделять H ₂ O, поэтому наиболее агрессивное действие происходит с чистейшим гликолем и самым сухим газом.Насыщенный гликоль находится внизу, куда входит влажный газ, но он все еще вытягивает H ₂ O из потока насыщенного газа. Гликоль стекает через градирню, ударяясь о поддоны и допуская дополнительный контакт с газом. Идеальная рабочая температура градирни составляет от 80 ° F до 110 ° F.

Гликоль абсорбирует воду и затем обрабатывается путем подачи гликоля в регенератор и отгонки воды из гликоля. Восстановленный гликоль возвращается подрядчику, и процедура повторяется.Этот процесс может снизить точку росы до 60-70 градусов по Фаренгейту.

Более холодный климат часто требует наличия системы осушки в системе природного газа, но даже более теплый климат может потребовать централизованной дегидратации из-за давления, температуры и состава газа. Производитель может рассматривать три варианта обезвоживания.

1. Частичное обезвоживание на устье скважины и последующие дополнительные шаги для выполнения требований контракта.
2. Закачка химиката на устье скважины с последующим обезвоживанием в центральной точке подачи.
3. Полное и полное обезвоживание на каждой устье скважины.

Эта система представляет собой недорогую систему с непрерывной работой и минимальными потерями давления на агрегате, что позволяет сэкономить деньги в нескольких областях эксплуатации. К недостаткам можно отнести унос гликоля при скачках, загрязнение твердыми частицами и неэффективность при колебаниях расхода.

2. Удаление воды твердым поглощением

Очень эффективным методом удаления воды является метод сухого слоя или молекулярного сита.Газ проходит через большие башни твердых частиц, и молекулярное сито очень агрессивно поглощает воду. С помощью этого метода можно получить очень сухой газ в широком диапазоне расходов. В конце концов, сито насыщается, и его необходимо регенерировать. Поток должен быть переключен на вторую колонну, и горячий газ вводится в исходную установку, чтобы испарить воду и высушить сито.

Охлаждающий газ затем используется для охлаждения адсорбента, и градирня готова к повторному использованию. Этот цикл повторяется до тех пор, пока влагопоглотитель не выродится и не перестанет действовать.Хотя этот метод дает очень сухой газ и имеет несколько положительных рабочих характеристик, он более дорогостоящий, чем обычные гликолевые системы, и более сложен в эксплуатации.

3. Впрыск метанола для предотвращения замерзания

Впрыск метанола (раствор незамерзающего типа) является очень распространенной практикой для защиты от замерзания в небольших системах и в определенных местах. Метанол впрыскивается в газовый поток насосами для закачки химреагентов или поступает в трубопровод по каплям метанола и эффективно снижает точку замерзания газа.Требуемые количества метанола можно рассчитать с помощью таблиц, доступных для конкретных приложений.

Также может быть изготовлена ​​метанольная колонна небольшого объема, позволяющая небольшим объемам газа проходить через метанол для обработки. Из-за чувствительности многих пневматических контроллеров этот метод иногда используется для предотвращения замерзания этих устройств и предотвращения миграции жидкости в небольшие отверстия и проходы. Дополнительный фильтр часто используется для предотвращения попадания метанола в приборы.

4. Применение тепла для защиты от замерзания

Heat — логичное решение проблемы замерзания. Это также дорогостоящий подход к проблеме по нескольким причинам. Очевидно, что если газу никогда не позволять достигать температуры замерзания, лед не может образовываться и его не будет. Вода, скорее всего, не будет удалена, что остается проблемой для операций и контрактов, но замерзание устранено. Проблемы с теплом заключаются в том, что это дорогостоящее оборудование для установки, для производства тепла требуется дополнительное топливо (энергия и доход), и тепло не будет оставаться эффективным, поскольку оно перемещается по трубопроводу и удаляется от источника тепла.

Тепло также представляет собой потенциальную опасность, поскольку может стать причиной воспламенения газа. Безопасность и особое внимание к правильному применению являются обязательными при использовании источника тепла. Наиболее распространенное применение тепла для защиты от замерзания — это конкретная и непосредственная ситуация, как в случае корпуса регулирующего клапана. Падение давления на регуляторе является единственной проблемой и, следовательно, может быть единственным конкретным местом, где требуется защита от замерзания.

Существует несколько способов подачи тепла от нагревательных одеял, каталитических нагревателей, нагревателей топливопровода или, в некоторых случаях, паровых систем, где они правильно спроектированы, установлены и обслуживаются.Системы обогрева могут быть очень эффективными при локальном замораживании.

5. Практические рекомендации по защите от замерзания

На этапе проектирования трубопроводной системы и вплоть до контрольно-измерительной системы можно предпринять определенные шаги для уменьшения негативных последствий проблем с замерзанием. Конфигурации трубопроводов, которые допускают скопление жидкости, следует по возможности избегать. Дренаж должен иметь уклон в сторону дренажной арматуры, расположенной в низинах.По возможности используйте шаровые краны и трубки большого диаметра (1/2 дюйма для отвода ½ дюйма) для линий подачи инструментов и измерительных линий. Избегайте ограничений там, где будет происходить поток. Трубопроводы должны иметь уклон в сторону трубопровода, и у вас должна быть приборная система без утечек. Жидкости, если они есть, будут направлены в сторону утечки. Если вы избегаете образования ловушек и зон выпадения жидкости, ваши проблемы с замерзанием будут сведены к минимуму.

6. Каплесборники, коалесцеры и автоматические слива жидкости могут уменьшить проблемы с замерзанием оборудования

Случайные пробки жидкости могут повредить или даже «заблокировать» многие системы подачи инструментов.Там, где существует вероятность возникновения пробок, или в случаях, когда жидкость представляет собой серьезную проблему для подачи газа, используемого для КИП, каплеуловители и коалесцеры могут эффективно выбивать или уменьшать количество воды и конденсата в системе подачи небольшого объема для КИПиА. Если проблема серьезная, может быть чрезвычайно полезен автоматический сброс жидкости, предназначенный для КИПиА. В то время как для капельного бака требуется обычный ручной слив, автоматический слив жидкости будет действовать как сборный резервуар для капельного бака с коалесцирующим агентом и в результате использования внутреннего поплавкового узла и поворотного клапана автоматически сбрасывает собранную жидкость в точку с более низким давлением.

7. Инструментальные фильтры для защиты от замерзания управляющего оборудования

Для многих контроллеров приборов и другого чувствительного измерительного оборудования, питаемого от приборного газа, требуется максимально возможный уровень подачи чистого и сухого газа. В некоторых случаях хороший линейный полиэтиленовый фильтр может обеспечить адекватную защиту. Но наиболее распространенным решением для подачи газа в КИП является фильтр-осушитель.

Эти устройства разработаны для приложений высокого давления со съемными картриджами с носителями.Хотя доступны различные типы сред, от молекулярных сит до специальных сред для удаления h3S, большинство из них оснащено комбинированным картриджем с осушителем и угольным фильтром. В сочетании с подачей очень сухого и свежего газа дополнительные фильтрующие элементы в картридже также обеспечивают защиту от 2 до 4 микрон. В критических местах эти сушилки могут быть соединены с регуляторами смещения для обеспечения бесперебойной работы. Если одна сторона системы закрывается из-за замерзания, другая сторона берет на себя подачу, в то время как исходная сторона входа оттаивает.Фильтр-осушитель может быть оснащен «глазками», которые указывают на насыщение влагопоглотителя и необходимость замены картриджа. Эти системы спроектированы для максимальной защиты с типичной скоростью потока около 60-70 кубических футов в минуту. Там, где отказ в поставке инструмента может создать серьезные проблемы, этот узел дегидратации представляет собой надежное решение для непрерывной работы.

В последнее время несколько производителей объединили регулирование, фильтрацию, нагревание и удобство использования коллектора в отдельные автономные системы инструментальной башни с несколькими давлениями для более сложных потребностей в поставках приборов.Они в первую очередь предназначены для пневматических контроллеров и систем КИП, но могут использоваться во многих областях, где требуется чистый, сухой, регулируемый и бесперебойный газ или приборный воздух.

Вихревой нагрев — это также новый метод обеспечения источника тепла, основанный на физике снижения давления и перепада давления. По мере накопления опыта в этой области эта технология окажется хорошим источником эффективного обогрева в промышленности.

Заключение

Системы природного газа, от основных трубопроводов до приборов низкого давления, могут работать в условиях замерзания. Благодаря тщательному планированию и оценке вашего конкретного применения, правильному выбору доступных опций и хорошей программе регулярного технического обслуживания эту отраслевую проблему можно контролировать и сводить к минимуму. Если игнорировать эти проблемы, затраты на устранение последствий почти всегда будут дороже, чем профилактические меры, которые можно было бы предпринять.Избежание проблем с замораживанием — хорошее вложение, которое увеличивает прибыльность вашей компании.

Ссылки

«Защита от замерзания контрольно-измерительных приборов, контроллеров, регулирующих клапанов и измерительного оборудования», T.F. Велкер, презентация на кратком курсе по измерению газа в Аппалачах, Питтсбург, Пенсильвания, 2000 г.

«Системы фильтрации подачи оборудования для нефтяной, газовой, нефтехимической и промышленной промышленности», Дэвид Дж. Фиш, 1999 г.

Pipeline Rules of Thumb Handbook, 2 ^nd Edition, 1989, Gulf Publishing Company, Houston, TX

Завод по переработке природного газа, Служба нефтедобычи, Техасский университет, 1974

«Предотвращение замерзания измерительного и регулирующего оборудования», Б.Г. Спрадлин, Представлено в Международной школе измерения углеводородов, Норман, Оклахома, 1982 г.

«Предотвращение замерзания измерительного и регулирующего оборудования», Дэвид Уоффорд, представленный в Международной школе измерения углеводородов, Талса, штат Оклахома, 1999 г.

Технические аспекты замораживания, низкотемпературного хранения и размораживания стволовых клеток для клеточной терапии — FullText — Transfusion Medicine and Hemotherapy 2019, Vol. 46, № 3

Абстрактные

Коммерческая и клиническая разработка продуктов клеточной терапии неизбежно потребует криоконсервации и замороженного хранения клеточных исходных материалов, промежуточных продуктов и / или конечного продукта.Оптимизация криоконсервации так же важна, как и оптимизация процесса культивирования клеток для получения максимального выхода и стабильного конечного продукта. Субоптимальная криоконсервация может привести не только к вариациям от партии к партии, снижению функциональности клеток и снижению выхода клеток, но также к потенциальному отбору субпопуляций с генетическими или эпигенетическими характеристиками, отличными от исходной линии клеток. Нормативные требования также влияют на криоконсервацию, поскольку они потребуют надежного и воспроизводимого подхода к замораживанию, хранению и оттаиванию продукта.Это требует внимания ко всем аспектам применения низких температур: от выбора морозильного контейнера и криопротектора, используемой скорости охлаждения и способа его доставки, правильного обращения с замороженным материалом во время хранения и транспортировки до возможного размораживания продукт конечным пользователем. Каждый из них в большей или меньшей степени влияет на все остальные, и ни один из них не следует игнорировать. В этой статье представлены практические идеи и альтернативные решения технических проблем, с которыми сталкиваются при криоконсервации клеток для использования в клеточной терапии.

© 2019 S. Karger AG, Базель

---

Введение

Регенеративная медицина определяется как замена или регенерация человеческих клеток, тканей или органов для восстановления или восстановления нормальной функции [1]. Он охватывает широкий спектр терапевтических методов от трансплантации органов и тканей до сложных тканевых каркасов и клеточной терапии, а также более традиционных методов лечения с использованием фармацевтических препаратов, биопрепаратов и устройств [2].Он включает в себя биопрепараты, производимые в больницах, такие как аутологичный костный мозг и стволовые клетки периферической крови (PBSC), а также продукты из аллогенных тканей, такие как пуповинная кровь (CB), сердечные клапаны и кожа с разделенной толщиной, производимая государственными / частными банками тканей. В последнее время эта область расширилась и включает ряд новых клеточных терапий, основанных на взрослых, эмбриональных (hESC) и индуцированных плюрипотентных стволовых клетках (iPSC), а также соматических клетках, причем акцент начинает смещаться в сторону вовлечения коммерческих биофармацевтических препаратов. часто в сотрудничестве с академическими и клиническими партнерами.

В отличие от традиционных методов лечения гемопоэтическими стволовыми клетками, новые клеточные методы лечения представляют собой дивергентный класс продуктов, которые, помимо классификации по типу клеток, также могут быть классифицированы по терапевтическим показаниям, статусу введения (аутологичный или аллогенный), уровню манипуляции, связанные с их производством, а также с помощью лежащих в их основе технологий [3]. С точки зрения регулирования, в Европейском Союзе (ЕС) эти недавно появившиеся клеточные методы лечения называются передовыми лекарственными средствами [4], которые далее подразделяются на технологической основе на соматические клетки, генную терапию и продукты тканевой инженерии.В США продукты клеточной терапии включают иммунотерапию, противораковые вакцины и другие виды терапии аутологичными и аллогенными клетками, в том числе с использованием гемопоэтических, взрослых и эмбриональных стволовых клеток [5].

На сегодняшний день на рынке появилось немного продуктов для клеточной терапии. По состоянию на конец 2015 года в Канаде, ЕС, Японии, Корее и США было 38 лицензированных продуктов клеточной терапии [6]. Более свежие данные по ЕС показывают, что разрешения на продажу были выданы в общей сложности для 10 лекарственных препаратов для современной терапии [7], при этом США одобрили 16 продуктов для клеточной и генной терапии по состоянию на декабрь 2018 г. [8].Несмотря на это, в настоящее время существует множество клинических испытаний, находящихся на различных этапах выполнения: в базе данных клинических испытаний перечислены 93 исследования мезенхимальных стволовых клеток (МСК) и 40 исследований с участием чЭСК и ИПСК для широкого спектра терапевтических применений [9, 10], в то время как потенциальные клеточной терапии привело к тому, что она была признана четвертой терапевтической опорой глобального здравоохранения [11].

Применение любой терапии для людей требует, чтобы она производилась и распространялась в рамках нормативной базы для обеспечения безопасности и эффективности.Эта структура включает не только производственный процесс, но и предшествующие события, такие как закупка исходных материалов, а также последующее хранение и распределение продукта. В случае клеточной терапии необходимость хранить клеточный материал или сохранять определенные клеточные атрибуты иногда в нескольких точках производственного процесса требует введения стадии криоконсервации. В недавнем исследовании, проведенном Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA), более 80% заявлений MSC использовали криоконсервацию как часть производственного процесса для хранения и доставки своей продукции [12].

Криоконсервация дает значительное количество преимуществ: она устраняет необходимость поддерживать клетки в долговременной культуре с сопутствующими проблемами эпигенетических изменений и генетического дрейфа; он позволяет поддерживать желаемые фенотипы клеток за счет хранения основного и рабочего банков клеток; он позволяет помещать донорские клетки и конечный продукт в карантин для расширенного микробиологического тестирования, в то время как с коммерческой точки зрения он обеспечивает продукту срок годности и упрощает логистические проблемы, связанные с транспортировкой клеток внутри или между учреждениями.С терапевтической точки зрения он позволяет проводить несколько сеансов лечения с использованием одной и той же партии клеток и гибкость в выборе времени лечения для пациента.

Во время производства процесс криоконсервации иногда предшествует, а обычно следует за культивированием и размножением клеток, и является неотъемлемой частью банковского процесса. Сам конечный продукт, если он заморожен, необходимо будет хранить, транспортировать при соответствующей температуре ниже нуля и в конечном итоге разморозить перед введением пациенту. Таким образом, эффективность и стабильность конечного продукта так же зависят от этих процессов, как и от остальной части производственного процесса.Тем не менее, будучи ключевым компонентом, криоконсервация часто отходит на задний план по сравнению с другими областями биотехнологии, когда дело доходит до оптимизации и контроля. Отсутствие внимания к ключевому производственному процессу было определено как потенциальное узкое место в будущей разработке продуктов комплексной клеточной терапии [13, 14]. Поэтому глубокое понимание процесса криоконсервации, включая хранение при низкой температуре, жизненно важно для успешного коммерческого производства клеточной терапии.

Однако разнообразие клеточных методов лечения и большое разнообразие клеточных исходных материалов делает маловероятным достижение универсального процесса криоконсервации.Это делает еще более важным понимание и правильное применение фундаментальных принципов криобиологии. Подробные обзоры принципов криобиологии и биологической реакции клеток на воздействие отрицательных температур выходят за рамки данной статьи и могут быть найдены в других местах [15-17]. Целью данной статьи является определение технических проблем, общих для всех процессов криоконсервации, независимо от типа используемых клеток или тканей и формата, в котором проводится клеточная терапия.

Криоконсервация

Криоконсервация — это применение низких температур для сохранения структурной и функциональной целостности клеток и тканей, во время которого водная фаза обычно претерпевает фазовый переход с образованием льда. После замораживания клетки и ткани могут храниться в стабильном состоянии при условии, что достигнутая минусовая температура достаточно низкая: обычно при температуре жидкого азота (–196 ° C) или около нее. В качестве альтернативы, консервация может быть достигнута путем стеклования, которое представляет собой отверждение водной системы без кристаллизации и роста льда [18].Во время криоконсервации значительного выживания клеток и поддержания структурной целостности можно достичь только с помощью соединений, известных под общим названием криопротекторные агенты (CPA). В низкой концентрации CPA смягчают повреждение, вызванное медленным охлаждением, когда образование внеклеточного льда во время замораживания вызывает значительное увеличение концентрации повреждающих растворенных веществ. Используемые в высокой концентрации или в комбинации, они способствуют стеклованию при низких, реально достижимых скоростях охлаждения.

К сожалению, не все клетки и ткани одинаково реагируют на данный протокол криоконсервации. Различия в их физическом и биологическом составе, такие как проницаемость мембраны и отношение поверхности к объему, вызывают различные реакции на процесс криоконсервации, что приводит к различиям в жизнеспособности при последующем оттаивании. Более того, метаболическое и функциональное «здоровье» клеток, вступающих в процесс криоконсервации, будет влиять на результат, и концепция «мусор на входе — мусор на выходе» применима как к криоконсервации, так и к информатике.

Следовательно, необходимо не только оптимизировать процесс культивирования клеток, но и оптимизировать протокол криоконсервации для интересующего типа (ов) клеток, а не принимать готовый протокол, который, хотя и предлагает некоторое время после размораживания. восстановление, тем не менее, может привести к значительной потере жизнеспособности и функциональности. Эта потеря может достигать 60–70% с некоторыми описанными протоколами криоконсервации стволовых клеток, в зависимости от используемого анализа и времени его применения после оттаивания [19].Хотя субоптимальное сохранение может показаться приемлемым, учитывая способность клеток расширяться после оттаивания, оно может вызвать нежелательное давление отбора, которое проявляется во время последующего культивирования. Более того, было показано, что субоптимальная криоконсервация приводит к хромосомным повреждениям и эпигенетическим изменениям [20], в то время как присутствие апоптотических и некротических клеток в конечном продукте перед нанесением пациенту может вызвать воспалительный ответ или вызвать аномальную иммунологическую реакцию [21]. ].Хотя обычно применялся эмпирический подход к оптимизации протокола криоконсервации, в контексте регулируемой клеточной терапии этот подход может быть нежелательным, и более подходящим может быть методологический или качественно-проектный подход [22, 23].

Криоконсервацию можно разделить на ряд взаимосвязанных элементов, каждый из которых требует контроля и каждый из которых создает свои собственные технические проблемы:

• Выбор контейнерной системы

• Выбор CPA и транспортного средства

• Протокол для добавления CPA

• Выбор процесса замораживания или стеклования

• Режим охлаждения

• Условия хранения

• Размораживание и элюирование CPA

• Все это необходимо учитывать, как индивидуально, так и в совокупности, на предмет потенциального воздействия на качество конечного продукта как можно раньше в цикле разработки продукта.Более того, в рамках нормативной среды, которая будет охватывать потребность в надежной системе менеджмента качества, независимо от того, какой выбор будет сделан, необходимо будет оценить риски, а оборудование, материалы и процессы будут проверены, чтобы продемонстрировать соответствие назначению.

  Выбор контейнерной системы

  Существует ряд вариантов замороженного хранения продуктов клеточной терапии, выбор которых будет зависеть от ряда факторов, включая предполагаемое использование клеток, плотность клеток и объем. требуется.В дополнение к обеспечению стерильности для продуктов, предназначенных для лечения людей, будут действовать дополнительные нормативные требования, включая отсутствие биоактивных выщелачиваемых веществ и других твердых частиц, а также целостность укупорки во время хранения [24].

  Криопробирки

  Хотя использование стандартных криопробирок является обычной практикой, особенно для исследований и разработок, они вряд ли подходят для клинических или масштабных процессов и не считаются передовой практикой, поскольку представляют потенциальную опасность заражения хранимых клеток [25].Некоторые криопробирки имеют маркировку СЕ как IVD (например, Nunc ^TM ). Однако не все криопробирки поставляются стерильными. При использовании криопробирки следует использовать пробирки с уровнем гарантии стерильности 10 ^–6 в соответствии с ISO 1137 и / или гамма-облученные, если стерильность продукта является важным фактором. С точки зрения загрязнения во время заполнения флаконы с прокладкой и внутренней резьбой предпочтительнее, чем флаконы с внешней резьбой, они не обеспечивают заполнение закрытой системой или герметичное уплотнение во время низкотемпературного хранения: это важно, если образцы хранятся в жидкости. азот (LN ₂ ).Использование термоусадочной муфты в качестве внешней оболочки, особенно в сочетании с хранением в газовой фазе LN ₂ , может обеспечить дополнительный уровень защиты, хотя производитель не гарантирует герметичное уплотнение, и есть опасения, что процесс нагрева может повредить устройство. клетки. Был предложен альтернативный метод наложения рукавов, который, как было продемонстрировано, не оказывает неблагоприятного воздействия на выживаемость клеток во время нанесения и предотвращает попадание LN ₂ во время хранения в жидкой фазе [26].

  Прослеживаемость и отслеживание образцов имеют большое значение в рамках нормативно-правовой базы, и это относится к замороженным промежуточным продуктам, а также к конечному продукту. Криопробирки с линейным и двумерным штрих-кодом доступны от ряда поставщиков оптом или в различных форматах, включая 48-пузырьковый формат SBS (например, Fluidx, www.brookslifesciences.com). Совсем недавно были внедрены RFID-метки, совместимые с температурами хранения LN ₂ и способные дооснащаться стандартными криопробирками (Cryogatt, www.cryogatt.com). Разрабатываются сверххолодостойкие чипы, которые при установке в отдельные криопробирки могут хранить не только подробную тепловую историю, но также подробную информацию о партии, результаты испытаний и другую соответствующую документацию по качеству [14].

  Существуют альтернативы стандартным криопробиркам, которые больше подходят для клинического применения. Криогенные флаконы с закрытой системой CellSeal® (www.cookregentec.com) представляют собой систему с портами, которую можно запечатать с помощью стандартного RF-герметика [27], для которой была разработана полуавтоматическая система наполнения.CryoBioSystems (www.cryobiosystem.com) также разработала термосвариваемую криотрубку с той же изомерной смолой, которая используется для их стекловолоконных соломинок. Эти трубки имеют маркировку CE и классифицируются как медицинские устройства класса II. Также доступно устройство для герметизации трубок.

  Замкнутые системы, альтернативные пластику

  Хотя существуют автоматизированные системы для наполнения криопробирок, они больше подходят для небольших партий в диапазоне от 10 до 100 флаконов. Системы контейнеров для крупномасштабного производства малых доз терапевтических клеток потребуют другого подхода как к контейнеру, так и к системе наполнения.Использование пластиковых флаконов закрытой системы в сочетании с технологиями фармацевтического наполнения позволит обрабатывать большие партии от нескольких сотен до нескольких тысяч флаконов.

  Daikyo Crystal Zenith® прозрачные пластиковые флаконы для фармацевтических препаратов, изготовленные из циклического олефинового полимера (www.westpharma.com), успешно используются для криоконсервации MSC, замороженных и хранящихся при –196 ° C [28]. В уникальной системе, разработанной Aseptic Technologies (AT-Closed Vial®, www.aseptictech.com), используется предварительно закрытый стерильный флакон с перегородкой из термопласта, который можно замораживать и хранить при –196 ° C.Каждый флакон наполняется через иглу, вставленную через термопластичную перегородку, которая затем повторно герметизируется с помощью лазера. Доступны как ручные, так и автоматизированные системы заполнения, что делает эту систему очень универсальной [29].

  Была разработана коммерчески доступная газопроницаемая кассета с портами (CLINICELL®, www.mabio.net), подходящая как для культивирования клеток, так и для последующего замораживания и хранения в газовой фазе LN ₂ . Это позволяет замораживать in situ после замены культуральной среды на CPA [30].

  Криопакеты

  Замораживание больших количеств клеток необходимо для терапевтического банка клеток. Это потребует больших или меньших объемов высококонцентрированных клеток. Кроме того, биореакторные системы часто требуют засева большим количеством клеток из рабочих банков клеток или заквасочных культур. Пакеты для замораживания, обычно используемые для криоконсервации стволовых клеток костного мозга и периферической крови, успешно используются для хранения замороженных линий клеток млекопитающих [31].Системы закрытых мешков, которые могут устранить необходимость в дорогостоящих чистых помещениях, также были разработаны для PBSC. Здесь данные долгосрочного наблюдения показывают, что продукты сопоставимы с продуктами, производимыми в обычных чистых помещениях [32], и система была принята регулирующими органами ЕС [33]. Недавно было продемонстрировано использование замороженных «мешков с семенами» (Cell Freeze®; https://www.chartermedical.com) для криоконсервации посевного материала большого объема, необходимого для биореакторов [34].

  До недавнего времени доступные объемы заполнения (порядка 50–100 мл) ограничивали использование криопакетов в основном для криоконсервации костного мозга и PBSC. Хотя для криоконсервации CB в специализированных комбинированных системах замораживания / хранения с контролируемой скоростью (Thermogenesis BioArchive®, www.cescatherapeutics.com/) были доступны пакеты меньшего размера, мешки с небольшими объемами заполнения были недоступны. Однако стали доступны многокамерные криопакеты с объемом заполнения до 6 мл на камеру (Cryostore ^TM , www.origen.com), что должно позволить использовать криопакеты в качестве предпочтительных контейнеров в будущих клеточных терапиях. Как и в случае с криопробирками, доступны пакеты с внешней оберткой, позволяющие «упаковывать в два пакета» первичный контейнер, чтобы снизить риск заражения и обеспечить стерильный внутренний пакет для непосредственного использования пациентом.

  Соломинки и тарелки для витрификации

  Если не используются сложные несколько CPA в комбинациях, которые позволяют стеклование при медленных скоростях охлаждения, существуют ограниченные варианты контейнеров, которые позволят обеспечить сверхбыстрые скорости охлаждения, необходимые для стеклования.Как правило, они ограничиваются трубочками для стеклования с открытым концом, которые создают значительные проблемы с загрязнением нестерильным LN ₂ . Метод «соломинка в соломе» для витрификации эмбрионов и нейросфер мышей был успешно использован [35], и были изучены методы криоконсервации ЭСК в криопробирках [36]. Недавно была разработана новая чашка для культивирования клеток (TWIST), подходящая для витрификации прикрепившихся клеток на основе планшетов [37], что имеет значение для криоконсервации клеток в форматах планшетов для широкого круга задач скрининга.

  Выбор CPA

  CPA защищают клетки преимущественно от разрушительного воздействия замораживания при низких скоростях охлаждения (т. Е. Тех, которые обычно достигаются с помощью имеющихся в продаже пассивных охлаждающих устройств [PCD] и морозильников с регулируемой скоростью [CRF]). При добавлении в достаточной концентрации они понижают точку замерзания раствора, уменьшая количество льда, образующегося при любой заданной минусовой температуре, тем самым снижая концентрацию солей в незамерзшей фракции и смягчая повреждение растворенных веществ.Также были продемонстрированы другие защитные эффекты, включая стабилизацию мембраны [38].

  CPA можно разделить на две группы: проникающие CPA с низкой молекулярной массой (например, диметилсульфоксид [DMSO], глицерин, этиленгликоль и пропиленгликоль) и высокомолекулярные непроникающие агенты (например, сахароза, поливинилпирролидон и гидроксиэтилкрахмал).

  Эффективность любого данного проникающего CPA будет зависеть в определенной степени от проницаемости для него типа клетки и любой химической токсичности, которую клетка может испытывать в результате этого.Степень защиты, обеспечиваемая CPA, будет зависеть от ряда переменных: концентрации, температуры воздействия, продолжительности воздействия, скорости и шагов концентрации, используемых при добавлении и удалении CPA, раствора-носителя, используемого для CPA, и любых других факторов. осмотическая буферизация, используемая при его удалении. Все они взаимодействуют, и их необходимо учитывать при оптимизации процесса криоконсервации, как и взаимодействие CPA с другими переменными, такими как скорость охлаждения и нагревания.

  Осмотическое повреждение и химическая токсичность

  Проникающие CPA, такие как ДМСО, проходят через клеточную мембрану медленнее, чем вода. Воздействие раствора, содержащего проникающий CPA, таким образом, приведет к временному осмотическому дисбалансу, поскольку вода выходит из клетки быстрее, чем проникающий CPA может проникнуть внутрь. Аналогичный осмотический переходный процесс будет происходить в обратном направлении во время удаления CPA, когда вода перемещается в ячейка движется быстрее, чем CPA. Эти осмотические переходные процессы необходимо контролировать, чтобы предотвратить повреждение клеток, поскольку клетки сокращаются или набухают за пределы допустимых пределов.

  Хотя одностадийное добавление CPA, используемых в концентрациях <2M, часто считается безопасным, добавление последовательно увеличивающихся концентраций часто обеспечивает улучшение выживаемости [39]. С другой стороны, разгрузка CPA за один этап, например центрифугирование клеток и замена раствором, не содержащим CPA, вероятно, приведет к повреждающим осмотическим переходным процессам, поскольку клетки подвергаются неограниченному набуханию клеток в ответ на осмотический дисбаланс. Двухэтапное разведение CPA (или даже протоколы многоступенчатого элюирования) или использование «осмотического буфера», такого как сахароза или маннит, во время разгрузки поможет предотвратить вредные осмотические переходные процессы [38].

  Химическая токсичность — еще один потенциально опасный фактор, который необходимо учитывать; как в выборе CPA, так и в используемой концентрации [40]. В то время как несколько токсических событий были связаны с непроникающим CPA, способность проникающих CPA проникать в клетку, где они могут взаимодействовать с клеточными процессами, делает этот класс соединений более вероятным для демонстрации клеточной токсичности. Кроме того, время, отведенное для уравновешивания, и температура воздействия до замораживания, а также время контакта после оттаивания будут способствовать этой токсичности.Сокращение времени и снижение температуры во время загрузки и разгрузки поможет свести нежелательные цитотоксические эффекты к минимуму.

  Автоматизированные системы розлива

  После воздействия CPA сокращение времени до начала процесса замораживания поможет снизить нежелательные цитотоксические эффекты. При средних и больших размерах партий время, необходимое для ручного аликвотирования клеточной суспензии во флаконы, может быть значительным. Более того, поддерживать низкую температуру в чистом помещении часто бывает сложно.Единственная реальная альтернатива — сократить время воздействия за счет сокращения продолжительности процесса аликвотирования. Это дает дополнительное преимущество, заключающееся в снижении вероятности загрязнения в процессе асептического розлива. Доступны небольшие наполнители для укупорки-откупорки, такие как XSD-Biofill (www.brookslifesciences.com) и Fill-It (www.sartorius-stedim-tap.com), оба из которых обеспечивают автоматическое наполнение планшетов SBS в различных форматы. Оба устройства помещаются в шкаф микробиологической безопасности класса II, обеспечивая соблюдение требований к качеству воздуха для операций асептического наполнения.

  Диметилсульфоксид

  Самым широко используемым CPA, несомненно, является ДМСО. Сам по себе или в сочетании с другими проникающими и непроникающими CPA, это CPA выбора в большинстве исследовательских и биобанковских ситуаций. Однако, несмотря на его эффективность в сохранении широкого разнообразия клеток и тканей и его длительное терапевтическое использование, особенно при криоконсервации PBSC и CB, были высказаны опасения в отношении его использования для клеточной терапии.

  ДМСО, как известно, оказывает разнообразное воздействие на потенциал дифференцировки чЭСК [41] и может влиять на эпигенетический статус и вызывать апоптоз в некоторых клетках [42, 43].Однако эти эффекты обычно возникают после воздействия в течение многих часов или дней в культуре при 37 ° C — в условиях, отличных от тех, которые наблюдаются во время криоконсервации.

  Клиническое воздействие ДМСО

  Сообщалось о клинических аллергических реакциях, некоторые тяжелые и иногда со смертельным исходом, у пациентов, которым непосредственно вводили гемопоэтические стволовые клетки, содержащие ДМСО [44]. Однако недавнее проспективное многоцентровое эпиднадзорное исследование показало, что причиной этих реакций могут быть факторы, не связанные с CPA [45].Дебаты вокруг использования ДМСО привели к призыву провести надлежащую оценку проблем, связанных с его использованием [14].

  Использование сыворотки и альтернатив сыворотке

  Почти так же популярно, как и ДМСО, его использование с сывороткой животных, особенно с фетальной бычьей сывороткой (FBS). Используемый в концентрациях до 90% или, в более низких концентрациях в сочетании с культуральной средой, он был основным продуктом криоконсервации многих клеточных линий, хранящихся в банках. Использование FBS в разработке клинических методов лечения подвергалось сомнению как с микробиологической, так и с иммуногенной точек зрения.Однако в настоящее время он все еще разрешен в качестве вспомогательного вещества при производстве продуктов клеточной терапии, несмотря на широко распространенное мнение об обратном [46]. Mendicino et al. [12] обнаружили, что в большинстве нормативных документов на основе MSC описывается использование FBS где-то в производственной цепочке. Нормативные требования к его использованию, включая оценку риска, подтвержденные шаги по инактивации вирусов крупного рогатого скота и получение из географически утвержденных стада без прионов, были опубликованы как EMA, так и FDA [47, 48].

  Развитие культуральных сред, не содержащих сыворотки и ксенонов, отражается в разработке аналогичных CPA, не содержащих сыворотку / ксенон. Коммерчески доступные CPA, которые отвечают этому критерию отсутствия сыворотки у животных, были доступны в течение некоторого времени. Собственный характер этих коммерческих предложений делает невозможным детальную оценку рисков CPA и ее компонентов. Однако FDA разрешило поставщикам предоставлять конфиденциальную информацию о своих CPA в форме мастер-файла лекарственного средства (DMF).Использование CPA с DMF само по себе не является одобрением регулирующих органов, но его можно использовать при подаче клеточной терапии на одобрение регулирующих органов, если в заявке имеется перекрестная ссылка. Примеры коммерчески доступных CPA, некоторые из которых содержат DMFs FDA, можно найти в таблице 1.

  Таблица 1.

  Коммерчески доступные CPA и вспомогательные вещества ^a

  Использование заменителей сыворотки как в коммерческих, так и в самоформулированных CPA , уже давно так. В течение многих лет раствор человеческого альбумина использовался в качестве наполнителя при криоконсервации PBSC в ДМСО.Совсем недавно лизат тромбоцитов человека был успешно использован в качестве вспомогательного вещества с ДМСО при криоконсервации стволовых клеток, полученных из жировой ткани [49]. Примеры коммерчески доступных лизатов тромбоцитов человека можно найти в Таблице 1.

  Использование растворов для хранения «внутриклеточного типа»

  Альтернативой средам, сыворотке и заменителям сыворотки, используемым в качестве растворов носителя для CPA, являются растворы для хранения при гипотермии. Среды и физиологические буферы (с / без сыворотки) часто использовались в качестве растворов-носителей для CPA.Эти растворы «внеклеточного типа» имитируют ионный состав межклеточных жидкостей при нормотермической температуре. Однако, когда температуры опускаются ниже физиологических, растворы «внеклеточного типа» больше не уравновешивают ионные изменения и не обеспечивают достаточную буферную емкость для изменившихся условий. Было показано, что использование растворов «внутриклеточного типа», включая Unisol, Eurocollins и HypoThermosol (Таблица 1), улучшает результаты криоконсервации по сравнению с теми же CPA в растворах носителей «внеклеточного типа» [50, 51].

  Самоформулированные CPA

  Наличие стерильных CPA с маркировкой CE, таких как DMSO (Таблица 1), и соответствующих растворов в качестве носителей означает, что растворы криопротекторов с самообразованием могут быть приготовлены на месте. Использование самоформулированных CPA, практика, обычно применяемая в исследовательской среде, хотя и потенциально выгодна на этапе оптимизации режима криозащиты, позволяя получить точные сведения о составе, тем не менее может представлять проблемы в дальнейшем.Дополнительные ресурсы потребуются для подтверждения этапа подготовки, а также для непрерывного контроля качества и микробиологического тестирования для обеспечения стерильности для каждой партии подготовленного КПЕС. Это может перевесить стоимость использования коммерчески доступных альтернатив.

  Замораживание

  В контексте этой статьи медленное охлаждение может быть определено как скорость охлаждения, достижимая с помощью PCD и некоторых CRF. Диапазон для этих охлаждаемых устройств без LN ₂ составляет ≤2 ° C / мин. LN ₂ -охлажденные CRF могут достигать скорости охлаждения примерно до 30 ° C / мин, что, опять же в контексте этой статьи, можно рассматривать как промежуточную или быструю скорость охлаждения.

  Охлаждение водного раствора ниже точки его равновесной точки замерзания в какой-то момент приведет к образованию льда из воды. Спонтанное зародышеобразование льда — это случайное событие, которое может принимать две формы: гомогенное зародышеобразование (происходящее при температурах ниже –35 ° C) и гетерогенное зародышеобразование (событие, катализируемое поверхностью, происходящее при температурах примерно от –5 до –20 ° C). На практике в криоконсервированной системе зародышеобразование носит гетерогенный характер [52].

  В клеточных суспензиях, даже когда концентрация клеток значительно выше, чем те, которые обычно встречаются во время банка клеток, зародышеобразование обычно происходит во внеклеточном компартменте гораздо большего размера, что приводит к наложению на клетки осмотического градиента в виде льда и солей в остаточных количествах. жидкая фаза концентрируется.Клетки будут реагировать на осмотическое неравновесие одним из двух способов — либо движением воды из клетки, либо внутриклеточным зарождением льда. Путь к восстановлению осмотического равновесия зависит от ряда факторов, включая водопроницаемость клеточной мембраны, соотношение поверхности / объема клетки и скорость изменения температуры: достаточно медленно, и клетки будут повторно уравновешиваться за счет сжатия; слишком быстро, клетки переохладятся и образуется внутриклеточный лед [18].

  Оптимальная скорость охлаждения

  Добавление CPA в систему будет преимущественно защищать клетки по мере замораживания от повреждений, связанных с увеличением концентрации растворенных веществ в остаточной жидкой фазе в диапазоне температур от –10 до –40 ° C .Охлаждение со скоростью, которая сводит к минимуму время воздействия в этом диапазоне, улучшит выживаемость клеток. С другой стороны, вероятность образования внутриклеточного льда (IIF) увеличивается за счет увеличения скорости охлаждения. Таким образом, скорость охлаждения, обеспечивающая максимальное выживание, зависит не только от биофизических параметров, специфичных для типа клеток, но также от типа и концентрации CPA. Изучение кривой выживаемости в зависимости от скорости охлаждения для ряда типов клеток покажет не только то, что выживаемость клеток представляет собой баланс между противодействующими силами повреждения растворенным веществом и IIF, но и что оптимальная скорость охлаждения может быть определена для любого данного типа клеток [15 , 16].Более того, такие оптимальные скорости охлаждения будут широко варьироваться в зависимости от типа ячейки.

  На основе таких кривых выживаемости медленное охлаждение можно определить как любую скорость охлаждения, при которой клетка может реагировать на скорость изменения температуры за счет оттока воды, в то время как быстрое охлаждение можно приблизительно определить как то, при котором преобладает IIF. Это подчеркивает контекстуальный характер терминов «медленное» и «быстрое» охлаждение.

  Переохлаждение: пока еще неконтролируемая переменная

  Из всех событий, происходящих во время криоконсервации, переохлаждение является наименее контролируемым [53].Переохлаждение (или переохлаждение) — это разница температур между точкой равновесного плавления системы и температурой, при которой происходит зародышеобразование. Степень переохлаждения может сильно варьироваться между образцами, охлажденными в течение одного цикла охлаждения, с неконтролируемым переохлаждением, что приводит к изменению жизнеспособности и функции клеток после оттаивания от образца к образцу, что может повлиять на нормативные требования к стандартизации процесса и согласованности результатов. Зарождение ядра в условиях значительного переохлаждения приведет к быстрой кристаллизации льда, что может привести к повреждению клеток из-за IIF.Более того, большое выделение скрытой теплоты будет возвращать температуру системы к точке равновесного плавления и может привести к расширенному изотермическому плато, которое, если внешнее охлаждение будет продолжаться, приведет к увеличению разницы температур между образцом и его окружением. Это приведет к быстрому неоптимальному охлаждению системы после выделения скрытой теплоты. Установление запрограммированного поддержания температуры ниже нуля во многих протоколах CRF состоит в том, чтобы обеспечить высвобождение этого скрытого тепла и предотвратить быстрое неконтролируемое охлаждение образца.

  Было показано, что контролируемая нуклеация льда благоприятна для большого числа типов клеток, включая МСК [54], и обычно используется в области оплодотворения in vitro. Однако его применению в биобанках и в области клеточной терапии в значительной степени не уделялось должного внимания. Это вполне может быть связано с тем, что методы индуцирования зародышеобразования в образцах: «затравка» льдом, быстрое изменение температуры, электрическое замораживание, давление, вибрация и агенты образования зародышей льда не только трудно стандартизировать или включить в стандартное оборудование для замораживания, но и не могут быть совместим с требованиями надлежащей производственной практики (GMP).

  Агенты образования льда, соответствующие требованиям GMP, уже некоторое время находятся в стадии разработки. IceStart ^TM (www.asymptote.co.uk), новый инертный зародышеобразующий материал, первоначально доступный в виде шариков, недавно был включен в формат многолуночного планшета для использования в высокопроизводительном скрининге. Однако о его совместимости с процессами цГМФ для какого-либо продукта клеточной терапии еще не сообщалось.

  Пассивные охлаждающие устройства в сравнении с CRF

  Устройства для замораживания ячеек делятся на два типа: PCD и CRF.Для достижения скорость охлаждения примерно 1 ° C / мин в диапазоне от –10 до –40 ° C (рис. 1A). Это достигается помещением контейнера в холодильник с температурой –80 ° C. Зарождение зародышей в этих устройствах является неконтролируемым, и достижение скоростей охлаждения, отличных от тех, которые предусмотрены для устройства, нелегко или постоянно достижимо.Хотя CoolCell® позволяет замораживать как криопробирки, так и контейнеры для клеточной терапии, такие как флакон Crystal Zenith, устройство Mr Frosty ограничивается стандартными криопробирками. Однако для обоих устройств ограничено количество криопробирок, которые могут быть заморожены в устройстве одновременно (6–12 флаконов / CoolCell® и 18 флаконов / Mr Frosty). CoolCell® FTS30 с большей производительностью обеспечивает повышенную производительность, но за счет более низкой, чем заявлено, скорости охлаждения в диапазоне от –10 до –40 ° C (рис. 1B).

  Рис. 1.

  Типичные кривые охлаждения для PCD. PCD работали в соответствии с инструкциями производителя. Термопары с тонкой проволокой (TWTc) вставляли через адаптированные крышки из PCD в центр специально адаптированных криопробирок, содержащих 1 мл CPA (10% DMSO в FBS). Затем они были помещены в PCD. Остальные пространства были заполнены криопробирками, содержащими 1 мл CPA. Все криопробирки уравновешивали при 20 ° C в течение от 20 до 30 минут перед переносом PCD в контролируемую морозильную камеру с контролируемым доступом до –80 ° C.Температура регистрировалась каждые 6 с в течение 5 ч с помощью многоканального регистратора данных. На рисунках показано положение TWTc. Средняя скорость охлаждения (MCR) между –10 и –40 ° C была основана на количестве технических повторов для каждого эксперимента, показанном на графике. В каждой группе было проведено минимум 3 эксперимента. A PCD Mr Frosty и CoolCell 12. B CoolCell FTS30 (обратите внимание на пониженную скорость охлаждения по сравнению с CoolCell 12). C Составные PCD. С двумя Mr Frostys обращались так же, как указано выше, но они были сложены друг на друга и помещены в одно отделение морозильной камеры с температурой –80 ° C.Из 4 показанных TWTc два были размещены в верхнем и два в нижнем PCD. Обратите внимание на значительно сниженную скорость охлаждения криопробирок в верхнем PCD.

  С точки зрения GMP, недорогие PCD представляют некоторые дополнительные сложности. Если они не модифицированы, они не позволяют контролировать температуру во время процесса замораживания, а также не обеспечивают температурный профиль в целях обеспечения качества. Кроме того, источник холода также должен быть аттестован для демонстрации сверхнизкой однородности и стабильности при заданной температуре, в то время как во время цикла охлаждения должна быть обеспечена безопасность, чтобы предотвратить возникновение тепловых переходных процессов из-за несанкционированного доступа к холодильнику -80 ° C.Небольшая специализированная, проверенная морозильная камера с контролируемой температурой, расположенная под столешницей до –80 ° C, часто является лучшим способом достижения необходимого уровня контроля. PCD также должны быть аттестованы, чтобы продемонстрировать соответствие заявленной скорости охлаждения.

  Mr Frosty, в частности, полагается на строгое соблюдение инструкций по эксплуатации для достижения указанной скорости охлаждения. В условиях, когда пространство морозильной камеры при сверхнизких температурах ограничено, соблюдение этих инструкций может быть затруднено, и штабелирование контейнеров не является чем-то необычным.Однако это приведет к значительному снижению скорости охлаждения (рис. 1C), и этого следует избегать. Также следует избегать частичной загрузки PCD, поскольку это может вызвать увеличение скорости охлаждения до 30% (данные не показаны).

  Автоматизированные CRF делятся на два основных типа: активируемые соленоидом, системы с питанием от LN ₂ (например, серия Kryo 560, www.planer.com; серия Cryomed, www.thermofisher.com; серия 2101, www.custombiogenics.com. ) и цикл Стирлинга, LN ₂ — свободные системы с приводом от теплового насоса (например,г., Viafreeze, www.asymptote.co.uk; Cryocell, www.strexcell.com). Все эти системы являются программируемыми и допускают многоступенчатые профили охлаждения, и большинство из них позволяет замораживать самые разные флаконы и пакеты.

  Системы с подачей LN ₂ способны контролировать охлаждение со скоростью примерно до 30 ° C / мин, хотя возможны и более высокие скорости. В процессе эксплуатации они могут достигать конечной температуры значительно ниже –100 ° C. Они основаны на испарении LN ₂ при попадании в охлаждающую камеру, которая затем выводится наружу через внешний порт.Это создает проблемы при использовании в чистом помещении как твердых частиц, так и микроорганизмов, присутствующих в нестерильном LN ₂ . Этого можно избежать, выводя газ из чистого помещения или перемещая криопробирки в прилегающую зону для замораживания. Однако конструкция камеры часто приводит к накоплению внутри нее водяного конденсата, который нелегко удалить и который может выступать в качестве потенциального источника роста микробов. По возможности перед замораживанием первичный контейнер следует перевернуть, чтобы предотвратить возможное загрязнение.

  CRF цикла Стирлинга обладают тем преимуществом, что их можно использовать в чистых помещениях, и они доступны в конфигурациях, которые обслуживают ряд размеров банков клеток в различных форматах. Более того, в отличие от систем с питанием LN ₂ , которые обычно работают от источника LN ₂ объемом от 30 до 50 л, эти системы с электрическим приводом могут поддерживать заданную конечную температуру неограниченно долго. Они тоже могут достигать минусовых температур около –100 ° C. Режим отвода тепла требует тесного контакта между криопробиркой / пакетом и морозильной пластиной, и хотя эти пластины могут быть изменены пользователем, их необходимо обработать, чтобы они точно соответствовали выбранной криопробирке / пакету.Ограничением этих систем является то, что скорость охлаждения образцов ограничена примерно 2 ° C / мин и ниже, поэтому типы ячеек с более быстрой оптимальной скоростью охлаждения не подходят для этих систем.

  Альтернативой CRF для двигателей LN ₂ и цикла Стирлинга является система Thermogenesis BioArchive® (www.cescatherapeutics.com). Это комбинированный роботизированный резервуар для хранения CRF и LN ₂ , используемый в основном для хранения клинических данных о пуповинной крови. В устройстве используются небольшие пакеты замкнутой системы, удерживаемые в металлических кассетах, которые охлаждаются в газовой фазе над средой хранения LN ₂ .Управление скоростью охлаждения осуществляется с помощью вентилятора с компьютерным управлением, который продувает сверххолодный газообразный азот через кассету. После замораживания кассеты автоматически опускаются в слоты для хранения и хранятся под LN ₂ .

  Недавно новый CRF (Cells Alive System, ABI Corp., Япония) был использован для криоконсервации плюрипотентных стволовых клеток [55]. Эта система включает в себя колеблющееся магнитное поле, и, хотя есть некоторые дискуссии о том, каким образом система улучшает результаты криоконсервации [56], недавно была выдвинута гипотеза, которая предлагает способ действия [57].Несмотря на эти альтернативы, CRF с кормлением LN ₂ и управляемым циклом Стирлинга остаются основным выбором для крупномасштабной криоконсервации клеточной терапии.

  Хранение и транспортировка

  За исключением Северной Америки, где криоконсервированные эритроциты для клинического использования хранятся при –80 ° C (хотя и не без неблагоприятных изменений в красных кровяных тельцах [58]), общепринято, что хранение при –80 ° C и выше приводит к прогрессирующему ухудшению качества и потере жизнеспособности.Было показано, что по сравнению с хранением при температуре ниже –135 ° C он хуже подходит для длительного хранения как клеток, так и тканей [59, 60]. Значительное ухудшение жизнеспособности было отмечено в мононуклеарных клетках периферической крови после 14 месяцев хранения при –80 ° C [61] и в PBSCs, где клоногенная способность утрачивалась всего за 5 месяцев [62]. Недавно было показано, что использование фиколла 70 в криопротекторной среде увеличивает срок хранения при –80 ° C в плюрипотентных стволовых клетках человека по крайней мере до 1 года [63]).

  Тем не менее, для большинства клеточных терапий длительное хранение с минимальным повреждением основного и рабочего банков клеток, а также конечного продукта потребует хранения значительно ниже температуры стеклования (T _г ) системы. обсуждаемый. Обычно принимается равным T _г воды (приблизительно –135 ° C) и обычно достигается хранением в LN ₂ или выше. Хотя хранение под LN ₂ обеспечивает стабильную сверхнизкую температуру, проблемы загрязнения [64] и хорошо задокументированный случай передачи гепатита B через LN ₂ [65] привели к изменению обычаев, так что хранение в газовая фаза выше LN ₂ в настоящее время является принятой и рекомендованной практикой.

  Аргумент против хранения в газовой фазе был основан на термической нестабильности, характерной для морозильных камер хранения старого образца; где температура –100 ° C в верхней части системы инвентаризации не была редкостью. Использование медного теплового шунта или теплопроводной стеллажной системы — распространенные методы уменьшения этих температурных градиентов. Изотермические сосуды, в которых LN ₂ содержится во внешней рубашке, окружающей камеру хранения, могут обеспечивать стабильную сверхнизкую температуру при условии, что в морозильную камеру постоянно поступает LN ₂ по запросу.Совсем недавно изменение конструкции морозильников LN ₂ в значительной степени устранило эти температурные градиенты, при этом стабильная температура под крышкой –180 ° C легко достижима (например, Chart MVE High Efficiency Series, www.chartindustries.com).

  Стоимость и сложность доставки по запросу LN ₂ могут быть значительными, а наличие надежных механических морозильников со сверхнизкими температурами, способных поддерживать стабильные температуры до –150 ° C, является реальной альтернативой LN _{. 2} хранения.Исследования PBSC показали сопоставимость, по крайней мере в среднесрочной перспективе (до 5 лет), между клетками, хранящимися в механической морозильной камере, и клетками, хранящимися в газовой фазе LN ₂ [66].

  При выборе между LN ₂ и механическим охлаждением следует учитывать дополнительные затраты, необходимые для отвода тепла, выделяемого механическими морозильниками, и возможные температурные переходные процессы, с которыми продукт может столкнуться во время доступа к морозильной камере. Хотя последнее также происходит при доступе к морозильникам LN ₂ , более низкая температура хранения, полученная в морозильнике LN ₂ , обеспечивает некоторую температурную «буферизацию» во время доступа.

  Одной из областей низкотемпературного хранения, которой до недавнего времени уделялось мало внимания, является тепловая история хранимого продукта и, в частности, тепловые переходные процессы, возникающие в течение срока его хранения. Температурные переходные процессы возникают с образцами, когда штативы и ящики для образцов извлекаются из стабильной низкотемпературной среды морозильной камеры для аудита или комплектования и отправки. Температурный переходный процесс, испытываемый любым данным образцом, будет зависеть не только от продолжительности времени, в течение которого он находится вне среды хранения, но также от положения образца в контейнере для образца и изоляции, придаваемой ему окружающими образцами (рис.2). Кроме того, образцы в окружающих стеллажах будут испытывать тепловые переходные процессы, когда нагретый стеллаж возвращается в морозильную камеру (данные не показаны). Таким образом, образцы будут испытывать множественные тепловые переходные процессы в течение своего срока службы, когда окружающий материал добавляется в морозильную камеру и выводится из нее.

  Рис. 2.

  Влияние на температуру криопробирок, расположенных в разных положениях внутри криопробирки, извлечения инвентарной башни, содержащей криобокс, из хранилища LN ₂ .Термопары с тонкой проволокой (TWTc) вставляли в адаптированные криопробирки, содержащие 1 мл CPA, и помещали либо на периферию, либо в центр криопробирки 5 × 5. Ящики были либо заполнены до отказа, либо оставались пустыми. Температура регистрировалась каждые 60 с. Криопробирки нагревали со скоростью от 6,8 ° C / мин до 11,5 ° C / мин в зависимости от их расположения в коробке и степени изоляции, обеспечиваемой окружающими криопробирками. На рисунках показано положение TWTc.

  Эффект тепловых переходных процессов во время хранения был предметом ряда недавних исследований, в которых наблюдались колебания температуры в замороженных хранимых мононуклеарных клетках периферической крови [67] или плацентарных МСК [68].В этих исследованиях, предназначенных для имитации событий в загруженных биохранилищах, клетки подвергались многократным температурным циклам между температурами газовой фазы LN ₂ и температурами до –60 ° C. Было обнаружено снижение извлечения и функциональности по сравнению со стабильным хранением в газовой фазе, когда количество циклов было> 20 и / или пиковая температура была выше -100 ° C. Было показано, что аналогичные эффекты циклического изменения температуры стеклования также влияют на структуру и работоспособность тканей [69].

  Устройства, которые ограничивают тепловые переходные процессы, поддерживая стойки внутри низкотемпературного кожуха во время доступа, становятся доступными как для криопробирок, так и для пакетов (например, Biostore ^TM III, www.brookeslifesciences.com). Однако в настоящее время они не могут быть дооснащены существующими морозильными камерами LN ₂ и не защищают любые другие криопробирки, хранящиеся в том же криобоксе во время процесса отбора. Хотя такие устройства могут иметь некоторые преимущества, следует рассмотреть возможность отделения основных банков ячеек от запасов, которые могут подвергаться частой активности, чтобы уменьшить или избежать тепловых переходных процессов.

  Аварийное восстановление

  Внешнее вторичное хранение материалов для целей аварийного восстановления считается передовой практикой и может быть нормативным требованием при подготовке материалов для клинического применения. Материал обычно поступает из основного банка клеток, но раньше для таких целей также могут храниться запасы прекурсоров, а также архивный материал из подготовленных партий или партий. Многие биобанки и биохранилища предлагают такие объекты по лицензии соответствующих регулирующих органов.Прежде чем выбрать объект, его следует оценить на соответствие нормативным требованиям в рамках процесса выбора. Документальные доказательства того, что морозильные камеры для хранения прошли валидацию перед использованием, должны быть доступны для ознакомления, а в морозильных камерах следует постоянно контролировать температуру, при этом вывод температуры должен регулярно предоставляться пользователю в соответствии с соглашением об уровне обслуживания. Предприятие должно работать в соответствии с надежной системой управления качеством с документированными процедурами расследования и сообщения конечному пользователю о нежелательных явлениях.Доступ к помещению и морозильным камерам для хранения должен быть ограничен и контролироваться.

  Транспортировка

  Целостность образца и температурная стабильность также необходимо учитывать во время транспортировки, будь то внутри помещения (чтобы ограничить так называемое воздушное время между извлечением из хранилища и оттаиванием) [70] или во время транспортировки между площадками. Варианты в основном ограничены сухим льдом и LN ₂ , хотя доступны портативные криокулеры, использующие тот же принцип, что и CRF цикла Стирлинга (например,г., Stirling Shuttle ^TM , www.stirlingultracold.com).

  Для транспортировки при температуре около –196 ° C (необходимо для предотвращения де-витрификации метастабильного застеклованного материала) доступны сухие грузоотправители LN ₂ , в которых жидкость абсорбируется инертным материалом молекулярного сита, которые будет поддерживать температуру до 14 дней при полной зарядке. Доступны различные размеры, некоторые из них подходят для внутрилабораторного использования (например, MVE Minimoover, www.chartindustries.com). Другие системы, также использующие LN ₂ , были разработаны специально для перемещения образцов по лаборатории (Cryopod ^TM , www.brookeslifesciences.com).

  Транспортировка замороженных клеток на сухом льду в изолированных боксах при –80 ° C, пожалуй, самый распространенный метод транспортировки замороженных клеток. В отличие от сухих грузоотправителей, термотранспортные коробки обычно поддерживают температуру только в течение 24–48 часов, в зависимости от качества изоляции и количества используемого сухого льда, хотя некоторые коробки обеспечивают температурную стабильность до 120 часов (например, серия сухого льда PharmaTherm, www. intelsius.com).

  Не менее важным, чем поддержание стабильной температуры, является возможность предоставить доказательства этого как для регуляторов, так и для конечного пользователя.Многие сухие грузоотправители доступны с крышками для регистрации температуры, а небольшие портативные регистраторы температуры доступны для использования как с сухими грузоотправителями, так и с транспортными ящиками для сухого льда. Устройства химической сигнализации (например, индикаторы теплового воздействия Cryoguard ^TM , www.cryoguard.com) могут использоваться вместе с такими системами регистрации данных, чтобы предоставить конечным пользователям визуальные доказательства того, что продукт поддерживает желаемую температуру во время транспортировки.

  Хотя нет никаких ожиданий, что термотранспортные коробки будут возвращены получателем, это не относится к дорогим сухим грузоотправителям.Невозврат сухого грузоотправителя или его повреждение при транспортировке будет иметь значительные финансовые последствия. Следовательно, если было принято решение распространять материал с использованием сухих грузоотправителей, следует рассмотреть возможность использования сторонних логистических компаний, которые предоставляют пакеты для сухих грузоотправителей с регистрацией температуры (например, Cryoport Express®, www.cryoport.com). Это поможет снять часть логистической и административной нагрузки, связанной с транспортировкой сухими грузоотправителями, а также поможет обеспечить соблюдение сложных национальных и международных правил перевозки (подробную информацию см. В Simione and Sharp [71]).

  Размораживание и элюирование CPA

  Как и скорость охлаждения, скорость нагревания может иметь значительное влияние на восстановление клеток, при этом клетки могут быть повреждены из-за использования неподходящих протоколов размораживания и элюирования CPA. Важно быстрое согревание. Он не только сокращает время воздействия повреждающих концентраций растворенных веществ при таянии льда во время повторного нагревания, но также предотвращает потенциальное повреждение, вызванное перекристаллизацией внутриклеточного льда. Здесь скорость, необходимая для предотвращения рекристаллизации, по крайней мере на порядок больше, чем минимальная скорость охлаждения, приводящая к значительной IIF [13].Скорость нагрева имеет особое значение при рассмотрении вопроса о переносе клеток из замороженного хранилища в место, где они должны быть разморожены. Даже короткие периоды времени на воздухе, в течение которых клетки подвергаются пассивному нагреванию с относительно медленной скоростью, могут вызвать повреждение клеток, особенно из-за IIF.

  Самым простым и легким способом достижения быстрого нагрева является использование водяной бани 37 ° C. Практически повсеместное использование этой технологии, от лаборатории до криоконсервированных тканевых аллотрансплантатов в операционной и оттаивания гемопоэтических стволовых клеток у постели больного [72], привело к тому, что большинство протоколов криоконсервации были оптимизированы на фоне Скорость потепления достигается за счет его использования.Однако использование такого метода в среде GMP поднимает вопрос о потенциальном загрязнении и логистических проблемах при поддержании стерильности. Более того, возможность теплового разгона после того, как система расплавится, с сопутствующей опасностью подвергнуть клетки воздействию CPA при повышенных температурах, является проблематичной.

  Сам процесс разогрева является нелинейным, с начальной высокой скоростью нагревания, которая уступает место гораздо более медленной скорости из-за большого теплового воздействия (скрытой теплоты плавления), необходимого при фазовом переходе.Необходимость управлять этим процессом как можно быстрее требует повышенных температур оттаивания, которые должны быть сбалансированы с учетом опасности теплового разгона. По этой причине стандартной практикой является встряхивание образца во время оттаивания для уменьшения температурных градиентов и удаление его из водяной бани, как только визуальный осмотр покажет рассеяние последних остатков ледяного шара. В конце оттаивания образцы должны быть холодными, а не теплыми.

  Был принят ряд стратегий, позволяющих избежать использования водяной бани.Типичные скорости потепления, производимые некоторыми из этих альтернатив, показаны в таблице 2. Скорости потепления показаны в трех диапазонах: от –150 до –80 ° C (т. Е. Выше T _г и перекристаллизация льда), от –80 до –20 ° C (воздействие повышенных концентраций растворенных веществ) и от –20 до 0 ° C. Пассивное нагревание на воздухе на столе или в инкубаторе 37 ° C — неподходящая альтернатива и может привести к снижению жизнеспособности [70]. Хотя замена воды в водяной бане на теплопроводящие шарики приводит к более быстрому нагреванию, это ненадежно из-за температурных градиентов в ванне и поперек нее (данные не показаны).Использование CoolRack ^TM (www.biocision.com), сделанного из теплопроводящего материала, который предварительно нагревается и хранится в инкубаторе 37 ° C, обеспечивает скорость нагрева, аналогичную той, которая обеспечивается Biocision ThawStar ^TM ( www.asterobio.com), автоматизированная система сухого размораживания, обеспечивающая воспроизводимое и быстрое нагревание.

  Таблица 2.

  Скорость нагрева, достигаемая с использованием различных устройств для оттаивания ^a

  С точки зрения обеспечения качества, автоматизированные системы, которые обеспечивают стандартизованную воспроизводимую скорость нагрева и, в некоторых случаях, считывание температуры в процессе оттаивания для целей отслеживания предпочтительны.В дополнение к ThawStar ^TM , который доступен в различных форматах флаконов, есть автоматизированные системы регистрации данных от Cook Regentec (CellSeal®, www.cookregentec.com) и обещанные GE Healthcare (VIAThaw SC).

  Системы сухого размораживания пакетов в течение некоторого времени были обычным явлением в секторе банков крови, и в дополнение к используемым там устройствам для замороженных пакетов доступны автоматизированные системы размораживания, аналогичные системам для криопробирок (VIAThaw CB1000, www.asymptote .co.uk; SmartThaw ^TM , www.cpsibiotech.com; ThawStar CB, www.astrobio.com). Все они могут быть использованы для размораживания гемопоэтических клеток и других клеток, замороженных в пакетах, и, как было показано, обеспечивают сравнимое восстановление после размораживания после размораживания на водяной бане [73].

  Элюирование CPA

  После размораживания клетки снова будут подвергаться воздействию CPA с сопутствующей опасностью химической токсичности при хранении при слишком высокой температуре. Это можно смягчить, снизив температуру (т.е. поддерживая клетки на уровне около 4 ° C), используя более низкую концентрацию CPA во время замораживания (при условии, что она обеспечивает оптимальную криозащиту) или элюируя его из системы.Опасность перегрева может быть более значительной, когда речь идет о коммерческих CPA, использующих транспортные средства «внутриклеточного типа». Они созданы для гипотермической поддержки, и клетки могут быть более чувствительны к этим растворам в условиях нормотермической культуры после размораживания.

  Как уже обсуждалось, элюирование CPA, если его проводить ненадлежащим образом, может привести к осмотическому шоку и потере жизнеспособности, поскольку клетки набухают и разрываются. Протоколы одноэтапной элюции, такие как центрифугирование и немедленное ресуспендирование в среде без CPA, должны быть исследованы на предмет их влияния на жизнеспособность после оттаивания, и следует рассмотреть пошаговые протоколы или использование «осмотических буферов» (например.g., сахароза, маннитол) для уменьшения набухания клеток во время удаления CPA.

  Описаны автоматизированные системы отмывки GMP [74]. Однако эти системы, основанные на непрерывном центрифугировании или фильтрации с тангенциальным потоком, подходят только для концентрирования клеток из больших объемов перед процессом криоконсервации. Автоматическая промывочная система для удаления CPA и клеточного мусора была недавно описана [75], но еще не доступна в продаже (www.closedcellsystems.com).

  Использование добавок

  Помимо включения материалов в CPA для контроля образования льда, соединения могут быть добавлены либо в CPA, либо в культуральную среду после размораживания, чтобы контролировать индуцированную криоконсервацией гибель клеток с отсроченным началом через стратегия целенаправленного апоптотического контроля [18, 50].Такие соединения включают акцепторы свободных радикалов, хелаторы ионов и ингибиторы протеаз, а также как ингибиторы каспаз, так и ингибиторы Rho-киназы (ROCK), которые нацелены на апоптотический каскад. Было показано, что многие из них уменьшают апоптоз, вызванный криоконсервацией, в ПСХ [18], и по крайней мере один из них, ингибитор ROCK пинацидил, является одобренным FDA соединением [76].

  Оценка жизнеспособности

  Неотъемлемой частью оптимизации процесса криоконсервации является применение надежного и репрезентативного набора тестов на жизнеспособность и функциональность, которые точно оценивают состояние клеток после размораживания.Выбор времени для применения этих анализов после размораживания в настоящее время рассматривается как решающий, если необходимо добиться надежной оценки параметров, управляющих процессом криоконсервации. Более того, выбор анализов должен отражать функциональные результаты, ожидаемые от клетки или клеточной терапии, и возможность отбора субпопуляций посредством геномных и эпигенетических изменений в выжившей клеточной популяции [63, 77].

  Baust et al. [70] выступили за четырехуровневый подход к оценке жизнеспособности, который включает оценку целостности мембраны, молекулярных (апоптотических / некротических) механизмов, функциональности (применимой, где это возможно, к функциям, которые представляют предполагаемое использование клеток) и «биохимический анализ». механизмы »(включая геномные, эпигенетические и протеомные анализы).Этот многоуровневый подход хорошо соответствует нормативным требованиям для демонстрации идентичности, чистоты и стабильности продуктов клеточной терапии [25].

  Помимо выбора анализа, время нанесения также имеет решающее значение для получения точной картины жизнеспособности после оттаивания. Оценка сразу после оттаивания, вероятно, приведет к переоценке восстановления клеток, поскольку значительная степень гибели клеток произойдет через 24–48 часов после оттаивания. Эта отсроченная гибель клеток, проявление апоптотических и некротических процессов, будет пропущена, если жизнеспособность будет оценена сразу после оттаивания или после нескольких пассажей в культуре.

  «Здоровье» клеток, попадающих в процесс криоконсервации, будет влиять на результат после размораживания. Было показано, что клетки, подвергшиеся стрессу из-за неоптимальных условий культивирования до криоконсервации, имели сниженную жизнеспособность и функцию после оттаивания по сравнению с нестрессированными клетками [70]. Хотя перед криоконсервацией обычно используют простой анализ, такой как трипановый синий, он сам по себе может не предоставить достаточной информации о «качестве» клеток, особенно в случае PSC, где сохраняется способность к самообновлению и дифференцировке. необходимы.Это свидетельствует в пользу применения многоуровневого подхода или, по крайней мере, его упрощенной версии к клеткам до криоконсервации, а также после размораживания.

  Также важно понимание анализа и контекста, в котором он применяется. Простые анализы, такие как анализ целостности мембраны трипановым синим, могут недооценивать или переоценивать жизнеспособность в зависимости от текучести мембраны после оттаивания, типа клеток и продолжительности воздействия красителя. Использование Alamar Blue, популярного нетоксичного индикатора окислительно-восстановительного потенциала для анализа клеточного метаболизма (и, следовательно, выживаемости клеток), может дать ложные результаты в присутствии восстановленного глутатиона (компонента некоторых растворов для хранения при гипотермии) [78].

  Выводы

  Производство и доставка продуктов клеточной терапии неизбежно потребует криоконсервации и замороженного хранения клеточных исходных материалов, промежуточных продуктов и / или конечного продукта. Оптимизация условий культивирования для обеспечения максимального выхода и стабильного конечного продукта рассматривается как необходимая часть разработки и валидации процесса, однако часто процесс криоконсервации в значительной степени игнорируется, а субоптимальная жизнеспособность после оттаивания допускается из-за емкости оставшихся жизнеспособных ячейки для расширения.Однако неоптимальная криоконсервация не только снижает жизнеспособность клеток, но также может привести к изменчивости от партии к партии и, возможно, к генетическим и эпигенетическим изменениям, которые могут поставить под угрозу производственный процесс, в то время как неблагоприятные условия хранения могут снизить эффективность конечного продукта.

  Таким образом, оптимизация процесса криоконсервации так же важна, как и оптимизация условий культивирования, и внимание ко всем элементам холодовой цепи необходимо для поддержания жизнеспособности и функциональности клеток.Необходимость клеточной терапии для соответствия нормативным требованиям означает, что большую часть материалов и оборудования, предназначенных для использования в лабораториях, необходимо будет повторно оценить на предмет соответствия назначению. Оборудование потребует формальной валидации, в то время как CPA, другие вспомогательные вещества и расходные материалы необходимо будет оценить риск на предмет их пригодности для использования в терапевтических целях. Протоколы криоконсервации должны быть разработаны с учетом потребностей как регулирующих органов, так и конечных пользователей, а не ретроспективно разработаны на основе лабораторных протоколов, не подходящих для конечного терапевтического применения.Развитие контейнерных технологий в сочетании с коммерчески доступными CPA, соответствующими GMP, новыми и адаптированными технологиями для замораживания и оттаивания, а также улучшениями в низкотемпературном хранении и распределении теперь обеспечивают платформу, на которой оптимизированные протоколы криоконсервации могут эффективно способствовать будущему развитию клеточная терапия.

  Заявление об этике

  Автор не имеет этических конфликтов, которые следует раскрывать.

  Заявление о раскрытии информации

  Автор не заявляет о конфликте интересов.

  Список литературы

  1. Мейсон С., Даннил П. Краткое определение регенеративной медицины. Regen Med. 2008, январь; 3 (1): 1–5.
  2. Комитет Палаты лордов по науке и технологиям.Регенеративная медицина, HL23, первый отчет сессии 2013-14. Стационарный офис; 2013 г., ISBN 9780108551109.
  3. Mount NM, Ward SJ, Kefalas P, Hyllner J. Классификация технологий клеточной терапии и проблемы трансляции. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2015 Октябрь; 370 (1680): 20150017.
  4. Лекарственные средства современной терапии. https://www.ema.europa.eu/en/human-regulatory/overview/advanced-therapy-medicinal-products
  5. Клеточная терапия.https://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/CellularGeneTherapyProducts/default.htm
  6. Петриччиани Дж., Хаякава Т., Стейси Дж., Трувин Дж. Х., Кнежевич И. Научные соображения для регуляторной оценки продуктов клеточной терапии. Биологические препараты. 2017 ноя; 50: 20–6.
  7. Европейское агентство по лекарственным средствам.Годовой отчет 2017. https://www.ema.europa.eu/documents/annual-report/2017-annual-report-european-medicines-agency_en.pdf
  8. Агентство по контролю за продуктами и лекарствами. Утвержденные продукты для клеточной и генной терапии. https://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/CellularGeneTherapyProducts/ApprovedProducts/default.htm
  9. База данных клинических исследований. Доступно по адресу: https://www.clinicaltrials.gov (с использованием поисковых терминов «мезенхимальные стволовые клетки» И «аллогенные» И «терапия стволовыми клетками» И «человеческая» для испытаний МСК и поисковые запросы «ES-клетки» ИЛИ «эмбриональные стволовые клетки» ИЛИ «iPS-клетки» ИЛИ «индуцированные плюрипотентные клетки» И «интервенционные исследования» для испытаний hESC / iPSC).По состоянию на январь 2019 г.
  10. Мартин У. Терапевтическое применение плюрипотентных стволовых клеток: проблемы и риски. Фронт Мед (Лозанна). 2017 Декабрь; 4: 229.
  11. Мейсон С., Бриндли Д.А., Калм-Сеймур Е.Дж., Дэви Н.Л.Индустрия клеточной терапии: глобальный бизнес на миллиард долларов с неограниченным потенциалом. Regen Med. 2011 Май; 6 (3): 265–72.
  12. Мендичино М., Бейли А.М., Воннакотт К., Пури Р.К., Бауэр С.Р. Характеристика продуктов на основе МСК для клинических испытаний: взгляд FDA. Стволовая клетка. 2014 Февраль; 14 (2): 141–5.
  13. Льюис Дж. К., Бишоф Дж. К., Браславский И., Брокбанк К. Г., Фахи Дж. М., Фуллер Б. Дж. И др. Грандиозные проблемы банкинга органов: материалы первого глобального саммита по сложной криоконсервации тканей. Криобиология. 2016 Апрель; 72 (2): 169–82.
  14. Стейси Г.Н., Коннон С.Дж., Купман К., Диксон А.Дж., Фуллер Б., Хант С.Дж. и др.Сохранение и стабильность продуктов клеточной терапии: рекомендации экспертного семинара. Regen Med. Июль 2017; 12 (5): 553–64.
  15. Мазур П. Принципы криобиологии. В: Fuller BJ, Lane N, Benson EE, редакторы. Жизнь в замороженном состоянии. Бока-Ратон: CRC Press; 2004. С. 3–65.
  16. Малдрю К., Акер Дж. П., Эллиот Дж. А., МакГанн Л. Э. Переход от воды к льду: последствия для живых клеток. В: Fuller BJ, Lane N, Benson EE, редакторы. Жизнь в замороженном состоянии. Бока-Ратон: CRC Press; 2004. С. 67–108.
  17. Фахи GM, Вук Б.Принципы криоконсервации путем витрификации. Методы Мол биол. 2015; 1257: 21–82.
  18. Охота на CJ. Криоконсервация: стеклование и охлаждение с контролируемой скоростью. Методы Мол биол. 2017; 1590: 41–77.
  19. Охота на CJ.Криоконсервация стволовых клеток человека для клинического применения: обзор. Transfus Med Hemother. 2011. 38 (2): 107–23.
  20. Rajamani K, Li Y-S, Hseih D-K, Lin S-Z, Harn H-J, Chiou T.W. Генетическая и эпигенетическая нестабильность стволовых клеток. Трансплантация клеток. 2014; 23: 417–33.
  21. Hotchkiss RS, Strasser A, McDunn JE, Swanson PE.Смерть клетки. N Engl J Med. Октябрь 2009 г.; 361 (16): 1570–83.
  22. Hunt CJ, Pegg DE, Armitage SE. Оптимизация протоколов криоконсервации гематопоэтических клеток-предшественников: методологический подход для пуповинной крови. Крио письма. Март-апрель 2006 г.; 27 (2): 73–86.
  23. Митчелл П.Д., Рэтклифф Э., Хурд П., Уильямс Д.Дж., Томас Р.Дж.Качественный подход к снижению риска и оптимизации процессов криоконсервации эмбриональных стволовых клеток человека. Tissue Eng Часть C Методы. 2014 декабрь; 20 (12): 941–50.
  24. Кларк Д., Стэнтон Дж., Пауэрс Д., Карниели О., Нахум С., Абрахам Е. и др. Управление частицами в клеточной терапии: руководство по передовой практике.Цитотерапия. 2016 Сен; 18 (9): 1063–76.
  25. Эндрюс П.В., Бейкер Д., Бенвинисти Н., Миранда Б., Брюс К., Брюстле О. и др. Вопросы, которые следует учитывать при разработке семенного фонда плюрипотентных стволовых клеток для клинического применения: Международная инициатива по банку стволовых клеток (ISCBI). Regen Med.2015; 10 (2 доп.): 1–44.
  26. Чен Х.И., Цай Ц.Д., Ван Х.Т., Хван С.М. Криопробирка с частичным мембранным уплотнением может предотвратить проникновение жидкого азота при хранении под водой. Криобиология. 2006 Октябрь; 53 (2): 283–7.
  27. Вудс Э.Дж., Тирумала С.Рекомендации по упаковке для биоконсервации. Transfus Med Hemother. 2011. 38 (2): 149–56.
  28. Вудс Э.Дж., Багчи А., Гебель В.С., Виливалам В.Д., Виливалам В.Д. Система контейнеров для коммерческого производства криоконсервированных продуктов клеточной терапии. Regen Med. Июль 2010 г.; 5 (4): 659–67.
  29. Левинсон Ю., Эйлон Ю., Хейманн А. Зарецкий-Риц, Карнейли О. Элементы основы для интеллектуального масштабирования клеточной терапии. Bioprocess Int. 2015. Доступно по адресу: https://bioprocessintl.com/manufacturing/cell-therapies/foundation-elements-for-cell-therapy-manufacturing-smart-scaling/.
  30. Усилители КДж, Джонс М, Бейкер Д., Мур HD. Криоконсервация in situ человеческих эмбриональных стволовых клеток в кассетах для культивирования с газопроницаемой мембраной для получения высокого выхода после размораживания и надлежащей производственной практики. Криобиология. 2010 июн; 60 (3): 344–50.
  31. Heidemann R, Lünse S, Tran D, Zhang C.Характеристика параметров банка клеток для криоконсервации линий клеток млекопитающих в криопакетах на 100 мл. Biotechnol Prog. Июль-август 2010 г .; 26 (4): 1154–63.
  32. Spoerl S, Peter R, Wäscher D, Verbeek M, Menzel H, Peschel C и др. Многолетний опыт криоконсервации мобилизованных стволовых клеток периферической крови с использованием системы закрытых пакетов: технология с потенциалом для более широкого применения.Переливание. 2015 ноя; 55 (11): 2702–8.
  33. Spoerl S, Peter R, Krackhardt AM. Криоконсервация в закрытых мешках как альтернатива чистым помещениям для стволовых клеток периферической крови. Adv Exp Med Biol. 2016; 951: 67–76.
  34. Сарджент Б.Прямой посев биореакторов клетками СНО из пакетов с замороженными семенами, чтобы исключить непрерывные потоки семян и улучшить использование оборудования. Сообщение в блоге 2017 г. 24 января. Доступно по адресу: https://cellculturedish.com/direct-inoculum-of-bioreactors-with-cho-cells-from-frozen-seed-bags-to-eliminate-continual-seed-trains-and -улучшить-использование-объекта /.
  35. Кулешова Л.Л., Тан ФК, Магалхаес М, Гук С.С., Ли К.Х., Доу Г.С.Эффективная криоконсервация нервных стволовых клеток и клеток-предшественников без сыворотки или белков путем витрификации. Трансплантация клеток. 2009. 18 (2): 135–44.
  36. Нишигаки Т., Терамура Ю., Суэмори Х., Ивата Х. Криоконсервация эмбриональных стволовых клеток приматов с химически определенным раствором без Me2SO.Криобиология. 2010 Апрель; 60 (2): 159–64.
  37. Kaindl J, Meiser I, Majer J, Sommer A, Krach F, Katsen-Globa A, et al. Увеличение масштаба криоконсервации hiPSCs и нейронных производных: двухцентровое исследование с использованием адгезивной витрификации. Стволовые клетки Transl Med. Март 2019; 8 (3): 247–59.
  38. Эллиотт Г.Д., Ван С., Фуллер Б.Дж.Криопротекторы: обзор действия и применения криозащитных растворенных веществ, которые модулируют восстановление клеток при сверхнизких температурах. Криобиология. 2017 июн; 76: 74–91.
  39. Hunt CJ, Armitage SE, Pegg DE. Криоконсервация пуповинной крови: 2. Толерантность клеток CD34 (+) к мультимолярному диметилсульфоксиду и влияние скорости охлаждения на восстановление после замораживания и оттаивания.Криобиология. 2003 февраль; 46 (1): 76–87.
  40. Лучший БП. Токсичность криопротекторов: факты, проблемы и вопросы. Rejuvenation Res. 2015 Октябрь; 18 (5): 422–36.
  41. Пал Р., Мамиди М.К., Дас А.К., Бхонде Р.Разнообразные эффекты диметилсульфоксида (ДМСО) на дифференцировочный потенциал эмбриональных стволовых клеток человека. Arch Toxicol. 2012 Апрель; 86 (4): 651–61.
  42. Иватани М., Икегами К., Кременска Ю., Хаттори Н., Танака С., Яги С. и др. Диметилсульфоксид влияет на эпигенетический профиль эмбрионального тела мыши.Стволовые клетки. 2006 ноябрь; 24 (11): 2549–56.
  43. Коике М., Ишино К., Коно Ю., Тачикава Т., Картасова Т., Куроки Т. и др. ДМСО вызывает апоптоз в кератиноцитах человека, трансформированных SV40, но не в нормальных кератиноцитах. Cancer Lett. 1996 ноя; 108 (2): 185–93.
  44. Виндрам П., Моррис Т.С., Дрейк М.Б., Нидервизер Д., Рууту Т.; Подкомитет по осложнениям Рабочей группы EBMT по хроническому лейкозу.Вариации использования диметилсульфоксида при трансплантации стволовых клеток: обзор центров EBMT. Пересадка костного мозга. 2005 Октябрь; 36 (7): 601–3.
  45. Икеда К., Ото Х., Окуяма Й., Ямада-Фудзивара М., Канамори Х., Фудзивара С.И. и др. Неблагоприятные события, связанные с инфузией продуктов гемопоэтических стволовых клеток: проспективное и многоцентровое надзорное исследование.Transfus Med Rev.2018 июн; 32 (3): 186–94.
  46. Сарджент Б. Использование сыворотки животных в клинической трансляции hMSC. Сообщение в блоге, 2016 г., 18 февраля. Доступно по адресу: https://cellculturedish.com/the-use-of-animal-serum-in-the-clinical-translation-of-hmscs/.
  47. Европейское агентство по лекарственным средствам.Руководство по использованию бычьей сыворотки в производстве биологических лекарственных препаратов для человека EMA / CHMP / BWP / 457920/2012, ред. 1. 2013 г. Доступно по адресу: https://www.ema.europa.eu/documents/scientific-guideline/ руководство-использование-бычья-сыворотка-производство-человеческие-биологические-лекарственные-продукты_en.pdf.
  48. Агентство по контролю за продуктами и лекарствами.Руководство для обозревателей и спонсоров FDA. Содержание и обзор информации о химии, производстве и контроле (CMC) для новых исследовательских приложений (IND) для терапии соматических клеток человека. Доступно по адресу: https://www.fda.gov/biologicsbloodvaccines/guidancecomplianceregulatoryinformation/guidances/cellularandgenetherapy/default.htm.
  49. Ван Ц., Сяо Р., Цао Ю.Л., Инь Х.Й.Оценка лизата тромбоцитов человека и диметилсульфоксида как криопротекторов для криоконсервации стволовых клеток, полученных из жировой ткани человека. Biochem Biophys Res Commun. 2017 сентябрь; 491 (1): 198–203.
  50. Бауст Дж. М., Корвин В., Снайдер К. К., Ван Бускерк Р., Бауст Дж. Г.. Криоконсервация: эволюция молекулярных стратегий.Adv Exp Med Biol. 2016; 951: 13–29.
  51. Бауст Дж. Г., Снайдер К. К., Ван Бускерк Р., Бауст Дж. М.. Интеграция молекулярного контроля для улучшения результатов криоконсервации. Биопресерв Биобанк. 2017 Апрель; 15 (2): 134–41.
  52. Франкс Ф.Свойства водных растворов при минусовых температурах. В: Франкс Ф, редактор. Вода компрессионный трактат. Том 7. Нью-Йорк, Лондон: Пленум Пресс; 1982. С. 215–338.
  53. Моррис Г.Дж., Эктон Э. Контролируемое зародышеобразование льда при криоконсервации — обзор. Криобиология. 2013 Апрель; 66 (2): 85–92.
  54. Лаутербек Л., Хофманн Н., Мюллер Т., Гласмахер Б. Активный контроль температуры нуклеации увеличивает выживаемость при замораживании мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток. Криобиология. 2015 декабрь; 71 (3): 384–90.
  55. Nishiyama Y, Iwanami A, Kohyama J, Itakura G, Kawabata S, Sugai K, et al.Безопасный и эффективный метод криоконсервации индуцированных человеческими плюрипотентными стволовыми клетками нервных стволовых клеток и клеток-предшественников с помощью запрограммированного морозильника с магнитным полем. Neurosci Res. 2016 июн; 107: 20–9.
  56. Ваук Б. Электрические и магнитные поля в криоконсервации. Криобиология.2012 июн; 64 (3): 301–3.
  57. Кобаяши А, Голаш Х.Н., Киршвинк Я. Первая проверка гипотезы о гетерогенном зародышеобразовании кристаллов льда на основе биогенного магнетита при криоконсервации. Криобиология. 2016 июн; 72 (3): 216–24.
  58. Асгар В., Эль-Ассаль Р., Шафи Х., Анчан Р.М., Демирчи Ю.Сохранение человеческих клеток для регенеративной, репродуктивной и трансфузионной медицины. Biotechnol J. Июль 2014; 9 (7): 895–903.
  59. Massie I, Selden C, Hodgson H, Fuller B. Температуры хранения для доставки холодовой цепи в клеточной терапии: исследование сфероидов клеток печени, инкапсулированных в альгинат, которые хранятся при -80 ° C или -170 ° C в течение до 1 года.Tissue Eng Часть C Методы. 2013 Март; 19 (3): 189–95.
  60. Brockbank KG, Carpenter JF, Dawson PE. Влияние температуры хранения на жизнеспособные биопротезы клапанов сердца. Криобиология. 1992 Октябрь; 29 (5): 537–42.
  61. Ян Дж., Диаз Н., Адельсбергер Дж., Чжоу Х, Стивенс Р., Руперт А. и др.Влияние температуры хранения на экспрессию гена PBMC. BMC Immunol. 2016 Март; 17 (1): 6.
  62. Sputtek A, Nowicki B, Rowe A, Kuehnl P. Долгосрочная криоконсервация клеток-предшественников периферической крови человека: влияние температуры хранения (-80C vs
• Юань И, Ян И, Тиан И, Пак Дж, Дай А., Робертс Р.М. и др.Эффективная долговременная криоконсервация плюрипотентных стволовых клеток при -80 ° C. Sci Rep.2016 Октябрь; 6 (1): 34476.
• Маццилли Ф., Дельфино М., Имброгно Н., Элиа Дж., Дондеро Ф. Выживание микроорганизмов в криохранилище человеческой спермы. Банк клеточной ткани. 2006; 7 (2): 75–9.
• Хокинс А.Е., Цукерман М.А., Бриггс М., Гилсон Р.Дж., Голдстоун А.Х., Бринк Н.С. и др.Анализ нуклеотидной последовательности гепатита B: связь вспышки острого гепатита B с загрязнением резервуара для криоконсервации. J Virol Methods. 1996 июн; 60 (1): 81–8.
• McCullough J, Haley R, Clay M, Hubel A, Lindgren B, Moroff G. Долгосрочное хранение замороженных и хранимых стволовых клеток периферической крови с использованием обычного метода жидкого азота по сравнению с клетками, замороженными и хранящимися в механической морозильной камере.Переливание. 2010 Апрель; 50 (4): 808–19.
• Анхель С., фон Бризен Х., О Й. Дж., Баллер М.К., Циммерманн Х., Германн А. На пути к оптимальному криоконсервации и хранению для достижения высокого восстановления клеток и поддержания жизнеспособности клеток и функциональности Т-клеток. Биопресерв Биобанк. 2016 декабрь; 14 (6): 539–47.
• Погожих Д., Погожих О., Прокопюк В., Кулешова Л., Гольцев А., Блащик Р. и др. Влияние колебаний температуры во время криоконсервации на жизненно важные параметры, потенциал дифференцировки и экспрессию трансгенов мультипотентных стромальных клеток плаценты. Stem Cell Res Ther. 2017 Март; 8 (1): 66.
• Hunt CJ, Song YC, Bateson EA, Pegg DE. Переломы криоконсервированных артерий. Криобиология. 1994 Октябрь; 31 (5): 506–15.
• Бауст Дж. М., Кэмпбелл Л. Х., Харбелл Дж. В..Лучшие методы криоконсервации, размораживания и восстановления, а также оценки клеток. In vitro Cell Dev Biol Anim. 2017 декабрь; 53 (10): 855–71.
• Симионе Ф., Шарп Т. Лучшие методы хранения и доставки криоконсервированных клеток. In vitro Cell Dev Biol Anim. 2017 декабрь; 53 (10): 888–95.
• Lecchi L, Giovanelli S, Gagliardi B, Pezzali I, Ratti I, Marconi M.Обновленная информация о методах криоконсервации и оттаивания гемопоэтических стволовых клеток. Transfus Apheresis Sci. 2016 июнь; 54 (3): 324–36.
• Реллиг К., Бабац Дж., Вагнер I, Майвальд А., Шварце В., Энингер Г. и др. Размораживание криоконсервированной мобилизованной периферической крови — сравнение водяной ванны и устройства для сухого подогрева.Цитотерапия. 2002. 4 (6): 551–5.
• Кэмпбелл А., Бриева Т., Равив Л., Роули Дж., Нисс К., Брандвейн Х и др. Краткий обзор: соображения разработки процесса для клеточной терапии. Стволовые клетки Transl Med. 2015 Октябрь; 4 (10): 1155–63.
• Тостос Р., Доджсон Дж. Р., Вейл Б., Геронтас С., Мейсон С., Вераич Ф.Новаторская система фильтрации для мытья посуды в местах ухода за продуктами клеточной терапии. J Tissue Eng Regen Med. 2017 ноя; 11 (11): 3157–67.
• Варварский I, Джонс М., Бюхнер К., Бейкер Д., Эндрюс П. У., Мур HD. Пинацидил увеличивает выживаемость криоконсервированных эмбриональных стволовых клеток человека. Криобиология.2011 декабрь; 63 (3): 298–305.
• Ян Б., Парша К., Шаар К., Сатани Н., Си Х, Ароновски Дж. И др. Криоконсервация мононуклеарных клеток костного мозга изменяет их жизнеспособность и субпопуляционный состав, но не их лечебные эффекты в модели инсульта грызунов. Stem Cells Int. 2016; 2016: 5876836.
• Тейлор MJ, Кэмпбелл LH. Использование индикаторов окислительно-восстановительного потенциала, таких как Alamar Blue, в присутствии современных носителей информации, содержащих глутатион: поучительная история. Криобиология. 2000; 41: 370–1.

Авторские права: Все права защищены.Никакая часть данной публикации не может быть переведена на другие языки, воспроизведена или использована в любой форме или любыми средствами, электронными или механическими, включая фотокопирование, запись, микрокопирование, или с помощью какой-либо системы хранения и поиска информации, без письменного разрешения издателя. .
Дозировка лекарств: авторы и издатель приложили все усилия, чтобы гарантировать, что выбор и дозировка лекарств, указанные в этом тексте, соответствуют текущим рекомендациям и практике на момент публикации.Тем не менее, ввиду продолжающихся исследований, изменений в правительственных постановлениях и постоянного потока информации, касающейся лекарственной терапии и реакций на них, читателю рекомендуется проверять листок-вкладыш для каждого препарата на предмет любых изменений показаний и дозировки, а также дополнительных предупреждений. и меры предосторожности. Это особенно важно, когда рекомендованным агентом является новый и / или редко применяемый препарат.
Отказ от ответственности: утверждения, мнения и данные, содержащиеся в этой публикации, принадлежат исключительно отдельным авторам и соавторам, а не издателям и редакторам.Появление в публикации рекламы и / или ссылок на продукты не является гарантией, одобрением или одобрением рекламируемых продуктов или услуг или их эффективности, качества или безопасности. Издатель и редактор (-ы) не несут ответственности за любой ущерб, причиненный людям или имуществу в результате любых идей, методов, инструкций или продуктов, упомянутых в контенте или рекламе.

Криобиология и ангидробиология — физические нагрузки в клетках при низкой температуре и / или низкой гидратации

Снижение механического напряжения

При условии, что растворенные вещества разделяются на межмембранные слои, их присутствие осмотически способствует снижению химического потенциала воды.Чем больше осмотический член, тем меньше всасывание и, следовательно, ниже напряжение, приложенное к мембране. Этот эффект может быть значительным (Юн и др., 1998; Вулф и Брайант, 1999).

Оговорка о разделении очень важна: много растворенных веществ, особенно полимеры, исключены из межмембранных областей. В результате их осмотический эффект может не оказывать прямого влияния на снижение мембранного напряжения, и это может даже увеличить его (Koster et al, 2000). Растворы, которые остаются вне клетки или пузырьков в модельных системах также не даст прямое снижение мембранного напряжения.При температуре выше точки замерзания добавление растворенного вещества к внешнему раствору может при достаточно высоких концентрации, обезвоживайте клетку или везикулу в достаточной степени, чтобы усилить стресс. Проникающие криопротекторы (такие как ДМСО) легко разделяются между мембранное пространство. В модельных системах непросто произвести высокие концентрации непроникающих растворенных веществ в межмембранном пространстве, поэтому сравнения между разными экспериментами следует проводить осторожно, если только межмембранная концентрация, а не общая концентрация образца, измеряется.

Юн и др. (1998) изучали системы липид-растворенные вещества-вода при замораживании. температуры и использовали сигнал ядерного магнитного резонанса воды для определить распределение растворенного вещества и растворителя между пластинчатыми фазами и фаза концентрированного объемного раствора в равновесии со льдом (они использовали либо D ₂ O или дейтерированные растворенные вещества). Для небольших молекул растворенного вещества (ДМСО и сорбит) они обнаружили, что фазовое поведение было близко к таковому. ожидается с использованием описанных выше эффектов и без каких-либо конкретных эффектов.Они обнаружили, что дисахариды сахароза и трегалоза (которые имеют около вдвое больше, чем у других) увеличили гидратацию меньше, чем было бы ожидается только из-за их осмотических эффектов. Этот эффект соответствовал модель, в которой эти молекулы были исключены из очень тонкого слоя вода, наиболее близкая к липидам. Юн и др. обнаружил, что все изученные растворенные уменьшили внутримембранное напряжение, но дисахариды уменьшили его больше, чем растворенные вещества меньшего размера. Это только одна из причин, почему сахароза и Однако трегалоза может встречаться так широко, как природные криопротекторы.Другой причины касаются стеклования и кристаллизации.

В принципе, растворенные вещества могут определенным образом влиять на мембранное напряжение. Если растворенных веществ, связанных с поверхностью мембраны, например, можно было бы ожидать изменение силы гидратации. Одно исследование межмембранных сил с помощью аппарата поверхностных сил не обнаружил специфических эффектов на меж- мембранная сила из-за ДМСО, сорбита или трегалозы, однако это исследование было ограничено по техническим причинам до концентрации около 1 кмоль.м ^{— 3} (Pincet et al., 1994).

Стеклование и ультраструктура

Важное дополнительное соображение возникает, когда и если межмембранная слой остекленяется. Было обнаружено, что в этих условиях дегидратация — вызванное повышение температуры перехода резко снижается, и температура перехода может быть снижена ниже полностью гидратированного значения T _o (Koster et al., 1994, Crowe et al., 1998). Рассмотрим мембрана при фиксированной гидратации при температуре на несколько градусов выше ее температура перехода Т _м .При понижении температуры до Т _м переход происходит с уменьшением площадь на липид (см. предыдущий рисунок). Если, однако, межмембранный водный раствор остеклован, переход не может происходить место. Стекловидный слой является твердым, поэтому способен выдерживать значительные механическое напряжение. Если понизить температуру до Т _м , стекло препятствует уменьшению площади, необходимой для образования гелевой фазы. форма. При понижении температуры ниже Т _м стекло будет поддерживают возрастающее сжимающее напряжение в мембране.В какой-то момент ниже T _o напряжение станет достаточно большим, чтобы преодолеть наличие стеклообразной матрицы, и произойдет гелевый переход. В течение потепление, температура перехода останется прежней. И наоборот, если мембрана находится в фазе геля, когда происходит стеклование, переход температура будет повышена выше температуры полностью гидратированного перехода T _o , как во время охлаждения, так и во время потепления (Чжан и Степонкус, 1996).

На практике измеренная температура перехода в присутствии стекла составляет в диапазоне 10-60 ° C ниже температуры полностью гидратированного перехода Т _или .Koster et al. (2000) измерили механическую свойств соответствующего сахарного стекла, и обнаружил, что модуль Юнга составляет около 20 ГПа. Используя параметры для DPPC (Guldbrand et al., 1982), и ур. (1), сжимающее напряжение, возникающее, если липид остается жидким на 20 ° C ниже T _o составляет около 40 мН / м, что соответствует деформации около 0,4% в стакане. Такой уровень напряжения легко выдерживается твердым телом.

Важность этого эффекта очевидна: если раствор остекловывается, пока липиды находятся в жидкокристаллической фазе, тогда температура перехода будет будут резко опущены, и мембраны останутся в жидком состоянии.В Кроме того, формирование стекла имеет два других важных эффекта. Во-первых, если раствор остекловывается, после чего дальнейшее обезвоживание будет крайне ограничено; а также во-вторых, если образец остеклован, кристаллизация растворенного вещества будет ограничена. Этот полезен, поскольку защитные эффекты растворенных веществ, упомянутые в предыдущем сечения могут возникать только в том случае, если растворенные вещества остаются в растворе.

Литература и ссылки

• Baudot, A., 1997, Cryopreservation d’organes par витрификация: mesures calorimtriques et mesures dilectriques, Докторантура защитил диссертацию в Национальном политехническом институте Гренобля.
• Браун, A.D., 1976, Микробный водный стресс. Бактериол. Rev. vol. 40: с. 803-846.
• Брайант, Г. Перес, Э., Спуттек, А., 1994, Влияние гидроксиэтила крахмал на изотермах монослоя фосфолипидов. Крио-письма, т. 15: стр. 299- 308.
• Bryant, G., Pope, J.M., Wolfe, J., 1992, Свойства фазы с низкой гидратацией смесей фосфолипидов: данные о жидкости-жидкости, вызванной обезвоживанием разделения. Eur Biophys J., vol. 21: стр. 223-232.
• Брайант, Г., Вулф, Дж., 1992, «Межфазные силы в криобиологии и ангидробиология »Cryo-Letters, vol. 13: p. 23-36.
• Брайант, Г., Вулф, Дж., 1989, Могут ли силы гидратации вызывать боковую фазу разделение в мембранах? Евро. Биофиз. J., т. 16: с. 369-374.
• Кроу, Дж. Х., Карпентер, Дж. Ф. и Кроу, Л. М., 1998, Роль витрификация при ангидробиозе. Анна. Rev. Physiol. т. 60, стр. 73-103.
• Crowe, J.H., Crowe, L.M., Carpenter, J.F., Rudolph, A.S., Wistrom, К.А., Спарго, Б.Дж., Анчордогуй, Т.J., 1988, Взаимодействие сахаров с мембраны. Биохим. Биофиз. Acta, т. 947, стр. 367-384.
• DeVries, A.L., 1984, Роль гликопептидов и пептидов в ингибировании кристаллизации воды у полярных рыб, Пер. R. Soc. Лондон. т. B304: стр. 575-588.
• Даугерт, М.Ф., Вулф, Дж., Степонкус, П.Л., 1987, Механика повреждение изолированных протопластов в результате осмотического сжатия и расширения. Plant Physiol. т. 83: стр. 1001-1007.
• Франкс Ф., 1982, Свойства водных растворов при отрицательных температурах. температуры, В: Franks, F., (Ред). Вода: всеобъемлющий трактат, т. 7, Пленум Пресс, Нью-Йорк.
• Fujikawa, S., 1995, Исследование трещин от замерзания, призванное прояснить механизмы отморожения из-за близкого соприкосновения с обморожением мембран в клетках корковой паренхимы шелковицы. Криобиология, т. 32: стр. 444-454.
• Gordon-Kamm, W.J. Steponkus, P.L., 1984, пластинчато-шестиугольный II фазовые переходы в плазматической мембране изолированных протопластов после обезвоживание, вызванное замораживанием. Proc.Natl. Акад. Sci. США, т. 81: стр. 6373- 7.
• Guldbrand L., Jonsson, B., Wennerstrom, H., 1982, Силы гидратации и фазовые равновесия в системе дипальмитоилфосфатидилхолин-вода. Дж. Coll. Int. Sci., Т. 89: стр. 532-541.
• Костер, К.Л., Лей, Ю.П., Андерсон, М., Мартин, С. и Брайант, Г. (2000) Влияние застеклованных и неостеклованных сахаров на превращение фосфатидилхолиновой жидкости в гелевые фазовые переходы. Биофизический журнал 78, 1932-1946.
• Костер, К.Л., Линч, Д.В., 1992, Накопление растворенных веществ и компартментация во время холодовой акклиматизации ржи Puma. Plant Physiol., т. 98: с. 108-113.
• Костер К. Л., Уэбб М. С., Брайант Г., Линч Д. В., 1994, Взаимодействия между растворимыми сахарами и POPC (1-пальмитоил-2-олеоил- фосфатидилхолин) во время обезвоживания: стеклование сахаров изменяет фазовое поведение фосфолипида. Биохим. Биофиз. Acta, т. 1193: с. 143-150.
• Ли Р., 1989, Холодостойкость насекомых: замораживать или не замораживать, Биология, т.39: стр. 308-313.
• Leopold, A.C., (Ed), 1986, Мембраны, метаболизм и сухой Организмы, Cornell Univ. Press, NY.
• Лутц, Дж. Л., Роден, Дж. С., Холли, Дж. К. Дж., Вулф, Дж., Эгертон, Дж. Дж. Дж., Болл, M.C., 1998, Повышенное содержание [CO2] в атмосфере способствует повреждению морозами в саженцы вечнозеленых деревьев, Растения, клетки и окружающая среда, т. 21: стр. 631-635.
• Мазур П., 1963, Кинетика потери воды из клеток при отрицательных температурах температуры и вероятность внутриклеточного замораживания, J. General Physiol., т., 47: с. 347-369.
• Pincet, F., Perez, E., Wolfe, J., 1994, Do trehalose and диметилсульфоксид влияют на межмембранные силы? Криобиология, т. 31: стр. 531-539.
• Rall, W.F., Reid, D.S., Polge, C., 1984, Анализ медленного потепления повреждение эмбрионов мыши криомикроскопическими и физико-химическими методы, Криобиология, т. 21: стр. 106-121.
• Слатьер Р., 1967, Взаимоотношения растений и воды, Academic, N.Y.
• Степонкус П.Л., Стаут Д.Г., Вулф, Дж. Лавлейс, Р.В.Е., 1985, Возможная роль переходных электрических полей в мембране, вызванной замерзанием дестабилизация. J. Memb. Биол., Т. 85: с. 191–198.
• Цветков Т.Д., Цонев Л.И., Цветкова Н.М., Койнова Р.Д., Тенчов Б.Г. Влияние трегалозы на фазовые свойства гидратированные лиофилизированные мультислои дипальмитоилфосфатидилхолина. Криобиология, т. 26: с. 162-169.
• Уэмура, М., Джозеф, Р.А., Степонкус, П.Л., 1995. Холодная акклиматизация Arabidopsis thaliana. Plant Physiol., т. 109: с. 15-30.
• Webb, M.S., Hui, S.K., Steponkus, P.L., 1993, Обезвоживание, вызванное пластинчатые фазовые переходы в гексагональный II в смесях ДОФЭ / ДОФХ. Биохим. Биофиз. Acta, т., 1145: с. 93-104.
• Wiest, S.C., Steponkus, P.L., 1978, Повреждение изолированного протопласты шпината и их моделирование при отрицательных температурах. Растение Physiol., Т. 62: с. 699-705.
• Вулф, Дж., Брайант, Г., 1992, Физические принципы повреждения мембраны из-за обезвоживания и замораживания.в Механике набухания: от глин до живые клетки и ткани, Т.К. Каралис (ред.), NATO ASI Series H, vol. 64: с. 205-224.
• Вулф, Дж. Брайант, Г., 1999. Замораживание, сушка и / или стеклование систем мембрана-растворенная вода. Криобиология, 39, 103–129.
• Вулф, Дж. И Брайант, Г. 2001, «Сотовая связь» криобиология: термодинамические и механические эффекты »International Журнал холода, 24, 438-450.
• Вулф Дж., Степонкус П.Л. Механические свойства плазмы, 1983. мембрана изолированных протопластов растений.Pl. Phys., Т. 71: стр. 276–285.
• Вулф Дж., Даугерт М.Ф., Степонкус П.Л., 1985, Динамика включение материала в плазматическую мембрану и лизис протопласты при быстром расширении площади. J. Memb. Биол., Т. 86: с. 127- 138.
• Вулф, Дж., Даугерт, М.Ф., Степонкус, П.Л., 1986, Механическое исследование деформация и разрыв плазматических мембран протопластов во время осмотические расширения. J. Memb. Биол., Т. 93: стр. 63-74.
• Уоркман, Э.Дж., Рейнольдс С.Е., 1950, Происходящие электрические явления во время замораживания разбавленных растворов и их возможное отношение к грозовое электричество. Phys. Rev., т. 78: с. 254-259.
• Ян З., Поуп Дж., Вулф Дж., 1993, Ядерный магнитный резонанс. спектроскопия замороженных суспензий фосфатидилхолин-D2O: новое метод измерения сил гидратации. J. Chem. Soc. Фарадей Пер., Т. 89: стр. 2583-2588.
• Юн, Й. Х., Поуп, Дж. И Вулф, Дж. (1998) «Влияние растворенных веществ на свойства замораживания и силы гидратации в липидных пластинчатых фазах» Biophys.J. , 74 , 1949-1965.
• Чжан Дж. И Степонкус П.Л. 1996, Предлагаемый механизм для понижение температуры фазового перехода жидкость-кристалл в гель фосфолипиды в обезвоженных сахарно-фосфолипидных смесях. Криобиология 33, 21А.

---

Большая часть приведенного выше эссе взята из статьи Другие части взяты из некоторых других наших публикаций, также доступных в Интернете:
• Юн, Ю. Х., Поуп, Дж. И Вулф, Дж. (2003) «Замораживание стрессы и гидратация изолированных клеточных стенок » Криобиология , 46 , 271-276.
• Вулф, Дж. (2002) «Сотовая связь Термодинамика «Энциклопедия наук о жизни (http://www.els.net). Лондон: Nature Издательская группа.
• Вулф, Дж., Брайант, Г. и Костер, К. (2002) «Что такое« незамерзающая вода », насколько она незамерзаема и как много есть? » Cryoletters , 23 , 157-166.
• Болл, М.С., Вулф, Дж., Кэнни, М., Никотра, А.Б. и Хьюз, Д. (2002) «Пространственно-временная зависимость температуры и замерзания листьев снежной камеди. саженцы (Eucalyptus pauciflora) «, Journal of Functional Биология , 29, 1259-1272.
• Брайант, Г., К.Л. Костер и Дж. Вульф. (2001) «Поведение мембран в семенах и других системах при низкой воде. содержание: различные эффекты растворенных веществ » Seed Science Research , 11 , 17-25.
• Юн, Й. Х., Поуп, Дж. И Вулф, Дж. (1998) «Влияние растворенных веществ на замораживающие свойства и силы гидратации в липидных пластинчатых фазах» Biophys. J. , 74 , 1949-1965.
• Bryant, G., Wolfe, J. (1992) «Межфазные силы в криобиологии и ангидробиологии» Cryo-Letters, 13 , 23-36.
• Wolfe, J., Dowgert, M.F. и Степонкус П. (1986) «Механическое исследование деформации и разрыва плазматических мембран протопластов при осмотическом расширении». J. Memb. Биол., 93 , 63-74.

  No related posts.