Что входит в мойку комплекс: Комплексная мойка и нано-мойка автомобиля на Автомойке N1 ЮЗАО

что включает в себя данная услуга

Комплексная мойка авто — долгий процесс, но он необходим, чтобы довести состояние вашего автомобиля до идеала. В некоторых ситуациях автолюбитель может справиться и сам, но в запущенных случаях придётся обратиться к таким сторонним поставщикам услуг, как автомойка и химчистка. Однако, зная правильную последовательность действий и как именно удалить разные виды загрязнений, вы сможете отмыть до блеска свою машину не хуже профессионалов.

Сушка кузова автомобиля

Помыть кузов машины — лёгкое дело, но правильно его высушивать умеют далеко не все.

Среди распространённых ошибок встречаются:

• протирание махровым полотенцем;
• использование резиновых скребков;
• натирание кузова обычной тканью.

Использовать для сушки эти средства неприемлемо, потому что ткань и скребки могут легко повредить краску автомобиля.

В первое время это незаметно, но если регулярно сушить авто именно так, то повреждения постепенно будут бросаться в глаза.

Важно! После мойки кузова не оставляйте его мокрым. После воды остаётся множество отложений, что не только приводит к появлению разводов, но и может стать причиной повреждения защитного покрытия.

Высушивать кузов правильно с помощью микрофибры — специальной полиэфирной ткани. Она отлично подходит для протирания гладких поверхностей благодаря сверхмалой толщине волокон, измеряемой в микрометрах. Для ещё более высокой скорости сушки и снижения рисков нанесения повреждений краске, используйте воск-осушитель. Он создаёт защитный слой между кузовом и тканью, ещё и выступая в качестве смазки.

Нанесите его на полотенце из микрофибры и протирайте автомобиль сверху вниз, пока не почувствуете, что ткань влажная. Далее следует отжать полотенце от влаги, нанести новый слой воска и повторять процедуру до полной сушки вашего автомобиля.

Хорошим способом высушивания таких труднодоступных мест, как часть кузова под дверными ручками или уплотнители, является использование сжатого воздуха. Его применение также безвредно для кузова.

Мытьё колёсных арок транспортного средства

Комплексная мойка, помимо прочего, включает в себя очистку колёсных арок и подвески. Если не осуществить эту процедуру, грязь осыпется при езде на чистые колёса и нижнюю часть крыла, что испортит сияющую чистоту кузова. Обычная грязь легко удаляется специальным гелем или обыкновенным раствором воды с моющим средством. Промыть колёсные арки получится и вручную с помощью обыкновенного полотенца и специальных кистей, чтобы избавиться от грязи в труднодоступных местах.

Важно! Средства с кислотным составом не подходят для мытья автомобиля, в том числе и для очистки колёсных арок. Используйте только растворы с малым процентом щёлочи — они безопасны для алюминия, хрома и других металлов.

Обычной водой не получится вымыть:

• битум;
• краску;
• дорожную разметку.

Для удаления битума необходимо приобрести особый растворитель: обращайтесь с ним осторожно и проводите омывание только в резиновых перчатках. Старую засохшую разметку проще всего аккуратно срезать ножом. Это не всегда бывает эффективно и зачастую необходима покупка новых подкрылков.

Не забудьте очистить колодки и суппорты от тормозной пыли, а алюминиевые детали — от окисления. Это влияет не только на эстетический внешний вид и чистоту, но и на срок службы элементов подвески вашего авто. В конце необходимо провести сушку подвески и арок.

Резиновые подкладки и уплотнители лучше высушить с помощью специального консерванта, который продаётся в автомагазинах. Это средство является гидрофобным и выталкивает из резины грязную воду, повышая не только скорость сушки, но и степень очистки отдельных элементов арок и подвески.

Удаление с поверхности насекомых и битумных пятен

Летом во время поездок, особенно за городом, автомобиль подвергается настоящей «бомбардировке» со стороны насекомых. Мойка обычной водой не даст желаемого эффекта, если насекомые присохли: или не отмоется вовсе, или перестараетесь и нанесёте механические повреждения лобовому стеклу и кузову.

Знаете ли вы? В организме насекомых много различных кислот. Для человека они не представляют особой опасности, но при длительном нахождении сбитой живности на кузове возможно разъедание лакирующего покрытия, что приводит к появлению пятен на краске.

Так, при борьбе с насекомыми у водителя есть два варианта:

1. Удалить насекомых как можно быстрее.
2. Использовать специальный очиститель следов насекомых.

К тому же, зачастую такие очистители хорошо отмывают и битумные пятна. С таким видом загрязнения часто сталкиваются водители в жаркую погоду или при езде на недавно уложенном или отремонтированном асфальте. Смесь смолы и растворителей представляет серьёзную угрозу лакирующему покрытию кузова: из-за смолистости загрязнение трудно устранить, а растворитель разъедает ЛКП.

Особо опасным стоит считать пятно из жидкого битума — если не устранить его за пару часов, инородное вещество может проникнуть в саму структуру краски кузова, что приведёт к возникновению дефекта цвета.

Убрать битум удастся лишь с помощью специального средства для очистки или на мойке.

Если решились разобраться с этим своими руками, то проводите всю процедуру с крайней осторожностью, потому что в составе битума могут находиться песок, гравий и мелкие камни. При слишком приложенной силе и чрезмерном трении получится лишь усугубить ситуацию, нанеся на кузов царапины, куда может забиться остаток битума. Во время очистки устаревших пятен может понадобиться несколько подходов нанесения и смыва очистителя смол.

Чистка салона и багажного отделения

Под чисткой салона подразумевают сухую уборку с помощью пылесоса. Эта часть комплексной мойки самая простая, но и одна из самых требовательных ко времени. Помимо устранения пыли на сиденьях и передней панели авто, очистки требуют и коврики. Под ковриками скрывается половой настил — карпет, который тоже требует очистки после длительной езды.

Рекомендуем для прочтения:

Очистка багажного отделения мало чем отличается от таковой процедуры в салоне. Возможная проблема может заключаться лишь в загруженности багажника и необходимости отправки в мусорную корзину залежавшихся там ненужных вещей.

Самая нелюбимая часть чистки автомобиля многих водителей — удаление пыли из приборной панели и вентиляционных каналов авто. Такую очистку реализовывают с помощью длинных кисточек, ведь пылесосом сквозь маленькие отверстия не добраться.

Чтобы навести идеальную чистоту, сухую уборку необходимо дополнить другим видом очистки: химчисткой. Её можно осуществить и собственными руками, были бы резиновые перчатки, щётки и набор очистителей. Не рекомендуется применять бытовую химию: она может повредить обшивку салона и разлагается значительно дольше, оставляя при этом следы.

Обработку очистителями необходимо начинать с потолка: удобно в этом случае применять аэрозоль. Распылите его и подождите отрезок времени, указанный на упаковке, после чего необходимо насухо вытереть химикат полотенцем или салфеткой.

После следует натереть двери: начните с тканевых вставок и очистите их по аналогии с потолком. Уделите сидениям наибольшее внимание и перед очисткой проверьте действие средств на небольшой области обивки или чехла. Багажник также можно обработать для идеальной свежести в автомобиле.

Важно! Следите за влагой и не допустите, чтобы она просочилась между пластиковыми элементами дверей и панели. Неосторожность может привести к короткому замыканию и другим проблемам с электроникой автомобиля.

Омывка силового агрегата

Мойка двигателя влияет не только на чистоту и эстетический внешний вид автомобиля, но и на безопасность при вождении. Если вовремя не убрать грязь на силовом агрегате, автовладельцу тяжело будет определить возможную утечку масла или охлаждающей жидкости. Слой грязи влияет и на охлаждение мотора, препятствуя воздухообмену между горячим двигателем и окружающей средой нормальной температуры, что приводит к увеличению темпа износа «сердца» машины.

Лучший и самый быстрый способ устранить грязевые наросты — воспользоваться пенным очистителем. В специализированных магазинах удастся купить средство специально для моторного отсека авто. Химический состав пены помогает очистить не только грязь, но и масляные технические жидкости и даже малые битумные пятна. К тому же, пена легко попадает в труднодоступные мелкие зазоры между моторными элементами и является безопасной для пластиковых деталей и резиновых уплотнителей.

Бытовые средства, как и при мойке салона, применять не стоит: они неэффективны при устранении масляных подтёков. Перед началом процесса мойки прикройте полиэтиленом разъёмы, ведущие внутрь силового агрегата, а также генератор и воздушный фильтр.

Стоит прогреть двигатель до небольшого повышения его температуры.

Для безопасности нужно обесточить автомобиль, а лучше изъять из-под капота аккумулятор во избежание короткого замыкания. Далее просто нанесите пену на несколько минут, чтобы загрязнение успело в ней раствориться, и смойте небольшим напором воды пену. Полиэтилен можно снять, а влажные детали высушить.

Важно! Не мойте силовой агрегат под большим напором воды. Она может просочиться внутрь генератора и реле, что вызовет ускоренное появление ржавчины.

Нанесение защитных и восстанавливающих составов, полировка кузова, фар и пластика в салоне

Полировка кузова — несложный процесс, предназначенный для защиты ЛКП от естественных повреждений.

Процесс может быть:

• защитным;
• восстановительным.

Защитная полировка необходима для новых или недавно покрашенных автомобилей. Специальная полировальная паста создаёт защитный слой поверх лака, не давая кислотным осадкам, минералам из воды и другим реагентам вступать в реакцию с краской и создавать в ней микротрещины.

Альтернативой такому виду полировки может стать защитная плёнка с фосфатным составом, который создаёт не столько физическую, сколько химическую защиту ЛКП.

Восстановительная полировка — более распространённый вид защиты лака. Если под рукой есть специальная полировальная паста, в комплекте с которой обычно прилагается специальная губка, процесс легко осуществим и своими руками. Нанесите на участок кузова площадью 40×40 см небольшое количество средства и круговыми движениями втирайте его с помощью губки. В итоге вы сможете увидеть блестящую плёнку на обработанном участке машины.

Важно! Не дайте полироли засохнуть: её нужно смывать спустя пару минут после нанесения, иначе останется пятно.

Пластик в салоне начищают специальным полировальным составом, который также продаётся в магазинах. Его можно нанести прямо во время уборки салона. Обратите внимание на то, что помимо передней панели, могут быть пластиковые вставки и на дверях. Наносите полироль аналогичным образом, как при полировке кузова.

Полировка фар — это комплексный процесс, который трудно реализовать своими руками без специального оборудования. На мойках и СТО для нанесения полировального геля используется шлифовальная машинка с мягкой насадкой. В перечень услуг часто входит удаление помутнения фар и восстановление прозрачности до заводских показателей. За отдельную плату на фары наносят плёнку, способную защитить их от гравия и битума.

Комплексная мойка автомобиля — долгий для автовладельца, но необходимый для транспортного средства процесс. Некоторые аспекты мойки влияют не только на чистоту и внешний вид машины, но и на безопасность её вождения. Важно правильно проводить очистку, избегая рисков проблем с электроникой и порчи двигателя. Всегда можно обратиться в автомойку для выполнения интересующей вас услуги, но практически все пункты генеральной уборки авто под силу выполнить лишь с помощью своих рук и приобретённых моющих средств.

Подписывайтесь на наши ленты в таких социальных сетях как, Facebook, Вконтакте, Instagram, Pinterest, Yandex Zen, Twitter и Telegram: все самые интересные автомобильные события собранные в одном месте.

Общая мойка (комплекс) / Автомойка / Услуги

Услуги автомоек востребованы, все автовладельцы хотят, чтобы их машина была чистой и ухоженной. Автомоек в городе много. Как выбрать ту, которая удовлетворит по всем параметрам?

Исследования проводятся, сравниваются скорость оказания услуги, качество, спектр. Эти данные даже где-то публикуются, но широкой общественности они не известны. Поэтому самый верный способ найти хорошую автомойку – «сарафанное радио» и собственный опыт.

Комплексная мойка подобна генеральной уборке. Она включает мытье кузова и порогов, чистку и полировку стекол, мойку ковриков, уборку пыли и грязи пылесосом с пола и сидений, влажную уборку салона, мойку дисков, продувку и другое (подробности уточняйте у мастера). Причем комплекс может быть обычный и наномойка.

Наномойка – мойка, включающая три фазы очистки, вначале обрабатывают машину специальным составом, который отлично смывает грязь и не влияет на материалы машины. Затем этот состав смывают бесконтактным способом.

Второй этап — ручная мойка, поверхность машины обрабатывают специальным веществом для регенерации, придающим блеск и защищающим лакокрасочное покрытие автомобиля.

Далее обрабатываются колесные диски специальным очистителем, удаляет практически любое загрязнение. Можно сказать, что наномойка возвращает машине первоначальный вид.

Евромойка повторяет этапы наномойки, с той разницей, что средства более мягкие. То есть ваша машина будет отмыта, почищена и даже блестяща, но лаковое покрытие восстановлено не будет. Но на автомобиль будет нанесен специальный состав, позволяющий автомобилю оставаться чистым значительно дольше, чем при обычной мойке. Данный состав убирает статическое электричество, пыль скапливается на поверхности значительно медленнее.

В комплексную мойку автомобиля входит последующая сушка. На профессиональных мойках автомашины могут сушить вентиляторами и тепловыми пушками, компрессорными пистолетами. После такой сушки не остается никаких разводов на кузове. 

Что входит в комплексную и техническую мойку автомобиля

В процессе эксплуатации кузов транспортного средства подвергается негативному воздействию окружающей среды: влага, пыль, грязь не только портят внешний вид машины, но и создают угрозу появления и развития коррозии металла. Чтобы вернуть автомобилю презентабельный вид, и обезопасить кузов от появления и развития ржавчины, применяется комплексная мойка. В нее входит непосредственно само мытье транспортного средства, а также нанесение защитного слоя на ЛКП машины, что позволяет обезопасить авто от появления мелких дефектов и сколов.

Что такое комплексная мойка

Комплексная мойка авто представляет собой последовательность действий, направленных на очистку кузова, салона и силового агрегата транспортного средства. Согласно общепринятому регламенту проведения данной процедуры, мытье включает в себя следующие операции:

1. Экспресс мойка, сушка кузова автомобиля.
2. Мытье колесных арок транспортного средства.
3. Удаление с поверхности насекомых и битумных пятен.
4. Мытье салона и багажного отделения.
5. Омывка силового агрегата.
6. Нанесение защитных и восстанавливающих составов, полировка кузова, фар и пластика в салоне автомобиля.

Что входит в комплексную мойку

Бесконтактная мойка имеет технологическое преимущество перед другими способами очистки кузова автомобиля от грязи. При выполнении процесса, не используют губки, ветошь и щетки, что предотвращает появление мелких царапин. Кузов машины моется водой, подаваемой под давлением. Для мытья применяют специальные химические средства – автомобильные шампуни. По завершению очистки, транспорт сушат теплым воздухом.

Таким способом удаляются крупные загрязнения с поверхности транспортного средства. Помимо мытья кузова, салона выполняют чистку колесных арок, подкрылков, порогов, и дисков, выполняют техническую мойку автомобиля. Она включает в себя мытье силового агрегата, промывку выхлопных труб машины. Благодаря этому эти узлы приобретают первоначальный внешний вид, также улучшается их работа.

При очистке от грязи салона, моют коврики, сиденья обрабатывают пылесосом. Для уборки пластиковых деталей салона используют специальные химические составы. При мытье стекол изнутри используют щадящие составы и салфетки из микрофибры. Это предотвращает появление дефектов на поверхности. Вместе с очисткой салона выполняют мойку багажника автомобиля.

После мытья авто обрабатывают защитными составами. Корпус покрывают воском или «Жидким стеклом». В комплексе, они образуют защитный слой, позволяющий обезопасить ЛКП от негативного воздействия окружающей среды и появления царапин и сколов. При необходимости, поверхность полируют. Шлифовке подвергаются и световые приборы транспортного средства.

На лобовое стекло наносится специальное химическое средство «Антидождь» — оно обладает водоотталкивающими свойствами, улучшает обзор для водителя и защищает от царапин. При нанесенном составе, нет нужды в частом использовании дворников, что уменьшает износ их щеток и предотвращает появление на лобовом стекле микроцарапин.

На что обратить внимание

При очистке кузова автомобиля, соблюдают ряд правил, которые позволяют обезопасить ЛКП транспортного средства от повреждения:

1. Температура воды, подаваемой под давлением, не должна превышать показатель в 60-75 градусов по Цельсию.
2. Нельзя использовать агрессивные моечные составы. Они могут разъесть краску.
3. Перед полировкой кузова, его предварительно нужно тщательно вымыть, высушить и обезжирить (в качестве обезжиривающего вещества нельзя использовать бензин). После, выполняют полировку при помощи специальной пасты и шлифовального круга. По завершению операции, наносят слой лака.



Битумные пятна и следы птичьего помета нельзя заполировать. Это приведет к появлению новых царапин и повреждению шлифовального круга.

При интенсивной эксплуатации машины, рекомендуется 2 раза в год проводить комплексную мойку транспортного средства: один раз летом, и один раз зимой. Очистка авто от грязи и нанесение защитных составов не только вернут машине презентабельный внешний вид, но и защитят транспорт от негативного воздействия факторов окружающей среды.

Комплексная мойка — Статьи | Uremont

Комплексная мойка авто, лучшее средство избавления от грязи. Учитывая нынешние условия погоды, мойка автомобиля становится практически каждодневным занятием. Ездить на грязном автомобиле неприятно, и к тому же портит впечатление о владельце авто.

Но запятнанная репутация не самое страшное, ведь грязь на кузове может нанести серьезные повреждения. Постоянная пыль летом царапает лаковое покрытие кузова. Зимой налипший слой снега с солью и песком разъедают защиту краски, и может спровоцировать коррозию металла. Осенью и весной грязь может буквально въедаться в лакокрасочное покрытие авто. Поэтому, если вовремя избавляться от грязи, можно сэкономить немалые деньги, учитывая цену перекраски авто.

Если пытаться удалить грязь самому, то повреждение лакокрасочного покрытия обеспечено. Опасность в том, что домашние методы очистки оставляют после себя много микроцарапин, которые поначалу невозможно заметить. Но такие царапины имеют свойство увеличиваться. Поэтому, если хочется сохранить покрытие авто невредимым, однозначно нужно делать выбор в пользу профессиональной мойки. Но почему лучше выбрать комплексную мойку машины, а не обычную? И какие именно работы входят в комплексную мойку машины?

  Преимущества комплексной мойки автомобиля   Обычная поверхностная мойка не даст исключительного результата. Визуально машина будет иметь чистый вид, но долго он не сохранится. Большая часть кузова чистая, но если посмотреть на труднодоступные места, то можно понять, что мойка сделана не качественно. А ведь именно в местах скопления грязи, машина начинает гнить. При обычной мойке используются контактные способы очистки, и поэтому есть опасность получить мелкие царапины. Плюсом ко всему, пройдет достаточно долгий промежуток времени, прежде чем машина обретет чистоту.

В отличие от обычной процедуры очистки, комплексная мойка авто отлично сохраняет целостность лакокрасочного покрытия. Благодаря специальной моющей технике, используется бесконтактный метод очистки. Такой метод включает в себя только воду с шампунем для мойки авто. Кроме сохранности лака, высокое давление позволяет очистить даже труднодоступные щели, тем самым проводя профилактику образования коррозии. Комплексная очистка позволяет произвести полную очистку от грязи, во всех щелях машины. Несмотря на большой объем работы, процедура мойки занимает намного меньше времени, чем стандартная очистка, при помощи ведра и тряпки.

  Что входит в комплексную мойку машины

 

Комплексная мойка машины включает в себя полную очистку кузова, а при необходимости и внутренней части машины. В комплексную мойку машины входит:

Мойка, полировка и восстановление кузова машины Чистка салона, ковриков и сидений Чистка двигателя и багажника Чистка дисков и шин колес

Мойка машины происходит путем нанесения шампуня на поверхность кузова. Должно пройти время, прежде чем он вступит в реакцию с загрязнителем. Пока шампунь настаивается, рабочий занимается чисткой ковриков и сидений. После чего, при помощи специального оборудования смывается весь шампунь, и при необходимости проводится полировка.

Обычно проводят защитную полировку, с нанесением слоя воска, который предотвращает появления царапин. Абразивную полировку, проводят намного реже, так как она очищает поверхность путем снятия определенной толщины защитного лака. И наконец, могут провести восстановительную полировку. Такая полировка способна убрать некоторые царапины и недостатки кузова, с применением нового жидкого стекла.

Двигатель – один из самых сложных элементов, который невозможно помыть обычной тряпкой. Но при помощи воды под высоким давлением, эта задача значительно упрощается. Так можно провести двигатель в рабочее состояние, при этом, не испортив важные детали. Кроме того, машине полностью вычистят багажник.

 

Не всегда получается при помощи тряпки полностью очистить поверхность дисков колес. Но благодаря большому давлению струи воды на чистку колес уходит несколько минут. А результат полностью компенсирует затраченные средства и силы. Кроме того, за отдельную плату, можно покрыть шины специальным черным веществом. Так, они заметно обновятся, и общий вид машины значительно улучшится.

Несмотря на большую разницу в качестве выполняемой работы, комплексная мойка несильно превышает стоимость обычной очистки. Но необходимо выбрать качественных специалистов, которые произведут честную работу. К счастью, найти подобное качественное обслуживание можно, благодаря сайту Uremont. com. Все что нужно, просто оставить заявку на комплексную мойку автомобиля и выбрать понравившийся автосервис. Так, можно помыть свой автомобиль быстро, качественно и надежно!

Цена на мойку автомобиля в Санкт-Петербурге — Мойка 2×2

	Наименование услуги	легковые	кроссоверы	внедорожники и минивэны	микроавтобусы и газели
1	Мойка «Экспресс БЛЕСК»	999	1099	1199	1299
2	Комплекс «Летний ЛОСК»	1650	1850	2150	2500
3	Комплекс «Зимний Эконом»	1799	1999	2199	2399
4	Мойка «Winter Protection»	4499	4799	4999	5499
5	Защита под ключ NEW	12000	13000	14000	16000
6	Мойка «КАК ОБЫЧНО»	620	670	750	790
7	Комплекс «CANDY CAR»	1499	1699	1799	1899
8	Комплекс «PERFECT SHINE»	920	1050	1180	1290

Мойка «Экспресс БЛЕСК» — мойка кузова, мойка (пылесос) ковров, покрытие » Black DIAMOND», обработка покрышек (чернение)

Комплекс «Летний ЛОСК»- мойка Люкс + багажник, обезжиривание, полимер gyeon wetcoat, чернение шин, антидождь 

Комплекс «Зимний Эконом» — мойка Люкс + багажник, мойка днища, обезжиривание,полимер gyeon wetcoat, обработка резинок силиконом

Мойка «Winter Protection» — мойка люкс + багажник, обезжиривание, полимер gyeon wetcoat, защитное покрытие стекла Ombrello, очистка колесных дисков, обработка покрышек (чернение), обработка резинок силиконом

Защита под ключ NEW — Абразивная полировка тремя видами паст 3M, нанесение жидкого стекла H7, полная уборка салона, кондиционер кожи, антибактериальная обработка, антидождь на лобовое стекло, очистка дисков, обработка покрышек (чернение)

Мойка «КАК ОБЫЧНО» — мойка кузова, мойка (пылесос) ковров, контактная обработка, обработка покрышек (чернение) или (силикон) 

Комплекс «CANDY CAR» — мойка кузова, мойка (пылесос) ковров, обезжиривание, » Black DIAMOND» , чернение шин, очистка колесных дисков  

Комплекс «PERFECT SHINE» — мойка кузова, мойка (пылесос) ковров, обезжиривание, воск , очистка колесных дисков, обработка покрышек (чернение)

лучшая стоимость мойки кузова автомобиля в Москве.

Компания

Мойка

Чистый автомобиль – это хорошее настроение. А для кого-то гораздо больше — самоуважение, статус и даже обязательное правило: утренний кофе, свежая рубашка, и к ним в комплект такой же безупречный автомобиль.

Мойка по скорости, полноте и технологии бывает такой же разной, как отношение людей к «железному коню».

«АвтоБыстро» может за день восстановить безупречный внешний вид шести сотен автомобилей! Мы никогда не опускаем планку качества до уровня «технической отбивки грязи по-быстрому», и при этом даем каждому клиенту выбор подходящей программы из 29 возможных. Да, в нашем базовом прайсе – 29 позиций, которые можно и нужно выгодно комбинировать.

Мы работаем на потоке и поэтому у нас неизменный набор «блюд» в меню, проверенное качество продуктов, скорость и вежливость обслуживания. Чисто, честно и быстро – наш девиз.

Повторим еще раз: мы моем до 600 автомобилей в день. Поэтому о московской и подмосковной грязи мы знаем действительно все, и отмыть, отчистить умеем любую, самую проблемную – на кузове, отделке из хрома, коже салона, пластике, текстиле… Повреждение неустранимое? Тогда мы восстановим поверхность иным способом, в нашем арсенале – вся сила современного детейлинга!

 

 (↓ Для перемещения по статье, нажмите на ссылки-оглавление ↓)

 

Мойка кузова

Мойка для автосервиса

В нашем прайсе есть такая позиция. Уточняем: это техническая мойка, которую мы выполняем только для автомобилей, приезжающих в наш автосервис. Нельзя ведь, в самом деле, менять колодки или даже делать простой шиномонтаж, когда кузов покрыт грязью, и каждое соприкосновение с ним – не просто новый след, но готовая царапина, потертость! Кстати, техническая мойка порой бывает и бесплатной: все зависит от объема и условий сервисных работ.

 

Базовая мойка

Мойка начинается в «АвтоБыстро» с этого базового уровня: очистка кузова и порогов, а затем – покрытие защитным воском. Это наше решение: всегда, при любой мойке, даже простейшей, защищать кузов. Столица не очень добра к автомобилям даже летом, когда на дорогах много пыли. А уж зима с ее реагентами – просто автокошмар… Поэтому оставить кузов без защиты никак нельзя.

Благодаря тщательной мойке (двух- или трехфазной) мы очень глубоко и бережно очищаем лакокрасочное покрытие, а затем защищаем его воском. Такая мойка сохраняет эффект больше, сберегает краску и лак.

 

Комплексная мойка «Стандарт»

Сесть в чистый автомобиль… на грязное сиденье? Как-то совсем не празднично. Чтобы вы могли праздновать чаще и при этом не истощали кошелек, мы создали несколько комплексных программ. Первая и самая бюджетная из них – «Стандарт». В пакет услуг обычно входят: мойка кузова и тщательная очистка порогов; полноценная чистка салона – стекла, пылесос, пластик. После «Стандарта» вы садитесь в автомобиль, который чист изнутри и снаружи и даже пахнет свежестью.

 

Золотые правила

Мы понимаем, что все автомобили разные, и состояние у них разное, и погода – разная. Поэтому, вписав в комплекс несколько обязательных позиций по работам, мы не будем выполнять их формально. Мы постараемся получить наилучший результат. Если мойку «Стандарт» закажут для авто с текстильными сиденьями мы их почистим пылесосом; если авто с кожаным салоном, помимо пылесоса обработаем сиденья подходящим средством, чтобы освежить их внешний вид.

То же самое – с технологией мойки. Зимой это будет особенно эффективный набор против реагентов. Обработка кузова специальным составом, расщепляющим реагент на молекулярном уровне и после – промывка шампунем с губкой. Летом же мы подберём химию по погоде. Если очень жарко и сухо – одну, если дождливо – другую. В жару ведь важно защитить кузов от солнца и перегрева, а в дождь хорошо себя показывают гидрофобные средства, после которых вода буквально скатывается с кузова.

Наше правило – быть гибкими в применении правил!

 

Комплексная мойка «Универсал»

Когда хочется чуть больше, чем обычно, это – «Универсал». Стандартная мойка кузова и чистка салона будут дополнены тщательной уборкой багажного отсека. Разница в цене смешная. Зато ощущение полностью, «от носа до хвоста» чистенького авто – бесценно.

 

Фирменный комплекс «АвтоБыстро»

Продавцы любят говорить «сам купил такой (телевизор, автомобиль, торт), рекомендую». Не всегда продавцы бывают честными. Вот мы и решили, что надо тщательно продумать и составить такой комплекс услуг, который мы действительно считаем наилучшим – «как себе». Это и есть комплекс «АвтоБыстро».

Он – как блюдо «от шеф-повара»! Он – готовое решение для людей взыскательных, влюбленных в свой автомобиль. А еще этот комплекс подойдет для предпродажной подготовки автомобиля. Он действительно изменит все и развернет время: смотрите, вот он, ваш автомобиль, опять «новый»!

«АвтоБыстро» — это мойка кузова, стекол и порогов, чистка салона и багажника, восстановление глянца кузова, колесных дисков и хромовой отделки.

Мы создали комплекс «АвтоБыстро», чтобы он стал лицом нашей мойки, в нем весь наш опыт плюс наша скорость, поэтому комплекс еще и очень недорогой для своего богатого наполнения.

Среднее время комплексной мойки автомобиля составляет 30 минут

 

Тополиные почки: ежегодная эпидемия, которая «убивает» автоглянец

Лако-красочные покрытия прошли длинную эволюцию, чтобы стать действительно роскошными на вид – и при этом отвечать огромному числу требований, от экологичности до долговечности. Но, сколько бы они ни менялись, их враг по-прежнему непобедим. Вернее, два главных врага. Два вида загрязнений, которые способны в считанные дни «прожечь» лак, необратимо нарушить его прозрачность и глянец.

Странно, правда? Столько технологических ухищрений, инноваций… а природа с усмешкой противопоставляет им птичий помет и тополиные почки. Неизменные много тысяч лет. И такие же «смертоносные».

Способы спасения автопокрытий в общем-то известны каждому. Первый и главный рецепт: не упустить время! Второй и такой же важный – сократить возможность «комплексного воздействия» агрессивной грязи и солнца. Здесь и далее мы будем говорить о тополиных почках, именно об этой сезонной напасти.

Весна 2020 создала для многих автомобилей наихудшие возможные условия. Коронавирус вынудил владельцев, особенно пожилых, надолго остаться дома. Были безнадежно упущены недели, даже месяцы…

Свежий «клей» попал на лак, закрепился, дополнился мелкой пылью. Солнце прогрело его, растопило и помогло проникнуть глубже. Снова добавилась пыль. И так – раз за разом.

Застарелые, твердые черные «шрамы» — вот что увидели автовладельцы, когда наконец-то период самоизоляции остался позади, и они спустились во дворы.

Гугл в помощь: быстро выяснилось, что, если верить сетевым советам, спасение почти невозможно.

Проверьте сами: нельзя тереть абразивом; вредно смачивать, химию тоже надо применять с осторожностью, а результат никто не гарантирует.

Что ж, мы решили проверить, так ли все плохо.

Мы – профессионалы в теме восстановления блеска и новизны автомобиля!

Итак, матч начинается: в красном углу – мастера «АвтоБыстро». В зеленом углу – немолодой «субару Форестер», чей владелец лишь дважды за время длинного московского периода #оставайсядома использовал автомобиль, а заодно сметал с крыши и капота тополиные почки. По несчастливому стечению обстоятельств парковочное место «жертвы» — строго под тополем. А чехол – на даче…

В общем, первый взгляд на лак удручает. Так и хочется сделать ставку на силу природы и признать победу тополиного клея.

Следы рельефные, густо-черные, многочисленные. Глянец покрытия практически отсутствует. Но, как ни странно, команда «АвтоБыстро» не показывает признаков уныния и решительно начинает борьбу!

Подробнее о этапах тут

 

Щетка и скребок: 5 правил безопасной очистки

Утро. Холодно. Кузов в «шубе» снега, хорошо если мягкого и пушистого, хуже — если грубого ледяного, вроде рыбьей чешуи. Чистится такая «чешуя» соответственно, к ней приходится прилагать усилия, отскребать и отбивать.

Дело вроде бы правое: ну кто хочет ездить на «сугробе»? Некрасиво, неудобно и даже как-то невежливо, рано или поздно комья льда слетят и шмякнутся на дорогу или хуже – на стекло авто, идущего следом…

Да уж, дело правое и победа неизбежна: щеток в продаже много, а уж скребки на прилавках – залюбуешься! Силовые с ребрами жесткости, длинные с телескопической ручкой, особо грубые с острым жалом. ..

В общем, лед будет удален в считанные минуты.

Но любая победа имеет свою цену. Хотим или не хотим, но мы платим эту цену. Так уж лучше – знать цену заранее! Иначе вы приедете к там, в «АвтоБыстро», и после мойки увидите то, что вас не порадует: свежие сколы и царапины, мелкие и глубокие, много и по всему кузову.

Поверьте, даже одна беспощадная битва со льдом может обойтись в кругленькую сумму.

 

Как же быть?

Правило первое: помним о законах физики

Снег при нагреве превращается в воду. Так просто, правда? Значит, самый стойкий лед на капоте – обречен. Не рвемся в бой, ждем. Ведь это наш драгоценный капот, который всегда на виду и вообще – «лицо» автомобиля. Несчастное лицо, подставленное под все удары зимней дороги… Не надо усложнять утро капота «грубым бритьем».

Сметаем снег мягкой щеткой и верим в физику: лед, намертво пристывший к лаку, сам сползет.

 

Правило второе: обзорность – это жизнь!

Конечно, очистка стекол – приоритет №1. Хорошая новость состоит в том, что стекло по своей природе имеет высокую твердость. Ни резиновая, ни пластиковая щетка не нанесут царапин на стекло! А вот привычка упрямо и сильно стучать по наплывам льда – она довольно вредная. В нижней части лобового стекла прогрев от салонного отопителя создает очень значительную разницу температур «внутри» и «снаружи». Так что есть риск «разбудить» незаметную микротрещину от удара песчинки или камешка.

Наш совет – сразу же задействуем все системы подогрева, какие есть в нашем распоряжении. Ждем пару минут и тщательно, без излишней спешки и грубости, чистим стекла.

 

Правило третье: коллекционируем «вооружение»

Универсальные средства не бывают наилучшими. Так что неплохо задаться целью – и постепенно накопить арсенал инструментов для чистки стекол и кузова. Маленький скребок с острым прочным жалом из пластика предназначен для наледи на стеклах. Сгон с резиновым (обрезиненным) лезвием – для тех же стекол, но уже размерзшихся. Щетка с умеренно-жесткой щетиной – для обметания снега.

Поосторожнее с телескопическими «монстрами», которые чистят непонятно что и неясно где – вне зоны прямого обзора. Ручка из алюминия может неслабо повредить кромку крыши или саму крышу при трении.

 

Правило четвёртое: заранее готовимся к худшему

Пример — кузова с безрамными стеклами. Автодилеры очень любят продавать задорого сезонную работу «пробрызгивание резинок силиконом». Это конечно маркетинг, но в нем есть доля пользы и правды. Стоит проверить состояние уплотнителей и подготовить их к холодам. А еще стоит повторять проверки и обработки регулярно, чтобы не рвать дверь на себя, рыча и матерясь, рискуя серьезно повредить уплотнитель.

Конечно, особенно опасно оставлять влагу на кузове и уплотнителях после мойки, ведь таким образом можно наглухо «запечатать» себя в салоне. Но тут правило и вовсе простое: в холода не пользуйтесь услугами случайных моек! В «АвтоБыстро» и иных точках, где клиента уважают, тщательно протрут порог и уплотнители, просушат сжатым воздухом.

 

Правило пятое: сочетаем возможности

Вы совсем не готовы ездить на «сугробе», грязный или заледеневший кузов вызывает у вас депрессию? Тогда просто заезжайте утром к нам на мойку! Очищайте стекла, обметайте снег – и прямой дорогой к нам. Кузов в процессе мойки прогреется, снег будет удален безвредно и бесконтактно.

Регулярное посещение мойки позволит создать защитный барьер от обледенения. Почти как на поверхности самолета. Правило простое: заказываем мойку с дополнительными опциями – «гиброфоб» или «нано» хотя бы при каждом втором, ну или при каждом третьем посещении «АвтоБыстро». И очень скоро магия заработает!

Только представьте: утро, сырой мороз, ночью шел снег. Весь двор заполнен сугробами неясных марок и цветов, а ваша красавица – глянцевая и яркая. С нее бесследно соскользнул мокрый снег, к ней не пристал липкий лед. Несколько движений щетки по стеклу – и в путь!

 

 

Цены на услуги по мойке кузова вы можете посмотреть здесь: Прайс «Автомойка»

Вы экономите время — Мы знаем, как вы цените свое время, уважаем это, поэтому действительно работаем быстро.
Вы оставляете автомобиль в надежных руках — все специалисты нашего сервиса имеют профильное техническое образование, регулярно участвуют и побеждают в профессиональных конкурсах.

Мойка автомобиля на партнерских автомоечных комплексах Wheely в Москве — Aide & FAQ

Мы знаем, как часто вам приходится тратиться на мойку. Чтобы эта процедура стала для вас выгоднее, мы договорились с рядом автомоечных комплексов на специальные цены для партнёров и водителей Wheely.

Для удобной навигации мы нанесли каждую мойку на карту:

Как получить скидку

1. Сообщите сотруднику о том, что вы выбрали «‎мойку Wheely»‎. Она может быть двух категорий — «Wheely Стандарт» или «Wheely Комплекс».

2. Покажите ваш водительский профиль из приложения (с фотографией).

3. Сотрудник мойки идентифицирует вас и предоставит услугу по специальной стоимости для водителей и партнеров Wheely.

Мойка автомобиля в компании Sis-Motors

Класс «Business»

Классы «First» и «Luxe»

Класс «XL»

Что входит в стоимость

• Мойка «Wheely Стандарт» — кузов, коврики, пороги, продувка кузова, полимер

• Мойка «Wheely Комплекс» — кузов, коврики, пороги, продувка кузова, полимер, пылесос, влажная уборка, багажник

Адрес мойки

Мойка автомобиля в компании Aritel

Класс «Business»

Классы «First» и «Luxe»

Класс «XL»

Что входит в стоимость

• Мойка «Wheely Стандарт» — кузов, коврики, пороги, продувка кузова, полимер

• Мойка «Wheely Комплекс» — кузов, коврики, пороги, продувка кузова, полимер, пылесос, влажная уборка, багажник

Адрес мойки

Мойка автомобиля в сети шинных центров «КОЛЕСО» г. Москва

Класс «Business/First/Luxe»

Класс «XL»

Что входит в стоимость

• Мойка «Wheely Стандарт» — кузов, коврики, пороги, продувка кузова

• Мойка «Wheely Комплекс» — кузов, коврики, пороги, продувка кузова, пылесос, влажная уборка

Адреса моек

Мойка автомобиля в компании «МОЙ АВТОМОБИЛЬ!»™

Класс «Business»

Классы «First» и «Luxe»

Класс «XL»

Что входит в стоимость

• Мойка «Wheely Стандарт» — кузов, коврики, пороги, сушка кузова без продувки

• Мойка «Wheely Комплекс» — кузов, коврики, пороги, чистка салона пылесосом, влажная уборка деталей интерьера салона, чистка всех стекол изнутри, сушка кузова без продувки.

Адреса моек

• 52-й км МКАД, владение 4 (внутр. сторона). Время работы — 24 ч.

• Ул. Мусы Джалиля 9 а. Время работы — 24 ч.

• г. Химки, ул. Кирова, стр. 29. Время работы — 24 ч.

• ул. Профсоюзная, д. 25 а. Время работы — 24 ч.

• Севастопольский проспект, д. 11 б. Время работы — 24 ч.

• Рубцовская набережная, д. 3, стр. 17. Время работы — 24 ч.

• Варшавское шоссе, вл. 201. Время работы — 24 ч.

• МКАД 38-й км. вл.6, стр. 2. (внутр. сторона). Время работы — 24 ч.

• ул. Воздвиженка, д. 10. Время работы — 24 ч.

Если у вас возникли вопросы по скидочной программе, пишите нам по адресу [email protected]

Комплекс

WASH регулирует комплекс Arp2 / 3 для экструзии полярных тел на основе актина в ооцитах мышей.

Локализация WASh2 и ARP2 во время мейотического созревания ооцитов мыши

Субклеточная локализация WASh2 на разных стадиях мейотического созревания ооцитов оценивалась с использованием иммунофлуоресцентного окрашивания против WASh2. Образцы ооцитов отбирали после культивирования в течение 0, 4, 8 или 12 ч, что соответствовало моментам времени, когда большинство ооцитов достигали стадий GV, GVBD, MI и MII соответственно. Как показано на фиг. 1A, в ооцитах GV WASh2 в основном распределялся вокруг зародышевых пузырьков и коры ооцитов. После стадии GVBD WASh2 был локализован в кортикальной области от MI до стадии MII. Мы также оценили локализацию ARP2 в ооцитах. Как показано на фиг. 1B, линейный анализ интенсивности флуоресценции показал, что пик в кортикальной области каждой стадии ооцита. Результаты показали, что WASh2 в основном локализуется в области коры от GV до стадии MII.

Рисунок 1

Локализация WASh2 и ARP2 во время мейотического созревания мышей.

(A) Субклеточная локализация WASh2 во время мейоза ооцитов мыши на основе окрашивания антителом против WASh2. От стадии GV до стадии MII окрашивание WASh2 было самым высоким в коре ооцитов мышей. Зеленый, WASH; синий, хроматин. Бар = 20 мкм. (B) Линейный анализ интенсивности флуоресценции на каждой стадии ооцита.

Комплекс WASH влияет на экструзию первого полярного тельца и асимметричное деление ооцита мыши

Для дальнейшего изучения функциональной роли комплекса WASH во время мейотического созревания ооцита мы использовали инъекции морфолино (MO) WASh2 и антитела к Струмпеллину. Как показано на фиг. 2A, экспрессия WASh2 была значительно снижена после инъекции WASh2 MO (0,53 против 0,06 для диапазона тока, p <0,05). Более того, вестерн-блоттинг и денситометрический анализ показали, что уровень экспрессии струмпеллина также снижался после инъекции WASh2 MO (0,45 ± 0,01 против 0,22 ± 0,05, p <0,05) (рис. 2B), что продемонстрировало, что WASh2 регулирует активность струмпеллина в WASH. комплекс ооцитов. Как показано на фиг. 2C, после 12 ч культивирования большинство ооцитов, инъецированных WASh2 MO или антителом к ​​Strumpellin, не смогли экструдировать первое полярное тельце, и несколько ооцитов подверглись симметричному делению.

Рисунок 2

Комплекс WASH регулирует экструзию первого полярного тела и асимметричное деление.

(A) Результаты вестерн-блоттинга для WASh2 в МО WASh2 и контрольных группах ооцитов представляли собой кроп-гели. Молекулярная масса WASh2 составляет 70 кДа, а α-тубулина — 55 кДа. Относительную интенсивность окрашивания WASh2 или α-тубулина оценивали с помощью денситометрии. (B) Результаты вестерн-блоттинга для Strumpellin в группах ооцитов, инъецированных WASh2, и контрольных MO, представляли собой обрезанные гели.Молекулярная масса струмпеллина составляет 134 кДа, а β-актина — 43 кДа. Относительную интенсивность окрашивания струмпеллином или β-актином оценивали с помощью денситометрии. (C) Нарушение мейотического созревания ооцитов после ингибирования WASh2 и Strumpellin. Бар = 80 мкм. (D) Покадровый микроскопический анализ созревающих ооцитов в группах ооцитов с инъекцией контрольного МО и инъецированного WASh2-МО. В контроле веретена перемещались в кору и вытесняли полярные тельца, тогда как в ооцитах, инъецированных WASh2 MO, ооциты подвергались симметричному делению или не могли экструдировать полярные тельца.Бар = 20 мкм. (E) Скорость экструзии первого полярного тельца и симметричного деления после 12 ч в культуре для групп, которым вводили WASh2 MO и контрольную MO, и группы, которым вводили антитело Strumpellin, и контрольные группы. *, достоверно отличается (p <0,05).

Затем визуализация живых клеток с помощью покадровой микроскопии использовалась для изучения динамических изменений, которые происходили в созревающих ооцитах после инъекций WASh2 MO. Как показано на рис. 2D, в контрольной группе с инъекцией МО хромосомы перемещались в сторону коры, после чего ооциты обычно вытесняли полярное тельце.Напротив, в группе, получавшей WASh2 MO, наблюдались два фенотипа: (1) хромосомы разделены в центральной цитоплазме и произошло симметричное деление; и (2) хромосомы разделились, хотя они снова соединились, и ооциты, по-видимому, стали сморщенными, хотя затем они вернулись к нормальному состоянию; во время этих событий полярное тело не вытеснялось.

Мы также определили скорость экструзии полярных телец и симметричного деления в контрольных и обработанных ооцитах. Как показано на рис. 2E, только небольшая часть ооцитов экструдировала первое полярное тельце в группе, получавшей WASh2 MO (23.6 ± 2,0%; n = 44), в то время как большая часть ооцитов выделила первое полярное тельце в контрольной группе, инъецированной МО (64,7 ± 2,8%; n = 59; p <0,05). Точно так же в группе, в которой вводили антитело к Стрампеллину, только небольшая часть ооцитов выдавила полярное тельце (17,5 ± 1,5%; n = 60), в то время как большая часть ооцитов выдавила первое полярное тельце в контрольной группе (74,8 ± 3,3%). ; n = 55; p <0,05). Более того, скорость симметричного деления в группах, которым вводили WASh2 MO и антитела к Струмпеллину (10.0 ± 0,7%, n = 65; и 6,5 ± 0,9%, n = 58, соответственно) были значительно выше, чем в контрольной группе, получавшей МО, и контрольной группе (1,0 ± 0,5%, n = 46; и 0, n = 38, соответственно; оба p <0,05) .

Комплекс WASH влияет на организацию веретена во время мейоза ооцитов

Мы оценили влияние WASh2 и Strumpellin на организацию и морфологию веретена. Как показано на фиг. 3B, после 9 часов культивирования контрольных ооцитов хромосомы накапливались в средней пластине, и формировались веретена, которые двигались к коре головного мозга.Однако в группах, которым вводили WASh2 MO и антитело к Strumpellin, ооциты обнаруживали различные типы морфологически дефектных веретен. В группе с введением МО WASh2 основными дефектами были два полюса удлиненных шпинделей. Другие дефекты включали веретено с несколькими полюсами или без них, в то время как хромосомы были рассредоточены или отставали. В группе, в которой вводили антитело к Струмпеллину, основным дефектом были аномальные веретена со многими смещенными хромосомами. Другие дефекты включали несформированные веретена с астральными микротрубочками, а также множество цитоплазматических звездочек или веретен без полюсов.Частота аномальных веретен в группах, которым вводили WASH MO и антитело Стрампеллин, была значительно выше, чем в соответствующих контрольных группах, которым вводили MO и контрольные антитела (45,2 ± 2,0%, n = 38 против 19,3 ± 1,4%, n = 46 , p <0,05; и 37,9 ± 3,9%, n = 49 против 8,8 ± 1,0%, n = 51; все p <0,05; рис. 3C).

Рисунок 3

Комплекс WASH регулирует формирование веретена.

(A) Морфология веретена после ингибирования WASh2 и Strumpellin. В группах инъекций WASH MO и Струмпеллина ооциты имели морфологически дефектные веретена.Бар = 20 мкм. (B) Процент ооцитов с аномальными веретенами в группах инъекции WASh2 MO и контрольной группе MO, а также в группах инъекции антитела Strumpellin и контрольных группах. Результаты представляют собой средние значения ± SEM 3 независимых экспериментов. Разные буквы указывают на существенные различия (p <0,05).

Комплекс WASH влияет на распределение актиновых филаментов во время мейотического созревания ооцитов.

Для дальнейшего изучения причины аберрантного прогрессирования созревания ооцитов мы сначала исследовали образование актиновой шапочки, характерную особенность поляризации ооцитов.Как показано на рис. 4А, хромосомы в контрольной группе переместились в кору и образовали актиновую шапку через 8,5 ч культивирования, тогда как в группе, получавшей инъекцию WASh2 MO или антитела к Струмпеллину, большинство веретен оставалось в центральных положениях ооцитов, а не в группе. образуются актиновые шапочки. После культивирования в течение 9,5 часов большинство хромосом сегрегировалось в области коры головного мозга с сильным актиновым колпачком в контрольных ооцитах, тогда как в группе, получавшей инъекции WASh2 MO или антитела к Струмпеллину, большинство хромосом также оставалось в центральной цитоплазме без актинового колпачка. .После культивирования в течение 12 часов в контрольной группе сформировались маленькие полярные тельца и большие ооциты MII, а микротрубочки веретена располагались под областью коры, где сформировались эти актиновые шапки. Напротив, ооциты были арестованы на стадии MI без актинового кэпа в группе, инъецированной WASH MO, или в группе, инъецированной антителом к ​​Струмпеллину.

Рисунок 4

Комплекс WASH регулирует образование актиновой шапочки и распределение актиновых филаментов.

(A) На стадиях MI, ATI и MII актиновые шапки образовывались в контрольной группе, тогда как актиновые шапки не образовывались в ооцитах, инъецированных WASh2 MO или антителом к ​​Струмпеллину.Стрелка указывает на актиновый колпачок. Зеленый, тубулин; синий, хроматин; красный, актин. Бар = 20 мкм. (B) Результаты покадровой микроскопии распределения актиновых филаментов в контрольной группе с инъекцией MO и WASh2 с инъекцией MO. В контрольной группе, получавшей инъекцию МО, хромосомы двигались к коре и вытесняли полярное тельце; сигналы актина были сильными во время этого процесса. Напротив, в группе, получавшей WASh2 MO, сигналы актина постепенно снижались по интенсивности во время этого процесса. Красный, хроматин; зеленый, актин; белый, ДИК.Бар = 40 мкм. (C) Распределение актиновых филаментов в мембранах ооцитов и цитоплазме после обработки. Во время стадии ИМ количество актина умерло в цитоплазме и мембранах ооцитов, инъецированных WASh2 MO или антителом к ​​Струмпеллину. Зеленый, тубулин; синий, хроматин; красный, актин. Бар = 20 мкм. (D) Средняя интенсивность флуоресценции актина в мембранах ооцитов мышей и цитоплазме. *, достоверная разница (р <0,05).

Затем мы исследовали распределение актиновых филаментов и их относительное количество во время мейоза ооцитов мыши с помощью покадровой микроскопии.Как показано на фиг. 4B, в контрольной группе с инъекцией МО хромосомы перемещались к коре и вытесняли полярное тельце; сигналы актина были сильными в коре головного мозга рядом с хромосомой. В группе, получавшей WASh2 MO, хромосомы перемещались в сторону коры ооцита, но не могли вытеснить полярное тельце; сигналы актина в коре постепенно уменьшаются.

Для дальнейшего изучения взаимосвязи между WASh2 и актином мы исследовали распределение актиновых филаментов и их относительное количество как в мембране, так и в цитоплазме с помощью напряжения Phalloidin-TRITC.Как показано на фиг. 4C, интенсивность флуоресценции мембранного актина в группе, получавшей WASh2 MO или антитела к Strumpellin, была значительно ниже, чем в контрольной группе, инъецированной MO или контрольной группе (29,0 ± 3,8% по сравнению с 50,2 ± 4,5%, n = 45 ; и 20,5 ± 1,7% против 51,7 ± 6,1%, n = 45, соответственно; оба p <0,05; рис. 4D). Мы также исследовали среднюю интенсивность флуоресценции актина в цитоплазме. Средняя интенсивность флуоресценции цитоплазматического актина в группе инъецированных WASh2 MO или антител к Strumpellin была значительно ниже по сравнению с таковой в контрольной MO или контрольных ооцитах (8.5 ± 1,0% против 16,2 ± 1,4%, n = 45; и 13,1 ± 0,8% против 19,8 ± 2,1%, n = 45 соответственно; оба p <0,05; Рис. 4D).

Комплекс WASH регулирует экспрессию ARP2 во время мейоза ооцитов мыши

Участие комплекса Arp2 / 3 в образовании новых разветвленных актиновых филаментов зависит от их взаимодействия с факторами, способствующими нуклеации (NPF), которые включают комплекс WASH. Чтобы подтвердить взаимосвязь между комплексом WASH и комплексом Arp2 / 3 во время мейоза ооцитов, мы исследовали экспрессию Arp2 с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания после инъекции ооцитов морфолино WASh2 или антителом к ​​Струмпеллину.Как показано на фиг. 5A, иммунофлуоресцентное окрашивание ARP2 было сконцентрировано в основном в коре головного мозга контрольных ооцитов, инъецированных MO, или контрольных ооцитов после культивирования в течение 9 часов, тогда как в ооцитах, инъецированных WASh2 MO или антителом к ​​Струмпеллину, ARP2 был рассредоточен по всей цитоплазме и без конкретной локализации. Интенсивность флуоресценции ARP2 в группах, которым вводили WASH MO и антитело Strumpellin, была значительно ниже, чем у соответствующих контрольных групп, которым вводили MO, и контрольных групп, которым вводили антитело (13.1 ± 1,6% против 48 ± 4,1%, p <0,05; и 13,6 ± 1,1% против 55,1 ± 6,1%, p <0,05; Рис. 3Б). Более того, вестерн-блоттинг и денситометрический анализ показали, что уровень экспрессии ARP2 в ооцитах, инъецированных WASh2 MO, был резко снижен по сравнению с таковым в контрольных ооцитах, инъецированных MO (0,33 ± 0,01 против 0,12 ± 0,05, p <0,05) (рис. 5C). .

Рисунок 5

Комплекс WASH регулирует экспрессию ARP2.

(A) Экспрессия ARP2 после культивирования в течение 9 часов. В контрольной группе ARP2 экспрессировался в основном на мембране, тогда как экспрессия ARP2 была значительно снижена в ооцитах, которым вводили WASh2 MO или антитело к Strumpellin.Зеленый, ARP2; синий, хроматин. Бар = 20 мкм. (B) Средние интенсивности флуоресценции ARP2 определяли в ооцитах мышей после инъекции WASh2 MO или антитела к Strumpellin. *, достоверная разница (р <0,05). (C) Обрезанные гели были использованы для наших результатов вестерн-блоттинга. Результаты вестерн-блоттинга показали, что экспрессия ARP2 была значительно снижена после инъекции WASh2 MO. Молекулярная масса ARP2 составляет 43 кДа, а α-тубулина - 55 кДа. Относительную интенсивность окрашивания ARP2 или α-тубулина оценивали с помощью денситометрии.

Эволюционная консервация комплекса WASH, машины полимеризации актина, участвующей в эндосомном делении

Резюме

WASH — это активирующий белок Arp2 / 3, который локализуется на поверхности эндосом, где он вызывает образование разветвленных актиновых сетей. Эта активность WASH способствует, в сотрудничестве с динамином, делению транспортных промежуточных звеньев из эндосом и, следовательно, регулирует эндосомный перенос нескольких грузов. Мы очистили новый стабильный мультибелковый комплекс, содержащий WASH, комплекс WASH, и мы исследуем здесь эволюционную консервацию его семи субъединиц в различных типах эукариот.Этот анализ подтверждает идею о том, что изобретение комплекса WASH включало включение независимого комплекса, гетеродимера CapZ α / β, образующего так называемый Capping Protein (CP), как показано на дрожжах S. cerevisiae и S. pombe , которые содержат гетеродимер CP, но не имеют других субъединиц комплекса WASH. Выравнивания ортологичных генов, которые мы создали, дают представление о сохранении различных субъединиц и их организации в домены.Кроме того, мы предлагаем здесь уникальную номенклатуру для различных подразделений, чтобы предотвратить будущую путаницу в этой области.

Ключевые слова: Arp2 / 3 комплекс, эндосома, VPEF, KIAA0592, KIAA1033, струмпеллин, KIAA0196, CP, CapZ, Ccdc53

Комплекс WASH был выделен из клеток человека тандемной аффинной очисткой. ¹ WASH был связан с VPEF, KIAA1033, Strumpellin, Ccdc53, CapZ α и β. Нативный белок WASH находится в большом комплексе, характеризующемся радиусом Стокса 88 Å и коэффициентом седиментации 12.5 S. ¹ Кроме того, истощение любого из вышеупомянутых белков, связанных с WASH, дестабилизирует WASH. Вместе эти свойства совместимы со стабильным комплексом, содержащим по одной молекуле каждого из этих белков. Ожидается, что все гены, кодирующие 7 субъединиц этой молекулярной машины, будут обнаружены у видов, у которых эта организация в мультипротеиновый комплекс сохранена. Итак, используя алгоритм BLAST, мы искали в общедоступных базах данных белки, гомологичные очищенным нами.Гены, кодирующие субъединицы комплекса WASH, были обнаружены в геномах животных, грибов и видов амеб. Но ни одна из субъединиц не была обнаружена в геномах бактерий и растений. Ортологические субъединицы были извлечены и сравнены с субъединицами мыши, выбранными в качестве эталона вместо человеческих, чтобы избежать сложности человеческого семейства WASH. ^{2 , 3}

Две субъединицы, формирующие CP cap актиновые филаменты и, следовательно, блокируют удлинение филаментов. Две субъединицы CP, но не другие субъединицы комплекса WASH, были обнаружены в S.cerevisiae и дрожжи S. pombe . То же самое справедливо и для других секвенированных грибов. Поскольку амеба D. discoideum обладает большинством субъединиц комплекса WASH, предок грибов и амеб, вероятно, обладал этими генами, что позволяет предположить, что комплекс WASH впоследствии был утрачен в грибах. В геномах грибов наличие CP без комплекса WASH соответствует свободному гетеродимеру, представляющему основной пул CP независимо от комплекса WASH. ^{1 , 4} Гетеродимер CP также является неотъемлемым компонентом комплекса Dynactin. ^{1 , 4} Множество взаимодействий CP с актином, комплексом WASH и комплексом динактина должны оказывать сильное избирательное давление на гены CP, что, вероятно, объясняет, почему эти гены, кодирующие субъединицы комплекса WASH, являются одними из самых распространенных. консервированные.

Субъединица WASH активирует комплекс Arp2 / 3 через свой домен VCA на своем С-конце. Длина этого домена составляет около 100 аминокислот. WASH означает белок синдрома Вискотта-Олдрича и гомолог SCAR. ³ Это описательное имя пришло само по себе и заменило ранее использовавшееся Orf19. ² Организация WASH действительно очень похожа на организацию WASP и активаторов SCAR / WAVE комплекса Arp2 / 3. Основываясь на этой аналогии, N-концевой домен WAHD, охватывающий первые 300 аминокислот, вероятно, будет неотъемлемой частью мультипротеинового комплекса, подобного N-концевому домену SCAR / WAVE в пентамерном комплексе SCAR / WAVE и N- концевой домен N-WASP, который объединяет N-WASP с белками семейства WIP. ⁵ Остальная часть WASH, включая домен VCA, по прогнозам, будет неструктурированной ( Suppl. Fig. 2 ).

Субблок VPEF представляет большой интерес, но сбивает с толку. Впервые VPEF был охарактеризован как фактор, необходимый для проникновения вируса осповакцины в клетки млекопитающих, отсюда и название «Фактор PEnetration» осповакцины. ⁶ К сожалению, эта публикация была упущена из виду в двух последних публикациях, в которых сообщается о связи VPEF с WASH. Мы использовали название кДНК, KIAA0592, для обозначения этого белка. ¹ Гомес и Билладо использовали название FAM21, что означает СЕМЕЙСТВО № 21, введенное в автоматические аннотации семейств белков. ⁷ Мы рекомендуем использовать название VPEF, которое является передним и описательным. Основной пул комплекса WASH и, следовательно, VPEF связан с эндосомами. ^{1 , 7} Тем не менее, комплекс WASH рекрутируется на плазматическую мембрану при заражении патогенами. WASH обнаруживается в местах прикрепления сальмонелл и участвует во проникновении этой патогенной бактерии в клетку. ⁸ Точно так же подавление VPEF препятствует проникновению вируса осповакцины. ⁶ Однако неожиданным результатом стало то, что проникновение осповакцины также блокируется внеклеточными антителами, направленными против VPEF, или растворимым VPEF в культуральной среде, как если бы VPEF играл роль внеклеточного рецептора вируса. ⁶ Эти наблюдения еще предстоит объяснить, поскольку комплекс WASH является цитозольным и трансмембранный домен не предсказывается в белке VPEF. VPEF в целом плохо консервативен, и процент идентичности у позвоночных падает так быстро, что ортологи беспозвоночных не обнаруживаются ().350 N-концевых аминокислот VPEF необходимы и достаточны для построения комплекса WASH. ⁷ Этот результат согласуется с консервативностью, сосредоточенной в N-концевом домене (). Сразу после этого домена, VPEF, по прогнозам, с большой вероятностью будет неупорядоченным ( Suppl. Fig. 2 ). Это отсутствие внутренней структуры для большей части белка может объяснить, почему VPEF очень чувствителен к протеазам и не мигрирует в ожидаемом размере после очистки комплекса WASH. ¹

(A) Процент идентичности ортологичных субъединиц комплекса WASH у разных видов. Более дюжины генов WASH присутствует в Homo sapiens , и точное количество варьируется от человека к человеку. ^{2 , 3} Таким образом, ссылка была сделана на ортолог Mus musculus . Количество CapZ α указано в скобках, если их больше одного. За эталон был взят мышиный CapZ α1, и% идентичности рассчитывали по ближайшему гомологу у видов, обладающих более чем одним паралогичным геном CapZ α.Н.Д .: Не обнаружено. Инвентарные номера генов можно найти в дополнительных. (B) Известные установленные отношения между выбранными видами из разных типов эукариот. ¹¹

Процент сходства ортологичных субъединиц комплекса WASH, отображаемых с помощью цветовой кодировки, чтобы выделить организацию домена. Яркие цвета олицетворяют высшую степень сохранности. Оценка сходства в каждой позиции рассчитывалась по каждому множественному выравниванию, включая ортологи всех субъединиц, описанные с использованием Jalview.Затем эти оценки усредняли с использованием скользящего окна из 10 остатков и кодировали цветом с помощью программного обеспечения MAT LAB. Это представление дает обзор организации субъединиц в домены, но не может использоваться для сравнения консервации между субъединицами, поскольку количество обнаруженных ортологичных генов варьируется. График VPEF, например, получен только из четырех ортологичных генов.

Субъединица Струмпеллина мутирует у пациентов с наследственной спастической параплегией.Он назван в честь врача Струмпелла, который впервые описал болезнь более 100 лет назад. ⁹ Три миссенс-мутации были идентифицированы в неродственных семьях. ¹⁰ Струмпеллин — один из наиболее консервативных белков комплекса WASH, и эти мутации, вероятно, влияют на структуру Струмпеллина. Мутантные аллели Strumpellin являются доминантными, что позволяет предположить, что половины дозы WT Strumpellin недостаточно для поддержания фенотипа WT или что мутантный Strumpellin блокирует сборку функциональных комплексов WASH, несмотря на присутствие WT Strumpellin доминантно-негативным образом.

Субъединица KIAA1033 также хорошо консервативна, как и Струмпеллин. Последние 100 аминокислот, однако, соответствуют плохо консервативной области, которая, как предполагается, внутренне неструктурирована ( Suppl. Figs. 2 and 4 ).

Субъединица Ccdc53 является второй менее консервативной субъединицей после VPEF. Он не может быть обнаружен в D. discoideum , хотя функциональный ортолог, вероятно, существует у этого вида, где обнаруживаются 5 из 7 субъединиц (). Его название происходит от домена Coiled-coil, содержащего белок 53, из-за короткой и консервативной спирали, предсказанной в N-концевом домене.В этом белке два блока консервативных остатков чередуются с двумя вариабельными областями, которые, по прогнозам, сильно разупорядочены ( Suppl. Fig. 2 ).

Понимание того, как эти 7 субъединиц собираются в функциональную машину полимеризации актина, имеет большое фундаментальное значение и может также дать объяснение того, почему наследственная спастическая параплегия возникает у пациентов, затронутых мутациями Strumpellin.

Комплекс WASH, эндосомальный активатор Arp2 / 3, взаимодействует с комплексом синдрома Германского-Пудлака BLOC-1 и его грузовой фосфатидилинозитол-4-киназой типа IIα

Mol Biol Cell.2013 15 июля; 24 (14): 2269–2284.

PV Ryder

^a Кафедра клеточной биологии, Университет Эмори, Атланта, Джорджия 30322

R. Vistein

^b Биологические науки, Университет Карнеги-Меллона, Питтсбург, Пенсильвания 15213

A. Gokhale

a Департамент клеточной биологии, Университет Эмори, Атланта, Джорджия, 30322

MN Seaman

^c Кембриджский институт медицинских исследований / Департамент клинической биохимии, Кембриджский университет, Кембридж CB2 2QR, Соединенное Королевство

M.А. Путенведу

^b Биологические науки, Университет Карнеги-Меллона, Питтсбург, Пенсильвания 15213

В. Фаундес

^a Кафедра клеточной биологии, Университет Эмори, Атланта, Джорджия 30322

Кейт Э. Мостов, редактор мониторинга

Калифорнийский университет, Сан-Франциско

^a Отделение клеточной биологии, Университет Эмори, Атланта, Джорджия 30322

^b Биологические науки, Университет Карнеги-Меллона, Питтсбург, Пенсильвания 15213

^c Кембриджский институт медицинских исследований / Департамент клинической биохимии, Кембриджский университет, Кембридж CB2 2QR, Соединенное Королевство

Получено 12 февраля 2013 г .; Пересмотрено 7 мая 2013 г .; Принята в печать 9 мая 2013 г.

Авторские права © 2013 Ryder et al. Эта статья распространяется Американским обществом клеточной биологии по лицензии авторов. Через два месяца после публикации он становится общедоступным под лицензией Creative Commons License с указанием авторства и некоммерческого использования 3.0 (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/3.0).

«ASCB®», «Американское общество клеточной биологии®» и «Молекулярная биология клетки®» являются зарегистрированными товарными знаками Американского общества клеточной биологии.

Эта статья цитируется в других статьях в PMC.

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы

GUID: BA30A07A-40CD-4CC1-88B7-13C9D028F158

GUID: B4A6060A-6E0D-4CBC-B6CD-0575149F0A33

GUID: 35190B96-B6B0-4753-8759-E8A5825B8BF5

GUID: AA52F3A6-1B0A-4E8B-AA34-541864D

Abstract

Компоненты механизмов биогенеза везикул, такие как белки оболочки, могут взаимодействовать с актиновым цитоскелетом для сортировки грузов по нескольким путям.Однако неизвестно, являются ли эти взаимодействия общим требованием для разнообразных маршрутов трафика эндосом. В этом исследовании мы идентифицируем актиновые регуляторы цитоскелета как ранее нераспознанные интеракторы комплексов, ассоциированных с синдромом Hermansky-Pudlak. Два комплекса, мутировавшие при синдроме Германского-Пудлака, комплекс адаптивного белка-3 и биогенез связанного с лизосомами комплекса органелл-1 (BLOC-1), взаимодействуют и регулируются липидкиназой фосфатидилинозитол-4-киназой типа IIα (PI4KIIα) .Поэтому мы предположили, что PI4KIIα взаимодействует с новыми регуляторами этих комплексов. Чтобы проверить эту гипотезу, мы иммуноаффинно очистили PI4KIIα из меченных изотопами клеточных лизатов для количественной идентификации взаимодействующих веществ. Поразительно, что выделение PI4KIIα предпочтительно кообогащено белками, которые регулируют актиновый цитоскелет, включая факторы обмена гуанина для GTPases семейства Rho, таких как RhoGEF1 и несколько субъединиц комплекса WASH. Мы биохимически подтвердили некоторые из этих взаимодействий PI4KIIα.Важно, что комплекс BLOC-1, комплекс WASH, RhoGEF1 или истощение PI4KIIα изменяют содержание и / или субклеточное распределение BLOC-1-чувствительных грузов PI4KIIα, ATP7A и VAMP7. Мы пришли к выводу, что комплекс синдрома Hermansky-Pudlak BLOC-1 и его груз PI4KIIα взаимодействуют с регуляторами актинового цитоскелета.

ВВЕДЕНИЕ

Везикулярный транспорт — это общий клеточный механизм, с помощью которого органеллы секреторного и эндоцитарного путей избирательно обмениваются компонентами.Этот механизм обмена требует скоординированных шагов, которые включают сортировку и концентрацию груза мембранных белков в формирующихся пузырьках, деформацию и расслоение мембран, направленное движение через цитозоль и слияние в органелле-мишени (Bonifacino and Glick, 2004). Многие из этих шагов требуют механической силы, которая генерируется в путях передачи пузырьков за счет объединения специализированных молекулярных машин. Эти молекулярные машины включают белки оболочки, которые сортируют груз мембранных белков, белки BAR-домена, чтобы ощущать или вызывать деформацию мембраны, динамин GTPase для разрыва мембраны, а также связки и растворимые комплексы рецептора белка прикрепления (SNARE), чувствительного к N -этилмалеимиду (SNARE), для слияние мембран (Kaksonen et al., 2005; Шмид и МакМахон, 2007; МакМахон и Букро, 2011 г .; Викнер и Шекман, 2008; Brocker et al. , 2010; Тейлор и др. , 2011). В то время как некоторые из этих машин по своей природе способны генерировать силы, например, динамин и комплексы слияния SNARE (Schmid and Frolov, 2011; Ferguson and De Camilli, 2012; Gao et al. , 2012), другие требуют ассоциации с актином или цитоскелет микротрубочек. Например, белки оболочки сортируют груз мембранных белков на возникающие везикулы.В дополнение, однако, некоторые белки оболочки также связывают цитоскелетные компоненты как для биогенеза везикул, так и для направленного движения (Nakagawa et al. , 2000; Styers et al. , 2004; Kaksonen et al. , 2006; Delevoye et al. др. , 2009; Anitei и др. , 2010; Anitei and Hoflack, 2012; Mooren и др. , 2012).

Фундаментальный вопрос без ответа касается степени, в которой это цитоскелетное взаимодействие является общим принципом функции белков оболочки.Одним из наиболее хорошо охарактеризованных взаимодействий между аппаратом доставки пузырьков и цитоскелетом является образование пузырьков на плазматической мембране с помощью клатриновой и адапторной оболочки AP-2. В этом пути биогенеза везикул факторы, связанные с оболочкой и оболочкой, такие как белки BAR-домена, локально регулируют полимеризацию и организацию актиновых филаментов. Полимеризация актина в значительной степени зарождается комплексом Arp2 / 3 и его активатором, фактором, способствующим нуклеации, нервным белком синдрома Вискотта – Олдрича (N-WASP; Conner and Schmid, 2003; Kaksonen et al., 2005, 2006; Шмид и МакМахон, 2007; МакМахон и Букро, 2011 г .; Тейлор и др. , 2011 г .; Mooren et al. , 2012). Недавняя идентификация фактора, способствующего зародышеобразованию, который специфически локализуется в эндосомах, гомологе WASP и SCAR (WASH; Derivery et al. , 2009; Gomez and Billadeau, 2009), предполагает, что ассоциация оболочки с актиновым цитоскелетом может быть общий принцип, действующий в генерации пузырьков. Подтверждая эту возможность, истощение WASH приводит к функциональным дефектам рециклинга, путей переноса от эндосомы к Гольджи и от эндосомы к лизосомам (Derivery et al., 2009 г .; Гомес и Билладо, 2009; Gomez et al. , 2012 г .; Дуле и Велч, 2010; Carnell et al. , 2011 г .; Zech et al. , 2011 г .; Harbour et al. , 2012 г .; Hao et al. , 2013; Piotrowski et al. , 2013). Однако на сегодняшний день описано, что WASH взаимодействует только с одним комплексом эндосомной оболочки, ретромерным комплексом, который в первую очередь сортирует грузы по пути от эндосомы к Гольджи (Gomez and Billadeau, 2009; Gomez et al., 2012 г .; Harbour et al. , 2012 г .; Jia et al. , 2012 г .; Моряк, 2012 г .; Hao et al. , 2013; Helfer et al. , 2013). Следовательно, координируется ли эндосомная оболочка с актиновым цитоскелетом в качестве общего принципа, не было проверено.

Мы предоставляем доказательства, подтверждающие эту гипотезу, путем беспристрастной идентификации взаимодействия между комплексом WASH и сортировочными комплексами, связанными с синдромом Германского – Пудлака. Этот синдром генетически определяется дефектами четырех молекулярных комплексов: оболочки адапторного белкового комплекса-3 (AP-3) и биогенеза связанных с лизосомами комплексов органелл от -1 до -3 (BLOC-1 до BLOC-3).Кроме того, генетические дефекты в специфических Rabs и регуляторных ферментах запускают фенотипы, подобные синдрому Hermansky-Pudlak (Bultema and Di Pietro, 2013). Дефекты этих комплексов у млекопитающих и беспозвоночных приводят к гипопигментации, дисфункции тромбоцитов, фиброзу легких и, в некоторых случаях, иммунной дисфункции и неврологическим фенотипам (Newell-Litwa et al. , 2007; Raposo and Marks, 2007; Raposo и др. , 2007; Huizing и др. , 2008; Dell’Angelica, 2009; Wei and Li, 2013).Эти фенотипы являются следствием нарушенного переноса грузов между ранними эндосомами и органеллами-мишенями, такими как связанные с лизосомами органеллы и синаптические пузырьки (Newell-Litwa et al. , 2007; Raposo and Marks, 2007; Raposo et al. , 2007). ; Huizing и др. , 2008; Dell’Angelica, 2009; Wei and Li, 2013). Следовательно, изучение молекул и функциональных механизмов этих комплексов расширяет наше понимание молекулярных основ синдрома Hermansky-Pudlak и позволяет нам проверить фундаментальные вопросы, касающиеся принципов процессов везикулярного транспорта.

Чтобы идентифицировать функциональные механизмы комплексов, связанных с синдромом Германского-Пудлака, мы сосредотачиваемся на прикрепленной к мембране и локализованной в эндосомах липидкиназе, фосфатидилинозитол-4-киназе типа IIα (PI4KIIα; Balla et al. , 2002; Guo ). и др. , 2003; Миноуг и др. , 2006; Крейдж и др. , 2008). Биохимические и генетические данные показывают, что PI4KIIα регулирует и связывает два комплекса, мутировавших при синдроме Германского-Пудлака, AP-3 и BLOC-1 (Craige et al., 2008 г .; Salazar et al. , 2009 г .; Larimore et al. , 2011 г .; Gokhale et al. , 2012а). Поэтому мы предположили, что PI4KIIα будет взаимодействовать с новыми белками, модулирующими функцию BLOC-1 и AP-3. Чтобы проверить эту гипотезу, мы выделили PI4KIIα и его интеракторы путем количественной иммуноаффинной очистки из лизатов поперечно-сшитых клеток in vivo. PI4KIIα предпочтительно коизолирован с белками, которые регулируют полимеризацию актинового цитоскелета, включая комплекс WASH и RhoGEF1.Истощение PI4KIIα, субъединиц BLOC-1, RhoGEF1 или комплекса WASH изменяет содержание других компонентов во взаимодействии PI4KIIα, тем самым устанавливая генетические взаимодействия в дополнение к физическим взаимодействиям. Кроме того, истощение комплекса WASH привело к изменениям в морфологии эндосомы PI4KIIα и неправильной локализации двух грузов BLOC-1, переносчика меди болезни Менкеса ATP7A и лизосомного SNARE, VAMP7. Мы предполагаем, что различные оболочки, такие как clathrin-AP-2, retromer и AP-3-BLOC-1, используют общие принципы для накопления силы или создания дискретных мембранных доменов с помощью локализованной сборки актинового полимера.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Интерактом PI4KIIα обогащает актин-регуляторные белки

PI4KIIα связывает комплексы AP-3 и BLOC-1, и эти взаимодействия регулируют его внутриклеточное распределение (Craige et al. , 2008; Salazar et al. ). , 2009; Ларимор и др. , 2011; Гохале и др. , 2012a). Кроме того, липидкиназная активность PI4KIIα регулирует рекрутирование комплекса оболочки AP-3 и BLOC-1 на эндосомные мембраны (Craige et al., 2008 г .; Salazar et al. , 2009 г.). Поэтому мы предположили, что интеракторы PI4KIIα являются ранее неизвестными регуляторами комплексов AP-3 и BLOC-1, ассоциированных с синдромом Hermansky-Pudlak. Мы проверили эту гипотезу путем выделения эндогенного PI4KIIα и взаимодействующих белков. Чтобы изолировать PI4KIIα, мы продуцировали антитело к пептиду, содержащему мотив сортировки дилейцина, который необходим для взаимодействия PI4KIIα с комплексами AP-3 и BLOC-1 (дополнительный рисунок S1A; Craige et al., 2008 г.). Мутация мотива сортировки дилейцина отменяет распознавание PI4KIIα этим антителом с помощью иммуноблоттинга (дополнительный рисунок S1A). Поэтому мы предположили, что это антитело будет конкурировать с AP-3 за связывание с PI4KIIα и, таким образом, предпочтительно обогащать PI4KIIα, который не связывается с AP-3. Эта стратегия дизайна позволила обогатить PI4KIIα-взаимодействующие белки, которые находятся выше или ниже связывания AP-3. Установив, что это антитело специфически распознает PI4KIIα, мы иммунопреципитировали PI4KIIα из лизатов клеток нейробластомы с минимальными поперечными связями SHSY-5Y (дополнительный рисунок S1A и).Как мы подробно охарактеризовали, эта стратегия перекрестного сшивания: 1) стабилизирует белковые взаимодействия, что позволяет применять строгие стратегии биохимической изоляции, как описано ниже; 2) использует проницаемый для клеток и химически восстанавливаемый сшивающий агент, дитиобис сукцинимидилпропионат (DSP; Lomant and Fairbanks, 1976), который позволяет сшивание in vivo, но поддается идентификации белков с помощью масс-спектрометрии и иммуноблоттинга; и 3) ненасыщает, чтобы минимизировать стабилизацию неродственных белковых комплексов (Salazar et al., 2009 г .; Zlatic et al. , 2010; Gokhale et al. , 2012а, б; Perez-Cornejo et al. , 2012). Окрашивание серебром иммунопреципитированных белковых комплексов выявило несколько полипептидов, которые коизолируются с PI4KIIα (, дорожка 5). Как и ожидалось, некоторые из этих коизолированных полипептидов не были обнаружены в контрольных реакциях, где избыток антигенного пептида PI4KIIα превосходил эндогенный белок за связывание с иммунопреципитационным антителом (полоса 4). Однако при элюировании белковых комплексов из шариков, покрытых антителами, буфером для образца Лэммли высвобождались фоновые полипептиды, которые препятствовали идентификации PI4KIIα и взаимодействующих белков с помощью окрашивания серебром (дорожки 3–5).По этой причине мы элюировали белковые комплексы после иммунопреципитации путем инкубации промытых шариков с избытком антигенного пептида PI4KIIα (, дорожка 7). Эта стратегия иммуноаффинной очистки значительно снизила фоновые контаминанты и иммуноглобулины, что было выявлено окрашиванием серебром и иммуноблоттингом (сравните дорожки 4 и 5 с дорожками 6 и 7). Наконец, иммуноблоттинг продемонстрировал, что наш подход к иммуноаффинной очистке высоко обогащен PI4KIIα (сравните дорожки 2 и 7).

Интерактом PI4KIIα обогащает регулирующие актин белки.(A) PI4KIIα был иммуноаффинно очищен из гомогенатов клеток нейробластомы SHSY-5Y, поперечно сшитых с помощью DSP. PI4KIIα и соизолирующие белки разделяли с помощью SDS-PAGE и окрашивали серебром (дорожка 5). Некоторые полипептиды отсутствуют в контролях, которые включают покрытые антителом шарики без лизата (дорожка 3) или инкубации, в которые был включен избыток антигенного пептида PI4KIIα (дорожка 4). Элюцию гранул проводили буфером для образцов Лэммли (дорожки 3–5). Дорожки 6 и 7 изображают элюаты антигенных пептидов из шариков, аналогичные таковым в дорожках 4 и 5.Иммуноаффинная очистка позволила селективно элюировать коизолирующие белки PI4KIIα на низком фоне (сравните дорожки 6 и 7; дорожки 6 ‘и 7’ отображают полосы 6 и 7 с усиленным контрастом). Стрелкой отмечена полоса, содержащая PI4KIIα. Серебряное пятно представляет собой репрезентативное изображение двух независимых экспериментов. Внизу, иммуноблот PI4KIIα в параллельном наборе анализов, как и в SDS-PAGE, окрашенном серебром. Цепи иммуноглобулина G отмечены звездочками. Ввод составляет 1 и 0,33% для иммунопреципитации и иммуноаффинной очистки соответственно.(B) Графики представляют PI4KIIα и очищающие белки (подробности см. В дополнительной таблице S1). Оси x и y показывают кратность обогащения SILAC и общее количество спектральных отсчетов, используемых для идентификации белка, соответственно. Контрольные точки выделяют PI4KIIα (зеленый) и Nedd4-1. (C) Бирюзовые и красные точки выделяют связанные с актином белки, коизолированные с PI4KIIα. К ним относятся коэффициенты обмена ВВП RhoGEF1, DOCK7 и GEF-h2. Красные точки указывают на связанные с актином белки, которые являются субъединицами или взаимодействующими элементами комплекса WASH: струмпеллин (KIAA0196), SWIP (KIAA1033), Fam21B, FKBP15, кэпирующий белок α и кэпирующий белок β.(D) Синие точки выделяют белки, связанные с переносом через мембрану, коизолированные с PI4KIIα, включая тяжелую цепь клатрина (CLTC), динамин-2 (DNM2) и субъединицу β3A комплекса AP-3 (AP3B1). (E) Анализ функциональных аннотаций идентифицированных белков с использованием аннотаций Gene Ontology выявил преобладание белков, связанных с актином. Обогащение таких категорий, как цитоскелет (30/124 интеракторов) и актиновый цитоскелет (13/124), было значительным при p = 1,62 × 10 ⁻⁷ и 7.67 × 10 ⁻⁷ соответственно. См. Дополнительную информацию в таблице S2. (F) Сетевой анализ предполагаемых компонентов взаимодействия PI4KIIα и субъединиц BLOC-1. PI4KIIα (зеленый), субъединицы BLOC-1 (синий) и субъединицы комплекса WASH (красный) выделены.

Аналитически установив селективный подход к выделению PI4KIIα и взаимодействующих белков, мы выполнили препаративную иммуноаффинную очистку сшитых комплексов PI4KIIα. Мы идентифицировали интеракторы с помощью количественной масс-спектрометрии с использованием мечения стабильных изотопов аминокислотами в культуре клеток (SILAC; Ong et al., 2002; Манн, 2006). Клетки нейробластомы SHSY-5Y выращивали до равновесия либо в среде с легкой меткой, в которой аминокислоты аргинин и лизин содержат изотопы ¹² C и ¹⁴ N (среда R0K0), либо в среде с тяжелой меткой, в которой эти аминокислоты содержат ¹³ C и ¹⁵ N (среда R10K8; дополнительный рисунок S1B). После включения этих изотопных меток аминокислот, PI4KIIα иммунопреципитировали из лизатов меченных светом клеток. В качестве контроля иммунопреципитацию из лизатов меченых тяжелых клеток проводили в присутствии избытка антигенного пептида PI4KIIα (дополнительный рисунок S1B).Как описано ранее, оба образца затем конкурентно элюировали из шариков с избытком антигенного пептида PI4KIIα. Элюированные полипептиды, меченные легкой и тяжелой меткой, смешивали в соотношении 1: 1 для тандемного масс-спектрометрического анализа. Эта очистка позволила обогатить PI4KIIα примерно в 55 раз, и его относительное содержание было представлено 220 спектральными отсчетами (, зеленая точка). Кроме того, мы идентифицировали 701 соизолирующий белок с двумя или более уникальными пептидами. Из общего количества 702 белков 268 были обогащены иммуноаффинной очисткой PI4KIIα более чем в два раза по сравнению с контролем, пороговое значение SILAC, которое мы ранее продемонстрировали, обогащает взаимодействия, которые могут быть подтверждены генетически (Gokhale et al., 2012а, б; Perez-Cornejo et al. , 2012). Однако одним известным ограничением очистки на основе гранул является тенденция белков неспецифически связываться с гранулами, покрытыми антителами (Trinkle-Mulcahy et al. , 2008). Чтобы преодолеть это ограничение, мы отфильтровали любые полипептиды, которые неспецифически связываются либо только с гранулами, либо с гранулами, покрытыми неродственными антителами. Применение этих фильтров позволило идентифицировать 123 соизолирующих белка в дополнение к PI4KIIα для дальнейшего изучения (и дополнительную таблицу S1).

Мы сначала охарактеризовали интерактом PI4KIIα, выполнив функциональный анализ аннотаций 124 идентифицированных белков с использованием аннотаций Gene Ontology (). Этот анализ показал, что белки цитоскелета (30/124) и белки цитоскелета актина (13/124) были обогащены во взаимодействии PI4KIIα по сравнению со случайной выборкой генома человека ( p = 1,62 × 10 ⁻⁷ и 7,67 × 10 ⁻⁷ соответственно). Например, связанные с актином белки в интерактоме PI4KIIα включают регуляторные белки для малых GTPases, такие как RhoGEF1 (ARHGEF1), выделитель цитокинеза 7 (DOCK7) и GEF-h2 (ARHGEF2), которые являются факторами обмена гуанина для RhoA, cdc42. , и Rho-Rac GTPases, соответственно (, бирюзовые точки; Rossman et al., 2005; Birkenfeld et al. , 2008 г .; Blasius et al. , 2009 г .; Aittaleb et al. , 2010). Кроме того, анализ функциональной аннотации показал очень значительное обогащение белков, обозначенных как «транспортные белки, опосредованные везикулами» (13/124), как и было предсказано, учитывая роль PI4KIIα в регуляции AP-3-зависимого биогенеза везикул (; p ). = 1,19 × 10 ⁻³ ; Дополнительная таблица S2). Эти опосредованные везикулами транспортные белки включают тяжелую цепь клатрина, субъединицу β комплекса AP-3 (AP3B1) и динамин-2 (DYN-2;, синие точки).В дополнение к функциональной аннотации мы выполнили сетевой анализ для выявления ранее опубликованных прямых взаимодействий между этими очищающимися белками. Наша цель состояла в том, чтобы идентифицировать функциональные субкомплексы и хабы с высокой связностью с сетями, которые совместно очищаются с PI4KIIα и могут играть роль в AP-3- и BLOC-1-опосредованном биогенезе везикул (; Gokhale et al. , 2012b). По этой причине мы включили в этот анализ восемь субъединиц комплекса BLOC-1. Сетевой анализ выявил присутствие трех из пяти субъединиц комплекса WASH (FAM21B, KIAA0196 и KIAA1033) и трех известных взаимодействующих элементов комплекса WASH (FKBP15, CAPZA1 и CAPZB; красные точки; Campellone and Welch, 2010; Jia et al., 2010; Rottner et al. , 2010; Rotty et al. , 2012). Комплекс WASH локализуется в ранних эндосомах, где, как предполагается, он полимеризует актин для сортировки груза или расщепления везикул, подтверждая роль комплекса WASH в PI4KIIα-регулируемом, BLOC-1-опосредованном биогенезе везикул.

Биохимическое и генетическое подтверждение PI4KIIα-взаимодействующих белков

Мы подтвердили взаимодействия PI4KIIα, идентифицированные с помощью масс-спектрометрии SILAC, путем независимой иммуноаффинной очистки PI4KIIα с последующим иммуноблоттингом для проверки наличия представляющих интерес белков.Мы обнаружили, что PI4KIIα взаимодействует с опосредованными пузырьками транспортными белками, такими как тяжелая цепь клатрина и субъединица паллидина BLOC-1 (дорожки 6 и 7). Взаимодействующие белки были обнаружены только в изоляциях PI4KIIα, но не в контроле, где избыток антигенного пептида использовался, чтобы противостоять иммунопреципитации комплексов PI4KIIα (дорожки 4 и 5). В соответствии с нашими предыдущими сообщениями, обнаружение взаимодействий между PI4KIIα и транспортными белками, опосредованными пузырьками, требует лечения с помощью кросс-линкерного DSP, предположительно потому, что эти ассоциации лабильны и / или временны.Кроме того, мы обнаружили, что PI4KIIα взаимодействует с двумя известными взаимодействующими элементами комплексов BLOC-1 и AP-3 соответственно — антиоксидантным ферментом пероксиредоксин-1 (Prdx-1) и убиквитинлигазой Nedd4-1 (Mossinger et al. , 2012;, дорожки 6 и 7; также см. Салазар и др. , 2009; Гохале и др. , 2012a). Nedd4-1 представляет нижние границы наших порогов значимости с точки зрения спектрального счета и пороговых значений обогащения для нашей количественной оценки SILAC, тем самым подтверждая, что эти пороги минимизируют включение ложноотрицательных результатов в интерактивный PI4KIIα (три спектральных счета, 3.69-кратное обогащение; ). Наконец, мы проверили взаимодействие между PI4KIIα и белками, которые регулируют актиновый цитоскелет, поскольку функциональная аннотация и сетевой анализ показали, что эти взаимодействия были очень значимыми. Мы подтвердили взаимодействие между PI4KIIα и субъединицей струмпеллина комплекса WASH и двумя факторами обмена гуанина для малых GTPases RhoGEF1 и Dock7. Следует отметить, что эти соурификации не требовали перекрестного линкера DSP, что позволяет предположить, что PI4KIIα взаимодействует с этими белками либо с более высоким сродством, либо с более длительным периодом полужизни, чем с белками, связанными с переносом через мембрану (дорожки 6 и 7).Чтобы дополнительно проверить специфичность этих взаимодействий, мы выделили PI4KIIα, помеченный гемагглютинином (HA), из клеток HEK293T путем иммунопреципитации HA. Мы подтвердили присутствие RhoGEF1 в этих белковых комплексах, демонстрируя, что эти взаимодействия могут быть обнаружены независимо от стратегии очистки (, дорожка 3). Взятые вместе, эти результаты указывают на то, что интерактом PI4KIIα обогащает белки, аннотация генной онтологии которых существенно вовлекает их в функцию актина.

Биохимическое подтверждение белков, взаимодействующих с PI4KIIα.(A) PI4KIIα был иммуноаффинно очищен из неперекрестно-сшитых (нечетные дорожки) и DSP-перекрестно-сшитых (четные дорожки) экстрактов растворимых в детергенте клеток нейробластомы SHSY-5Y. Иммунные комплексы были разделены с помощью SDS-PAGE и проанализированы с помощью иммуноблоттинга с антителами против PI4KIIα, тяжелой цепи клатрина (CHC), паллидина, пероксиредоксина-1 (Prdx-1), RhoGEF1, Dock7 и субъединицы комплекса WASH strumpellin и Nedd4-1. Коизолирующие белки не были обнаружены в контрольных реакциях, где был включен избыток антигенного пептида PI4KIIα, чтобы победить эндогенный PI4KIIα (дорожки 4 и 5).Дорожка 3 показывает покрытые антителом шарики, инкубированные в отсутствие клеточного лизата. Входы составляют 0,25%. (B) Клетки HEK293T, временно экспрессирующие HA-меченый PI4KIIα, были DSP-сшиты (дорожки 3 и 4), а растворимые в детергенте экстракты были иммунопреципитированы антителами HA. Иммунные комплексы были разделены с помощью SDS-PAGE и проанализированы с помощью иммуноблоттинга с указанными антителами. RhoGEF1 присутствует в иммунопреципитации НА (дорожка 3), но не в контрольных пептидах вне конкуренции (дорожка 4). Дорожка 2 показывает покрытые антителом шарики, инкубированные в отсутствие клеточного лизата.Входные данные составляют 0,5%, и n = 3. (C, D) Клетки SHSY-5Y, стабильно экспрессирующие помеченную FLAG субъединицу комплекса BLOC-1 (дисбиндин), инкубировали в отсутствие (D, дорожки 1, 4, и 6) или присутствие (C, все дорожки и D, дорожки 2, 5 и 7) сшивающего агента DSP, и растворимые в детергенте экстракты иммунопреципитировали антителами против PI4KIIα (C) или эпитопа FLAG (D). Иммунные комплексы были разделены с помощью SDS-PAGE и проанализированы с помощью иммуноблоттинга с антителами против указанных белков, идентифицированных в интерактоме PI4KIIα.Также включены два груза мембранных белков BLOC-1, v-SNARE VAMP7 и переносчик меди болезни Менкеса ATP7A. Как и в случае A и B, контролями являются антигенные пептиды вне конкуренции (C, дорожка 4 и D, дорожки 6 и 7). Дорожки C2 и D3 показывают покрытые антителом шарики, инкубированные в отсутствие клеточного лизата. Входы составляют 0,5%.

Наш сетевой анализ интерактома PI4KIIα и субъединиц BLOC-1 предположил связи между PI4KIIα-взаимодействующими белками и субъединицами BLOC-1 (). Более того, BLOC-1 регулирует субклеточную локализацию PI4KIIα (Larimore et al., 2011). По этим причинам мы предсказали, что эти ранее нераспознанные связанные с актином взаимодействующие элементы PI4KIIα будут совместно изолироваться с BLOC-1. Чтобы проверить это предсказание, мы использовали линию клеток SHSY-5Y, которая стабильно экспрессирует помеченную FLAG субъединицу дисбиндина BLOC-1. Эта помеченная субъединица включается в функциональные комплексы BLOC-1 (Larimore et al. , 2011; Gokhale et al. , 2012a). Во-первых, мы подтвердили, что эта субъединица BLOC-1 может быть обнаружена при иммуноаффинной очистке PI4KIIα (дорожка 3).Затем мы проверили, будут ли взаимодействовать PI4KIIα в белковых комплексах BLOC-1, выделенных с помощью иммуноаффинной очистки FLAG (дорожки 4 и 5). Как сообщалось ранее, PI4KIIα может быть обнаружен этим методом (дорожка 5; Larimore et al. , 2011). Кроме того, два взаимодействующих элемента PI4KIIα, RhoGEF1 и комплексная субъединица WASH струмпеллин, коизолируются с комплексами BLOC-1 (, дорожка 5). Кроме того, мы также обнаружили присутствие двух известных грузов BLOC-1, переносчика меди болезни Менкеса ATP7A и лизосомного SNARE VAMP7 (Salazar et al., 2006; Setty et al. , 2008 г .; Newell-Litwa et al. , 2009, 2010). Эти взаимодействия не были обнаружены в контролях, в которых избыток пептида FLAG был включен в реакцию, чтобы превзойти FLAG-дисбиндин за связывание с антителом для иммунопреципитации (сравните дорожки 5 и 7). Наши результаты показывают, что выделение белковых комплексов PI4KIIα или BLOC-1 надежно копуризует актин-регуляторный аппарат. Совместная очистка субъединиц PI4KIIα, strumpellin, RhoGEF1 и BLOC-1 указывает на то, что эти белки могут действовать согласованно, чтобы регулировать BLOC-1-зависимый трафик.

Мутация или истощение субъединицы комплекса мембранного транспорта обычно коррелирует с понижающей регуляцией других субъединиц комплекса и с изменениями общего клеточного содержания грузов пути и связанных факторов (Peden et al. , 2002; Kantheti et al. , 2003; Li и др. , 2003; Starcevic and Dell’Angelica, 2004; Jia и др. , 2010). Мы использовали этот принцип для независимого тестирования компонентов интерактома PI4KIIα. Мы предсказали, что пертурбация либо PI4KIIα, либо BLOC-1 будет влиять на содержание компонентов взаимодействия PI4KIIα, если эти белки являются регуляторами BLOC-1-зависимого пути биогенеза везикул.PI4KIIα и две субъединицы BLOC-1, приглушенная и паллидин, были независимо истощены короткой шпильчатой ​​РНК (shRNA) в клетках HEK293T (). Полуколичественный анализ иммуноблоттинга показал, что истощение PI4KIIα активировало содержание RhoGEF1, а также субъединиц AP-3 и BLOC-1. Последнее наблюдение согласуется с существованием трехкомпонентного комплекса между PI4KIIα, AP-3 и BLOC-1 (Salazar et al. , 2009;). Эти отношения между компонентами интерактома PI4KIIα также наблюдались после истощения комплекса BLOC-1 ().Общее клеточное содержание субъединиц PI4KIIα, RhoGEF1 и BLOC-1 было значительно снижено в ответ на истощение либо приглушенного, либо паллидина (). Затем мы проанализировали содержание двух хорошо охарактеризованных грузов BLOC-1, лизосомного SNARE, VAMP7 и переносчика меди, мутировавшего при болезни Менкеса, ATP7A (OMIM 309400; Salazar et al. , 2006; Setty et al. ). , 2008; Newell-Litwa и др. , 2009, 2010). Общее клеточное содержание обоих этих грузов было значительно снижено в BLOC-1-истощенных клетках, но не в PI4KIIα-истощенных клетках (Mann-Whitney U test p <0.05; , красные ящики). Нормальное содержание VAMP7 и ATP7A в клетках, истощенных по PI4KIIα, предполагает, что повышающая регуляция субъединиц комплекса BLOC-1 может быть компенсаторной.

Генетическое подтверждение белков, взаимодействующих с PI4KIIα. (A, D) Клетки HEK293T обрабатывали контрольной siRNA scramble или siRNA, нацеленной на PI4KIIα. (B, D) Клетки HEK293T обрабатывали лентивирусами, несущими контрольную шРНК скремблирования или шРНК, нацеленную на паллидин или приглушенные субъединицы комплекса BLOC-1. (C, E) Клетки меланомы человека MNT-1 обрабатывали лентивирусами, несущими контрольную shRNA scramble или shRNA, нацеленную на субъединицу BLOC-1 паллидин, RhoGEF1 или комплексную субъединицу WASH струмпеллин.Лизаты клеток HEK293T и MNT-1 разделяли с помощью SDS-PAGE, а общее содержание в клетках представляющих интерес белков измеряли с помощью полуколичественного иммуноблоттинга. Коробчатые диаграммы на D и E отображают количественные оценки, где целевой белок выделен синим цветом, а значительно измененные антигены отмечены красным. Затенение серым цветом соответствует 50–100% контроля. Все эксперименты проводили в трех биологических повторностях, по крайней мере, с одним определением на повторность. Все значимые значения p составляют <0,025 и были определены непараметрическим анализом с использованием группового критерия суммы рангов Краскела – Уоллиса с последующим критерием суммы рангов Вилкоксона – Манна – Уитни.Субъединица АР-3 β3A (D) и Hsp90 (D, E) использовали в качестве контроля для сравнений.

Затем мы проверили, влияет ли shRNA-опосредованное истощение BLOC-1, струмпеллина или RhoGEF1 на общее содержание в клетках других компонентов взаимодействия PI4KIIα. Во-первых, мы исследовали последствия истощения BLOC-1 в клеточной линии меланомы MNT-1, типе клеток, в котором локализация BLOC-1 в канальцевых эндосомах была определена на субклеточном уровне с помощью электронной микроскопии (Di Pietro et al., 2006). В соответствии с нашим открытием в клетках HEK293T, общее клеточное содержание PI4KIIα-интерактора RhoGEF1 снижалось в клетках MNT1, лишенных BLOC-1 (). Истощение компонентов интерактома PI4KIIα, RhoGEF1 и струмпеллина, не изменяет общего клеточного содержания субъединиц BLOC-1 (). Однако грузы BLOC-1 VAMP7 и ATP7A были значительно изменены (). Общее клеточное содержание ATP7A увеличивалось в ответ на BLOC-1, RhoGEF1 или истощение струмпеллина в клетках MNT1 (; 2.В 3 ± 0,12–, 2,2 ± 0,46– и 1,6 ± 0,13 раза по сравнению с контролем соответственно). Кроме того, уровни VAMP7 были значительно снижены при истощении BLOC-1, значительно увеличились при истощении RhoGEF1 и не изменились при истощении струмпеллина. Эти данные свидетельствуют о нарушении регуляции стационарных уровней этих грузов BLOC-1 при истощении компонентов взаимодействия PI4KIIα и тем самым устанавливают генетические взаимодействия между компонентами взаимодействия PI4KIIα.

Комплекс WASH и нитчатый актин располагаются на PI4KIIα-положительных ранних эндосомах

Комплекс WASH представляет собой актин-регуляторный комплекс, который локализуется в ранних эндосомах (Derivery et al., 2009 г .; Гомес и Билладо, 2009; Gomez et al. , 2012 г .; Дуле и Велч, 2010; Carnell et al. , 2011 г .; Zech et al. , 2011 г .; Harbour et al. , 2012). Аналогичным образом, PI4KIIα локализуется в ранних эндосомах, где он связывается с BLOC-1 (Balla et al. , 2002; Guo et al. , 2003; Minogue et al. , 2006; Craige et al. , 2008; Салазар и др. , 2009). Таким образом, мы предсказали, что PI4KIIα-положительные эндосомы содержат BLOC-1, комплекс WASH и актин.Чтобы проверить это предсказание, мы сначала отделили эндосомные компартменты от гомогенатов клеток HEK293T с помощью скоростной седиментации сахарозы (Clift-O’Grady et al. , 1998; Lichtenstein et al. , 1998). Как и ожидалось, PI4KIIα соединяется с 35% сахарозой с рецептором трансферрина, эндосомным маркером (). Кроме того, в этих фракциях присутствовали комплексная субъединица WASH струмпеллин, комплексная субъединица BLOC-1 паллидин и актин (). Паллидин и актин преимущественно обнаруживались на вершине градиентов, где осаждаются свободные цитозольные белки (Clift-O’Grady et al., 1998; Lichtenstein et al. , 1998). Присутствие нитевидного актина на PI4KIIα-содержащих эндосомах было подтверждено визуализацией живых клеток флуоресцентно меченного EGFP-PI4KIIα с помощью флуоресцентного зонда LifeAct (; Riedl et al. , 2008). Мы отслеживали флуоресцентно меченые антитела FLAG, связанные с экзофациальной меткой, сконструированной в β2-адренергическом рецепторе (SSF-B2AR;). Мы стимулировали интернализацию комплексов рецептор-FLAG-антитело путем добавления изопротеренола, агониста адренергических рецепторов, для функционального определения ранних эндосом (Puthenveedu et al., 2010). В этих ранних эндосомах разветвленные актиновые сети были обнаружены с помощью cortactin-dsRed (), который был сконцентрирован в основании небольших пальцевидных выступов, обогащенных PI4KIIα. Небольшие количества паллидина и актина, кооседиментирующие и / или колокализующиеся с PI4KIIα и эндосомными маркерами, отражают временный характер этих ассоциаций при анализе в отсутствие кросс-линкерного DSP. Таким образом, мы однозначно идентифицировали, что PI4KIIα и разветвленный актин совместно локализуются в функционально определенных ранних эндосомах.

PI4KIIα, комплексная субъединица WASH струмпеллин и актиновые компоненты цитоскелета на ранних эндосомах. (A, B) Клетки HEK293T были гомогенизированы, и низкоскоростные супернатанты были разделены скоростной седиментацией сахарозы на градиенте сахарозы 10–45%. PI4KIIα и субъединица комплекса WASH струмпеллин ко-седиментируются с 35% сахарозой с эндосомными органеллами, как идентифицировано рецептором трансферрина (TrfR). Цитозольные фракции осаждаются в верхней части градиента (10% сахарозы). (B) Относительное распределение указанных белков для фракционирования, показанного на A.Изображения и профиль распределения представляют два независимых эксперимента. (C) Визуализация живых клеток флуоресцентно меченных PI4KIIα и LifeAct для визуализации нитчатого актина в клетках HEK293T подтвердила присутствие актина в PI4KIIα-положительных органеллах ( n = 12 клеток). (D) Клетки HEK293T, стабильно экспрессирующие PI4KIIα-GFP и сигнальные последовательности FLAG-меченых β2-адренергических рецепторов (SSF-B2AR), временно трансфицировали mCortactin-dsRed и визуализировали через 10 мин после добавления 10 мкМ изопротеренола.Одиночный конфокальный стек был захвачен в трех каналах с интервалом в 1 с. (E) Увеличенное изображение эндосомы, обозначенное стрелкой в ​​A, в течение 10-секундного периода. (F) Схема овального профиля, используемого для создания следов интенсивности флуоресценции вокруг эндосом. (G) Типичный график нормализованной интенсивности флуоресценции для каждого белка в указанной выше эндосоме.

Мы проверили присутствие комплекса WASH в PI4KIIα-положительных эндосомах путем визуализации EGFP-меченных субъединиц комплекса WASH и эндогенного PI4KIIα с помощью деконволюционной микроскопии с высоким разрешением.Wash2-, strumpellin-, SWIP / KIAA1033- и Fam21-EGFP все были тесно связаны с сигналом PI4KIIα (). Эта физическая близость была особенно очевидна в трехмерных проекциях данных z -стека, где субъединицы комплекса WASH, по-видимому, оборачиваются вокруг органелл, содержащих PI4KIIα (). Мы наблюдали низкую степень перекрытия между сигналами наивысшей интенсивности и, таким образом, измерили совместную локализацию strumpellin-EGFP и Wash2-EGFP с эндогенным PI4KIIα с использованием коэффициента колокализации Пирсона.Коэффициент Пирсона составлял 9,1 ± 2,5 и 13,1 ± 1,9 для strumpellin-EGFP и Wash2-EGFP, соответственно, подтверждая низкую корреляцию интенсивности между перекрывающимися сигналами (). Однако мы проверили специфичность этого рассчитанного коэффициента, повернув один канал на 15 ° и проанализировав совместную локализацию PI4KIIα с митохондриальным зондом MitoTracker. Коэффициент колокализации Пирсона между PI4KIIα и MitoTracker был отрицательным, что отражает полное отсутствие перекрытия этих сигналов ().Это наблюдение было подтверждено, поскольку ротация каналов не изменяла отрицательный коэффициент Пирсона между PI4KIIα и MitoTracker. Напротив, вращение либо strumpellin-EGFP, либо Wash2-EGFP на 15 ° снизило коэффициент Пирсона до значений, неотличимых от значений колокализации MitoTracker ( p ≥ 0,05;). Эти результаты показывают, что комплекс WASH и актиновые филаменты располагаются в субдоменах PI4KIIα-содержащих эндосом. Эти находки подтверждают, что аппарат Wash2-actin способен регулировать транспортировку PI4KIIα и др. Грузов BLOC-1 из ранних эндосом.

PI4KIIα колокализуется с комплексом WASH. (A, C) Клетки HEK293T либо временно трансфицировали EGFP-меченными субъединицами комплекса WASH, либо окрашивали зеленым MitoTracker, фиксировали и обрабатывали для непрямой иммунофлуоресцентной микроскопии. Изображения были получены с помощью деконволюционной микроскопии с высоким разрешением. Показаны проекции стопки z . (B, D) Визуализация изоповерхности стека z , созданная с помощью программного обеспечения Imaris. (E) Расчет коэффициента корреляции Пирсона между интенсивностями сигналов strumpellin-EGFP, WASH-EGFP или MitoTracker и эндогенного PI4KIIα.Корреляция пропадала при повороте одного канала на 15 °. Здесь n = 6 для WASH-EGFP, n = 7 для strumpellin-EGFP и n = 9 для MitoTracker-A488. Статистические сравнения проводились с помощью непараметрического анализа с использованием группового критерия суммы рангов Краскела – Уоллиса с последующими индивидуальными критериями суммы рангов Вилкоксона – Манна – Уитни.

Комплекс WASH модулирует нацеливание на грузы BLOC-1

Истощение комплекса WASH характеризуется появлением увеличенных загруженных грузом канальцев из эндосом и неправильной сортировкой груза (Gomez and Billadeau, 2009; Gomez et al., 2012 г .; Harbour et al. , 2012 г .; Jia et al. , 2012 г .; Моряк, 2012 г .; Helfer et al. , 2013). Поэтому мы предположили, что PI4KIIα присутствует в трубчатых структурах, длина которых регулируется комплексом WASH. Чтобы проверить эту гипотезу, мы экспрессировали PI4KIIα-EGFP в клетках HEK293T, стабильно экспрессирующих FLAG-меченный β2-адренергический рецептор, и визуализировали клетки с помощью микроскопии живых клеток. Эндосомы были однозначно идентифицированы по индуцированной лигандом интернализации флуоресцентных антител FLAG, связанных с экзофациальным доменом β2-адренорецептора.Трубочки, содержащие PI4KIIα и / или β2-адренергический рецептор, выходят из ранних эндосом, и их размер увеличивается в клетках, истощенных комплексом WASH (19). В целом размер ранних эндосом, содержащих PI4KIIα и β2-адренергический рецептор, не зависел от дефицита комплекса WASH (). Напротив, истощение BLOC-1 путем нацеливания shRNA на паллидин характеризовалось увеличением этих ранних эндосом без увеличения канальцев (2). Изменения в архитектуре ранних эндосом, содержащих PI4KIIα и β2-адренергический рецептор, за счет истощения комплексов BLOC-1 или WASH подтверждают модель, в которой комплексы WASH во взаимодействии с BLOC-1 регулируют нацеливание грузов BLOC-1 из ранних эндосом.

Истощение паллидина и струмпеллина изменяет морфологию эндосом. (A) Клетки HEK293T, стабильно экспрессирующие сигнальные последовательности FLAG-меченных β2-адренергических рецепторов (SSF-B2AR) и PI4KIIα-EGFP, трансдуцировали лентивирусами scrambled, pallidin или strumpellin shRNA. Клетки, обедненные паллидином, получали изображение через 8 дней после начала трансдукции, а клетки, истощенные по струмпеллину, отображали через 5 дней после трансдукции. Клетки выращивали в условиях отбора после 2-го дня трансдукции. Все нокдауны сравнивали с параллельной трансдукцией скремблированной кшРНК.Изображения представляют собой максимальные проекции трех конфокальных срезов, снятых с интервалами 0,3 мкм. (B) Частотная гистограмма окружности эндосомы для клеток, обработанных скремблированной (синий) или паллидиновой (красный) shРНК. Вставка слева изображает вероятностный график тех же данных. Значение p , определенное непараметрическим критерием Колмогорова – Смирнова. Здесь n = 150 для контрольных клеток и n = 117 для клеток, обедненных паллидином. (C) Процент клеток, экспрессирующих скремблированную или струмпеллиновую shРНК, отображающих эндосомные канальцы.Отбор клеток выполняли в канале SSF-B2AR и ослепляли на PI4KIIα перед интернализацией антитела FLAG, затем визуализировали через 15 минут после добавления 10 мкМ изопротеренола. Значение p определяли непараметрическим точным критерием Фишера. Здесь n = 112 для контрольных клеток и n = 101 для клеток, обедненных паллидином.

Мы предсказали, что дефицит комплекса WASH изменит субклеточное распределение грузов BLOC-1, если эти комплексы действуют по одному и тому же пути.Чтобы проверить это предсказание, мы обработали клетки меланомы MNT1 кшРНК, нацеленной на субъединицу струмпеллина комплекса WASH или контроль скремблирования. Мы оценили уровень на клеточной поверхности двух грузов BLOC-1: переносчика меди Менкеса ATP7A и лизосомного белка SNARE VAMP7 (Salazar et al. , 2006; Setty et al. , 2008; Newell-Litwa et al. , 2009, 2010). Как описано ранее, мы наблюдали увеличение общего клеточного содержания ATP7A в ~ 1,5 раза при истощении комплекса WASH (дорожки 1–4).Однако уровни ATP7A на клеточной поверхности увеличиваются в 3,3 ± 0,8 раза при истощении комплекса WASH (дорожки 5 и 6; среднее значение ± SEM). Сходным образом уровни VAMP7 на клеточной поверхности увеличивались в 2,5 ± 0,6 раза при истощении комплекса WASH по сравнению с контролем, тогда как общие клеточные уровни VAMP7 были умеренно, но незначительно затронуты (полосы 5 и 6 и). Это увеличение клеточной поверхности было специфическим для грузов BLOC-1, а не глобальных возмущений, так как общее клеточное содержание и уровни рецептора трансферрина на клеточной поверхности не были затронуты в клетках, истощенных комплексом WASH ().Более того, окрашивание серебром общего биотинилированного белка клеточной поверхности не показало глобального увеличения белков клеточной поверхности из-за истощения комплекса WASH (). Таким образом, грузы BLOC-1 не попадают на поверхность клетки при истощении комплекса WASH. Эти данные подтверждают модель, в которой комплексы WASH изменяют движение грузов BLOC-1.

Истощение комплекса WASH изменяет субклеточное распределение грузов BLOC-1. (A) Клетки меланомы MNT1 обрабатывали кшРНК, направленной против субъединицы струмпеллина комплекса WASH или контроля скремблирования.Белки клеточной поверхности метили поверхностным биотинилированием и выделяли стрептавидиновыми шариками. Репрезентативные иммуноблоты показывают увеличение поверхностного содержания ATP7A и Vamp7, двух грузов BLOC-1, в истощении комплекса WASH. (B) Рецептор трансферрина (TrfR) измеряли в качестве контроля. Окрашивание выделенных белков серебром не выявило глобального снижения содержания белков на клеточной поверхности (сравните дорожки 5 и 6). (C) Количественная оценка поверхностной экспрессии представляющих интерес белков при истощении комплекса WASH по сравнению с контролем скремблирования.Данные являются средними ± SEM. Мы обнаружили значительное увеличение грузов ATP7A и Vamp7 в BLOC-1 в 3,3 ± 0,8 раза и 2,5 ± 0,6 раза, соответственно. Рецептор трансферрина существенно не изменился. Значение p определяли с помощью непараметрического критерия суммы рангов Вилкоксона – Манна – Уитни. Всего было n = 8 определений из четырех независимых экспериментов.

ОБСУЖДЕНИЕ

В этом исследовании мы идентифицировали ранее нераспознанные компоненты пути сортировки мембранных белков, затронутые при синдроме Hermansky – Pudlak, путем выделения заякоренной в мембране липидкиназы PI4KIIα.PI4KIIα связывает и регулирует два комплекса, мутировавших при синдроме Германского-Пудлака, комплексы AP-3 и BLOC-1, посредством мотива сортировки дилейцина и его киназной активности (Craige et al. , 2008; Salazar et al. , 2009; Ларимор и др. , 2011; Гохале и др. , 2012a). Мы поэтому предположили, что PI4KIIα взаимодействует с нераспознанными компонентами пути транспорта везикул, требующих комплекса BLOC-1 – AP-3 – PI4KIIα. PI4KIIα может взаимодействовать с этими компонентами либо одновременно со связыванием с AP-3 и BLOC-1, и / или на стадиях, предшествующих или следующих за связыванием с этими комплексами.Поэтому мы разработали стратегию для обогащения взаимодействующих PI4KIIα перед и после события распознавания мотива сортировки дилейцина PI4KIIα. Для достижения этой цели мы получили антитело против пептида из 20 остатков PI4KIIα, который содержит сортирующий мотив ERQPLL. Мутации этого мотива в ERQPAA достаточно для предотвращения распознавания PI4KIIα этим антителом при иммуноблоттинге. Хотя мотив ERQPLL присутствует в пяти других белках, кодируемых в геноме человека, ни один из этих белков не обогащен во взаимодействии PI4KIIα, что гарантирует, что это антитело специфически распознает PI4KIIα (www.mrc-lmb.cam.ac.uk/genomes/madanm/harvey/). Мы использовали это антитело для иммуноаффинной очистки PI4KIIα из меченных изотопами клеточных лизатов (SILAC), что позволило количественно идентифицировать взаимодействующие белки по сравнению с неспецифическими загрязнителями и иммуноглобулинами (Ong et al. , 2002; Mann, 2006; Zlatic et al. , 2010; Гохале и др. , 2012a). Поразительно, что выделение PI4KIIα предпочтительно кообогащено белками, которые регулируют актиновый цитоскелет, включая факторы обмена гуанина для GTPases семейства Rho, RhoGEF1, DOCK7 и GEF-h2, а также нескольких субъединиц комплекса WASH.Кроме того, PI4KIIα соизолирован с мембранными белками, такими как тяжелая цепь клатрина и субъединица β3A комплекса AP-3. Эти комплексы, транспортирующие через мембрану, коизолированы с PI4KIIα при более низкой стехиометрии по сравнению с регуляторами актина, как и предполагалось в нашей стратегии выделения. Мы биохимически подтвердили некоторые из этих взаимодействий PI4KIIα. Кроме того, мы предсказали, что если компоненты взаимодействия PI4KIIα будут взаимодействовать, то нарушение этих белков изменит общее содержание в клетке других компонентов взаимодействия.Исходя из этого руководящего обоснования, мы установили, что генетическое истощение самого PI4KIIα, комплекса BLOC-1, RhoGEF1 или комплекса WASH изменяет общее клеточное содержание либо компонентов взаимодействия PI4KIIα, либо грузов BLOC-1, переносчика меди болезни Менкеса ATP7A и лизосомный SNARE VAMP7 (Salazar et al. , 2006; Setty et al. , 2008; Newell-Litwa et al. , 2009, 2010). Мы пришли к выводу, что эти новые интеракторы PI4KIIα биохимически и генетически взаимодействуют с компонентами актинового цитоскелета.Мы предпочитаем модель, в которой грузы мембранных белков сортируются с помощью BLOC-1-зависимого механизма в трубчатые носители, размер которых контролируется комплексом WASH, возможно, за счет генерирования силы для разрыва мембраны.

Мы сосредоточили наши усилия на описании последствий этих взаимодействий для комплекса WASH. Wash2 представляет собой фактор, способствующий зародышеобразованию I типа, который связывает комплекс Arp2 / 3 для локального зародышеобразования и организации полимеризации разветвленных актиновых филаментов (Derivery et al., 2009 г .; Jia et al. , 2010; Велтман и Инсолл, 2010; Rotty et al. , 2012). Комплекс WASH локализуется в трубчатых доменах ранних эндосом, где предполагается, что полимеризация актина создает локализованные мембранные домены для сортировки грузов и / или регулирует морфологию канальцев путем рассечения мембраны (Gomez and Billadeau, 2009; Gomez et al. , 2012; Duleh и Welch, 2010, 2012; Harbour и др., , 2012; Helfer, и др., , 2013). Наша работа идентифицирует комплекс WASH как ранее неизвестный интерактор BLOC-1 и PI4KIIα.Это утверждение основано на следующих выводах и обосновании. Мы обнаружили, что субъединицы комплекса WASH локализуются в органеллах, содержащих PI4KIIα, и соосаждены с субъединицами комплекса BLOC-1, что согласуется с предыдущим сообщением о том, что Wash2 взаимодействует с субъединицей BLOS2 комплекса BLOC-1 с помощью дрожжевого двухгибридного анализа и иммунопреципитации меченые субъединицы (Monfregola et al. , 2010). Кроме того, мы обнаружили, что PI4KIIα содержится в небольших трубчатых структурах, которые исходят из ранних эндосом, которые функционально помечены интернализованными β-адренергическими рецепторами.Если BLOC-1 и комплекс WASH координируются, чтобы регулировать морфологию ранних эндосомных канальцев и / или сортировку грузов, то мы предсказали, что морфологические и неправильные фенотипы будут возникать при нарушении белковых комплексов. Во-первых, мы предсказали ранние морфологические изменения эндосом в истощении комплексов BLOC-1 и WASH, ведущие либо к увеличению эндосом, либо к эндосомным канальцам. Действительно, мы обнаружили, что истощение BLOC-1 увеличивает размер функционально идентифицированных ранних эндосом без увеличения размера канальцев.Этот фенотип согласуется с нашими предыдущими находками, что эндосомы увеличиваются в размере после истощения AP-3, BLOC-1 или PI4KIIα (Salazar et al. , 2009). Кроме того, при истощении комплекса WASH мы обнаружили удлинение ранних эндосомных PI4KIIα-содержащих канальцев, что согласуется с предыдущими сообщениями, демонстрирующими увеличение длины эндосомных канальцев при истощении Wash2 (Derivery et al. , 2009; Gomez and Billadeau, 2009). Во-вторых, мы предсказали неправильную сортировку груза BLOC-1 при истощении комплекса WASH, что может указывать на нарушение потока грузов или мембраны из эндосом.Мы сконцентрировались на неправильном переносе специфических эндолизосомных грузов на поверхность клетки, что является характерным фенотипом для дефицитов AP-3, BLOC-1 и PI4KIIα (Dell’Angelica et al. , 1999; Peden et al. , 2002; Ди Пьетро и др. , 2006; Салазар и др. , 2006; Сетти и др. , 2007; Бауст и др. , 2008). Два груза BLOC-1, ATP7A и VAMP7, неправильно локализуются на поверхности клетки при истощении комплекса WASH. Этот фенотип был специфическим для эндолизосомного груза, поскольку уровни на клеточной поверхности рецептора, который подвергается конститутивной рециклингу, рецептора трансферрина, не изменились.

Как BLOC-1 и комплекс WASH механистически координируются, чтобы регулировать морфологию эндосом и сортировку грузов? Полимеризация актина выполняет множество функций в сортировке и транспортировке мембранных белков, включая создание доменов для пространственной организации механизма сортировки, обеспечение механической поддержки деформации мембраны во время отпочкования везикул, создание силы, способствующей расслоению мембраны везикул, и продвижение носителей после завершения бутонизации (Qualmann и др. , 2000).Фенотип неправильной сортировки груза BLOC-1, наблюдаемый после истощения комплекса WASH, предполагает роль Wash2 на стадиях, происходящих на или выше мембранного разрыва пузырьков. Полимеризация актина комплексом WASH, как предполагается, генерирует силу, необходимую для разрыва мембраны, — гипотеза, ожидающая проверки путем биохимического восстановления in vitro (Bear, 2009; Derivery et al. , 2009; Gomez and Billadeau, 2009; Rotty et al. , 2012). Однако эта модель согласуется с бинарной биохимической ассоциацией субъединиц комплекса WASH, PI4KIIα, BLOC-1 и грузов ATP7A и VAMP7 BLOC-1, описанной здесь и в нашей предыдущей работе (Salazar et al., 2009 г .; Larimore et al. , 2011). Кроме того, эта модель предсказывает, что эти компоненты взаимодействуют одновременно, что еще предстоит задокументировать. Альтернативная гипотеза состоит в том, что PI4KIIα и комплекс BLOC-1 независимо связываются с комплексом WASH, чтобы регулировать его активность. Независимо от того, действуют ли BLOC-1 и PI4KIIα совместно или как независимые факторы, мы предполагаем, что комплекс WASH действует как общий механизм нуклеации разветвленной полимеризации актина в эндосомах с пространственной специфичностью или специфичностью груза, определяемой различными предшествующими дополнительными факторами, такими как оболочка и / или липидные модификации.

PI4KIIα является интересным кандидатом в активатор комплекса WASH из-за его способности продуцировать PI4P (Balla et al. , 2002; Barylko et al. , 2002). Предполагается, что субъединица Fam21 комплекса WASH, компонент интерактома PI4KIIα, локализует WASH на эндосомных мембранах путем связывания фосфоинозитидов и субъединиц комплекса сортировки белков мембраны, таких как субъединица Vps35 ретромерного комплекса (Gomez and Billadeau, 2009; Harbor et al. al., 2012 г .; Helfer et al. , 2013). Fam21 связывает PI4P in vitro, липидный продукт PI4KIIα (Jia et al. , 2010). PI4KIIα и PI4P могут, таким образом, либо рекрутировать комплекс WASH на ранние эндосомные мембраны, либо стабилизировать комплекс на этих мембранах для функции внутри AP-3-BLOC-1 или множественных путей сортировки. Как обсуждается ниже, генетическое нарушение субъединицы комплекса WASH и PI4K2A вызывает общие нейродегенеративные фенотипы у пациентов и мышей, поддерживая регуляторную роль PI4KIIα в локализации WASH (Valdmanis et al., 2007; Simons et al. , 2009 г .; Clemen et al. , 2010). Кроме того, компоненты интерактома PI4KIIα могут регулировать активацию комплекса WASH. Общей чертой факторов, способствующих зародышеобразованию, таких как Wash2, является их регуляция и активация малыми GTPases. Регуляторная GTPase для комплекса WASH остается неуловимой в клетках млекопитающих. У Drosophila melanogaster описано генетических взаимодействий между Rho и Wash2 (Liu et al. , 2009).Высокостехиометрическая ассоциация фактора обмена гуанина RhoA, RhoGEF1, с PI4KIIα и сходство между истощением струмпеллина и истощением RhoGEF1 в клетках MNT1 предполагают регуляторный механизм между этими двумя взаимодействующими элементами PI4KIIα. Будущие эксперименты необходимы для проверки точных молекулярных и функциональных отношений между PI4KIIα, RhoGEF1, комплексом WASH и комплексом BLOC-1.

В дополнение к расширению нашей концепции пути везикулярного транспорта, контролируемого комплексом синдрома Германского-Пудлака BLOC-1, наши результаты имеют новое значение для понимания нейродегенеративных заболеваний, которые влияют на аксоны центральных или периферических мотонейронов, таких как наследственная спастическая параплегия (HSP).Точечные мутации в субъединице комплекса WASH струмпеллин вызывают аутосомно-доминантный HSP (OMIM 610657), который характеризуется дегенерацией аксонов, проецирующихся в спинной мозг из моторной коры головного мозга (Valdmanis et al. , 2007; Clemen et al. , 2010). Более 50 генов были связаны с HSP у человека (Finsterer et al. , 2012). Общей темой этого заболевания является дегенерация центральных нейронов с длинными аксонами, предположительно из-за высокой нагрузки на поддержание синапса, удаленного от тела соответствующей клетки.В соответствии с этой темой, многие из 50 идентифицированных генов представляют собой комплексы переноса через мембрану эндосом (Blackstone, 2012). Не описано никаких взаимодействий между струмпеллином и другими генами, вызывающими HSP, что затрудняет размещение струмпеллина и комплекса WASH в клеточной структуре, чтобы понять, как мутации в белке струмпеллина приводят к заболеванию. Недавнее исследование показало, что субъединицы струмпеллина, содержащие мутации, вызывающие заболевание HSP, собираются в комплексы WASH, которые локализуются в ранних эндосомах нейронов и не имеют очевидных последствий для рециклинга β-адренергических рецепторов, опосредованного ретромерным комплексом (Freeman et al., 2013). Наши данные предполагают, что компоненты взаимодействия PI4KIIα могут быть альтернативным путем, нарушенным этими мутациями. Эта гипотеза подтверждается HSP-подобным фенотипом, который возникает после целенаправленного разрушения PI4KIIα у мышей (Simons et al. , 2009). Помимо роли PI4KIIα в дегенерации центральных мотонейронов, наши данные предполагают связь с механизмами болезни в дегенерации аксонов периферических мотонейронов. Точечные мутации ATP7A-карго BLOC-1 у людей вызывают дегенерацию периферических моторных аксонов (Kennerson et al., 2010; Yi et al. , 2012). В этой статье мы обнаружили, что ATP7A неправильно локализован в клетках, лишенных струмпеллина. Кроме того, PI4KIIα сам по себе является грузом BLOC-1, что указывает на то, что он также может неправильно локализоваться в пертурбациях струмпеллина, которые вызывают HSP у людей. Поэтому мы предполагаем, что нарушение компонентов взаимодействия PI4KIIα может вносить вклад в патофизиологию дегенерации аксонов центральных и периферических мотонейронов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Антитела и культура клеток

Антитела, использованные в этом исследовании, перечислены в дополнительной таблице S3.Антитело PI4KIIα, используемое здесь для иммунопреципитации, вестерн-блоттинга и иммунофлуоресцентной микроскопии, было получено против последовательности 51-PGHDRERQPLLDRARGAAAQ-70 и описано в Larimore et al. (2011). Мы получили этот антигенный пептид путем индивидуального пептидного синтеза (Bio-Synthesis, Lewisville, TX). Антигенный пептид разбавляли до 20 мМ исходного раствора в 0,5 M MOPS, pH 7,4 и хранили при -80 ° C.

Клетки

HEK293T и SHSY-5Y (Американская коллекция типовых культур, Манассас, Вирджиния) поддерживали в DMEM с 4.5 г / л глюкозы, 1-глутамина и пирувата натрия (Cellgro, Manassas, VA) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS; HyClone, Logan, UT) и 100 мкг / мл пенициллина / стрептомицина (HyClone) при 37 ° C и 10% CO ₂ . Клетки MNT1 поддерживали в среде DMEM с добавлением 20% среды AIM-V (Life Technologies, Карлсбад, Калифорния), 10% FBS (инактивированный нагреванием при 65 ° C в течение 60 мин) и 100 мкг / мл пенициллина / стрептомицина при 37 ° C. и 5% CO ₂ .

Для мечения SILAC клетки выращивали либо в легкой среде, содержащей только ¹² C и ¹⁴ N аминокислот аргинина и лизина (R0K0), либо в тяжелой среде, содержащей ¹³ C и ¹⁵ N в этих аминокислотах. аминокислоты (R10K8).Все реагенты для мечения SILAC были получены от Dundee Cell Products (Данди, Великобритания). Клетки выращивали за семь пассажей, чтобы гарантировать максимальное включение этих аминокислот. Наша предыдущая работа показала, что эти условия приводят к включению этих аминокислот в общий клеточный пул> 97,5% (Ong and Mann, 2006; Gokhale et al. , 2012a; Perez-Cornejo et al. , 2012).

ДНК-экспрессирующие конструкции

Были использованы следующие экспрессионные конструкции PI4KIIα: PI4KIIα-EGFP WT, PI4KIIα-HA WT, PI4KIIα-HA D308A и PI4KIIα-HA LL60,61AA (Craige et al., 2008 г.). Конструкция дисбиндина с меткой FLAG описана в предыдущей работе (Gokhale et al. , 2012a). Wash2-EGFP, Strumpellin-EGFP, KIAA1033-EGFP и FAM21-EGFP были описаны ранее (Harbor et al. , 2010). Кортактин-dsRed и β2-адренергические рецепторы, меченные сигнальной последовательностью FLAG (SSF-B2AR), были описаны ранее (Kaksonen et al. , 2000; Puthenveedu et al. , 2010).

Иммунопреципитация и иммуноаффинная хроматография

Клетки нейробластомы SHSY-5Y выращивали до слияния и минимально сшивали, как описано ранее (Zlatic et al., 2010; Gokhale et al. , 2012а, б; Perez-Cornejo et al. , 2012). Вкратце, клетки быстро перемещали из инкубатора на ледяную баню и дважды промывали ледяным фосфатно-солевым буфером (PBS) с добавлением CaCl ₂ (0,1 мМ) и MgCl ₂ (1 мМ) (PBS- Ca-Mg). После этой промывки клетки инкубировали в течение 2 часов в 1 мМ DSP, разведенном в PBS-Ca-Mg или контроле только в диметилсульфоксидном носителе. После сшивания реакцию DSP гасили добавлением 25 мМ Трис, pH 7.4, раствор 15 мин. Затем клетки дважды промывали ледяным PBS-Ca-Mg и лизировали в течение 30 минут в буфере A (150 мМ NaCl, 10 мМ 4- (2-гидроксиэтил) -1-пиперазинэтансульфоновая кислота [HEPES], 1 мМ этиленгликоль. тетрауксусная кислота [EGTA], 0,1 мМ MgCl ₂ ) с 0,5% Triton X-100, дополненным полной антипротеазой (Roche, Indianapolis, IN). После лизиса обломки клеток соскребали с планшетов и лизаты центрифугировали при 16 100 × г в течение 15 мин. Супернатант собирали и разбавляли до 1 мг / мл.Для иммунопреципитации 500 мкг этого осветленного клеточного лизата наносили на 30 мкл магнитных шариков Dynal (Invitrogen, Carlsbad, CA), покрытых представляющим интерес антителом для иммунопреципитации. Эти реакции иммунопреципитации инкубировали в течение 2 ч с вращением «конец за концом» при 4 ° C. Для контроля конкуренции пептида PI4KIIα антигенный пептид PI4KIIα включали в реакцию иммунопреципитации в концентрации 40 мкМ. Для конкурентных контролей FLAG был включен пептид 3X FLAG в концентрации 340 мкМ, как описано ранее (Gokhale et al., 2012а; Perez-Cornejo et al. , 2012). Для конкурентных контролей HA пептид HA был включен в концентрации 10 мкМ. После 2-часовой инкубации шарики пять раз промывали в буфере A с 0,1% Triton X-100. Затем белки элюировали из шариков либо кипячением в буфере для образцов Лэммли при 75 ° C в течение 5 минут, либо инкубированием с антигенным пептидом в течение 2 часов на льду. Пептиды разбавляли в буфере для лизиса до их концентрации элюирования (антигенный пептид PI4KIIα, 200 мкМ; пептид 3X FLAG, 340 мкМ).Образцы разделяли электрофорезом в SDS – PAGE с последующим окрашиванием серебром или иммуноблоттингом для обнаружения отдельных белков. Для анализа SILAC было проведено 18 иммуноаффинных хроматографий и 18 контрольных реакций. Элюаты этих реакций объединяли и осаждали трихлоруксусной кислотой, чтобы сконцентрировать образцы для SDS-PAGE и масс-спектрометрического анализа. Образцы были проанализированы для идентификации белка SILAC в MS Bioworks (Анн-Арбор, Мичиган) и Emory CND Proteomics Facility (Атланта, Джорджия).Меченые SILAC образцы разделяли на 4–12% минигеле Bis-Tris Novex (Invitrogen) с использованием буферной системы MOPS и окрашивали кумасси, и дорожку вырезали на 20 равных сегментов с использованием сетки. Кусочки геля обрабатывали с использованием робота (ProGest; Digilab, Мальборо, Массачусетс), как описано (Gokhale et al. , 2012a; Perez-Cornejo et al. , 2012).

Переходный нокдаун белка и анализ иммуноблоттинга

Для нокдауна shRNA-опосредованного белка конструкции в pLKO.1 вектор был получен от Open Biosystems (Хантсвилл, Алабама). Идентификаторы клонов для целевых конструкций следующие: приглушенный (Bloc1s5), TRCN0000129117; паллидин (Bloc1s6), TRCN0000122781; струмпеллин, TRCN0000128018; и RhoGEF1, TRCN0000033567. Вектор управления скремблированием был получен от Addgene (Кембридж, Массачусетс; Vector 1864). Клетки HEK293T, засеянные в шестилуночные планшеты, трансфицировали 1 мкг ДНК конструкции shRNA в течение ночи с помощью Lipofectamine 2000 (Life Technologies) в соответствии с инструкциями производителя.Клетки MNT1 и SHSY-5Y высевали в шестилуночные планшеты и обрабатывали 1-2 мкл лентивирусных частиц с высоким титром, содержащих соответствующую лентивирусную конструкцию. Ядро вирусного вектора Emory NINDS подготовило все лентивирусы с высоким титром. Через два дня после доставки конструкции shРНК трансформированные клетки отбирали обработкой 2 мкг / мл пуромицина (Invitrogen) в подходящей питательной среде, как описано. Общая продолжительность лечения составляла 5–10 дней, чтобы обеспечить эффективный нокдаун интересующих белков.Олигонуклеотидные последовательности малых интерферирующих РНК (миРНК) против PI4KIIα и контролей, а также процедуры были описаны ранее (Craige et al. , 2008; Salazar et al. , 2009).

Для иммуноблот-анализа уровней белка клетки выращивали до слияния в шестилуночных планшетах. Клетки обрабатывали лентивирусами в течение 7 дней. Планшеты быстро перемещали на ледяную баню и сразу же дважды промывали ледяным PBS. Затем клетки помещали в буфер A и центрифугировали при 16 100 × г в течение 1 мин для получения осадка.Клетки MNT1 инкубировали в течение 10 мин в буфере А перед подъемом для облегчения высвобождения из планшета для культуры ткани. Осадки клеток ресуспендировали в 100 мкл буфера А, дополненного полной антипротеазой. Затем клетки лизировали ультразвуком (три цикла по пять импульсов по 1 с). Лизаты разбавляли до 1 мг / мл и разделяли с помощью SDS-PAGE и иммуноблоттинга. На лунку загружали от 5 до 15 мкг клеточного лизата.

Иммунофлуоресцентная микроскопия

Клетки HEK293T трансфицировали в шестилуночных планшетах 1 мкг конструкции ДНК с помощью липофектамина 2000 в течение 4 часов, а затем переводили в среду для выращивания.Через 24 ч клетки высевали на покровные стекла, покрытые матригелем. На следующий день покровные стекла перемещали на лед, дважды промывали ледяным PBS, а затем фиксировали 4% параформальдегидом в PBS в течение 20 минут. Для клеток, окрашенных красителем A488 MitoTracker (Invitrogen), клетки инкубировали с 500 нМ красителем MitoTracker, разведенным в питательной среде в течение 30 мин. После инкубации клетки немедленно фиксировали при 37 ° C в 4% параформальдегиде. После фиксации все покровные стекла дважды промывали PBS, а затем блокировали и обеспечивали проницаемость в течение 30 мин при комнатной температуре в растворе 0.02% сапонина (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури), 15% лошадиной сыворотки (HyClone), 2% бычьего сывороточного альбумина (Roche) и 1% желатина рыбьей кожи (Sigma-Aldrich) в PBS. Первичные антитела (дополнительная таблица S3) разводили в блокирующем растворе и применяли в течение 30 мин при 37 ° C. После инкубации первичных антител покровные стекла трижды промывали блокирующим раствором. Покровные стекла инкубировали в течение 30 минут при 37 ° C с вторичными антителами, конъюгированными с флуорофором (дополнительная таблица S3), разведенными в блокирующем растворе.Покровные стекла промывали два раза в блокирующем растворе, один раз в PBS и один раз в сверхчистой воде, а затем помещали на предметные стекла в установочной среде Gelvatol (Sigma-Aldrich).

Для микроскопии деконволюции фиксированных клеток изображения получали на инвертированном микроскопе Zeiss Axiovert 200M (Carl Zeiss, Jena, Germany) с набором фильтров Sedat (Chroma Technology, Brattleboro, VT). Программное обеспечение Slidebook 4.0 OSX использовалось для запуска многоволновой системы трехмерной микроскопии с широким полем поля (Intelligent Imaging Innovations, Денвер, Колорадо).Изображения были визуализированы с помощью 100-кратного масляного дифференциального интерференционного контрастного объектива с числовой апертурой 1,4 и сняты с помощью охлаждаемой камеры Cool-Snap HQ с зарядовой связью научного уровня (Photometrics, Tucson, AZ) с чипом ORCA-ER (Hamamatsu Photonics, Хамамацу, Япония). Изображения были получены при длине волны 200 нм между плоскостями z . Для удаления расфокусированного света использовался ограниченный итерационный алгоритм деконволюции с ограничением ближайшего соседа с гауссовым сглаживанием (Swedlow и др. , 1997, 2002).Изображения были экспортированы из программного обеспечения Slidebook 4.0 как 8-битные серии TIF. Для анализа колокализации из сфокусированных плоскостей изображения вычитали фон с помощью 10-пиксельного алгоритма катящегося шарика на Фиджи (ImageJ; Национальные институты здравоохранения, Бетесда, Мэриленд). Была выбрана представляющая интерес область, непосредственно окружающая отдельные ячейки, и коэффициент Пирсона был рассчитан с помощью подключаемого модуля Coloc 2. Трехмерные реконструкции были созданы из деконволютированных 8-битных изображений серии TIF, импортированных в Imaris 6.3.1 с использованием ручного определения порога и минимального ограничения громкости в 4 вокселя (Bitplane Scientific Software, Цюрих, Швейцария).

Для визуализации живых клеток EGFP-меченного PI4KIIα и меченного mCherry пептида LifeAct клетки HEK293T, экспрессирующие флуоресцентно меченые белковые конструкции, высевали в покрытые матригелем культуральные чашки со стеклянным дном (Matek Corporation, Ashland, MA). Перед визуализацией клетки поддерживали в ростовой среде HEK293T, как описано, при 37ºC и 10% CO ₂ . Непосредственно перед визуализацией применялась среда для визуализации, состоящая из сбалансированного солевого раствора Хэнка за вычетом фенолового красного и NaHCO ₂ (Sigma-Aldrich) с добавлением 10% FBS (HyClone).Клетки получали с помощью инвертированного микроскопа Nikon TE2000 (Nikon Instruments, Мелвилл, Нью-Йорк), оснащенного гибридным сканером Perfect Focus и камерой для регулирования температуры до 37 ° C и 5% CO ₂ . Изображения были получены с помощью масляного объектива с числовой апертурой 100 ×, 1,49 и наборов фильтров 500–550 / 570–620 с использованием программного обеспечения NIS-Elements AR 3.1 (Nikon). Клетки поочередно возбуждали лазерами с длиной волны 488 и 568 нм каждые 4,25 с, и было получено одно изображение конфокальной плоскости.Изображения были экспортированы в виде 8-битных серий TIF в программе NIS-Elements, а рисунки были скомпилированы в Photoshop (Adobe, Сан-Хосе, Калифорния).

Для визуализации живых клеток PI4KIIα с мечеными функционально меченными эндосомами флуоресцентные метки были взяты из экспрессированных белковых конструкций (GFP и dsRed) или антитела против FLAG M1, конъюгированного с красителем Alexa 647. Клетки выращивали на покровных стеклах и поддерживали в 10% FBS (Life Technologies), DMEM с высоким содержанием глюкозы (HyClone) и отображали в Opti-MEME (Life Technologies) с 10% FBS и забуферивали до pH 7.4 с 40 мМ HEPES. Конфокальные изображения живых клеток получали на системе Revolution XD Spinning Disk (Андор, Белфаст, Великобритания) с инвертированным микроскопом Nikon Eclipse Ti. Объектив, использованный для захвата, представлял собой флуоресцентный объектив с числовой апертурой 100 × / 1,49 от компании Nikon с полным внутренним отражением. И микроскоп, и объективы были помещены в шкаф для контроля температуры, поддерживаемый на уровне 37 ° C. Источниками света служили твердотельные лазеры с длиной волны 488, 561 и 647 нм, а изображения получали на камеру электронного умножителя с зарядовой связью iXON + 897 с использованием Andor iQ.Анализ изображений проводился на необработанных изображениях в ImageJ. Изображения не подвергались никаким изменениям, кроме назначения цвета и яркости / контраста для многоканальных изображений. Для оценки канальцев слепым методом отбирали клетки в канале β2-адрегенергического рецептора. Мы считали, что клетка имеет фенотип канальцев, если она содержит более одного объекта, который примерно в четыре раза длиннее, чем ширина в диапазоне размеров эндосом. Клетки были поставлены в фокус с использованием только канала β2-дрегенергического рецептора перед агонистом, чтобы избежать смещения при выборе клеток с фенотипом.Все имена файлов были рандомизированы для слепой оценки.

Фракционирование клеток

Конфлюэнтные клетки HEK293T дважды промывали ледяным PBS, а затем переносили во внутриклеточный буфер (38 мМ аспартат калия, 38 мМ глутамат калия, 38 мМ глюконат калия, 20 мМ MOPS-KOH, pH 7,2, 5 мМ восстановленный глутатион, 5 мМ карбонат натрия, 2,5 мМ сульфат магния, 2 мМ EGTA). Клетки центрифугировали при 800 × г для получения осадка, а затем ресуспендировали в минимальном объеме внутриклеточного буфера, дополненного 5-кратной концентрацией полной антипротеазы.Клетки гомогенизировали с использованием устройства для взлома клеток с зазором 12 мкм (Clift-O’Grady et al. , 1998; Lichtenstein et al. , 1998). От 200 до 250 мкл гомогената (450-800 мкг) наносили слоями на 10-45% градиенты сахарозы, забуференные 20 мМ MOPS (pH 7,2), которые получали с использованием Gradient Master (Biocomp Instruments, Фредериктон, Канада). Градиенты сахарозы центрифугировали в течение 1 ч при 210 000 × g при 4 ° C в роторе Beckman SW55Ti и фракции анализировали с помощью иммуноблоттинга.Показатели преломления сахарозы для каждой фракции измеряли рефрактометром (Leica, Wetzlar, Германия).

Поверхностная маркировка и извлечение стрептавидина

После 7 дней обработки лентивирусами, нацеленными на скрембл или струмпеллин, планшеты сливающихся клеток MNT1 перемещали в ледяную баню и дважды промывали ледяным PBS-Ca-Mg (0,1 мМ CaCl ₂ и 1 мМ MgCl ₂ в PBS). Все использованные растворы были ледяными при нанесении на клетки, и клетки поддерживали на ледяной бане на всем протяжении.После промываний клетки инкубировали в 1 мМ растворе периодата натрия (Sigma-Aldrich), приготовленном в PBS-Ca-Mg, в течение 30 мин, после чего раствор периодата удаляли и гасящий раствор 1 мМ глицерина в PBS-Ca-Mg. был добавлен (Zeng et al. , 2009). Затем клетки дважды промывали PBS-Ca-Mg и наносили раствор для лигирования биотина из 100 мкМ аминооксибиотина (Biotium, Hayward, CA) и 10 мМ анилина (Sigma-Aldrich) на 90 мин. После лигирования биотина клетки дважды промывали PBS-Ca-Mg и лизировали в течение 30 мин в буфере A с 0.5% Triton X-100, дополненный полной антипротеазой. Эта процедура биотинилирования основана на образующемся периодатом альдегиде на сиаловых кислотах. Этот процесс катализируется анилин-зависимым лигированием с соответствующей меткой. Катализ анилином ускоряет лигирование, облегчая реакцию с низкими концентрациями аминооксибиотина при нейтральном pH для мечения большинства сиалилированных гликопротеинов клеточной поверхности (Zeng et al. , 2009). После лизиса обломки клеток соскребали с планшетов и лизаты центрифугировали при 16 100 × г в течение 15 мин.Супернатант собирали и разбавляли до 0,2 мг / мл. Небольшой объем (50 мкл) покрытых нейтр-авидином агарозных шариков (Thermo Scientific, Waltham, MA) предварительно дважды промывали в буфере A с 0,1% Triton X-100, и 100 мкг клеточного лизата инкубировали с шариками в течение 2 часов. с непрерывным вращением при 4 ° C. Затем шарики промывали пять раз в буфере A с 0,1% Triton X-100 в течение 5 минут с вращением «конец за концом» при 4 ° C. Белки элюировали из шариков кипячением в буфере для образцов Лэммли при 75 ° C в течение 5 минут, и образцы анализировали с помощью SDS-PAGE с последующим окрашиванием серебром или иммуноблоттингом.

Вычислительный и статистический анализ

Функциональная аннотация гена для набора PI4KIIα-взаимодействующих белков (дополнительная таблица S2) была выполнена с использованием терминов базы данных для аннотаций, визуализации и интегрированного обнаружения (DAVID, версия 6.7) и генной онтологии (GO). (Деннис и др. , 2003; Хуанг да и др. , 2007). Плагин Cytoscape Enrichment Map использовался для отображения совпадения терминов генной онтологии в Cytoscape (версия 2.8.3; Merico et al., 2010). Размер узла был сопоставлен с количеством генов в категории GO, а цвет узла был сопоставлен со значением p для обогащения данной категории. Для сетевого анализа была построена карта сетевого взаимодействия с использованием GeneGo Metacore (версия 6.11, сборка 41105) для взаимодействующих с PI4KIIα белков (дополнительная таблица S1) и субъединиц BLOC-1. Сеть была визуализирована в Cytoscape, и цвет узлов был сопоставлен с интересующими белками.

Условия экспериментов сравнивали с помощью программы KaleidaGraph, версия 4.1.3 (Synergy Software, Reading, PA) или StatPlus Mac Built5.6.0pre / Universal (AnalystSoft, Ванкувер, Канада). Данные представлены в виде прямоугольных диаграмм, отображающих четыре квартиля данных, причем «прямоугольник» содержит два средних квартиля, разделенных медианой. Верхний и нижний квартили представлены одиночными линиями, отходящими от прямоугольника.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами Национальных институтов здравоохранения ({«type»: «entrez-nucleotide», «attrs»: {«text»: «GM077569», «term_id»: «221372554»}} } GM077569 и NS42599) и Детский центр нейробиологии CHOA В.F. P.V.R. был поддержан стипендией F31NS0765 Национальной исследовательской службы. Этот исследовательский проект частично поддержан Интегрированным ядром микроскопии клеточной визуализации Университета Эмори и вирусными ядрами Национального института неврологических расстройств и инсульта Национального института неврологии Эмори, грантом P30NS055077. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Используемые сокращения:

90bis7 РНК

ATP7A	АТФаза Cu ++, транспортирующая альфа-полипептид
BLOC	биогенез комплекса органелл, связанных с липосомами
DSP	зеленый флуоресцентный протеин
HA	гемагглютинин
ВЭЖХ	высокоэффективная жидкостная хроматография
HPS		Hermansky-Pudlak МС	масс-спектрометрия
МС / МС	тандемная масс-спектрометрия
PI4KIIα	фосфатидилинозитол-4-киназа типа IIα
8 PY4P 90spositol 90spit48		90sposit	PI4 солевой раствор с фосфатным буфером
SILAC	мечение стабильных изотопов аминокислотами в клеточной культуре
миРНК	малые интерферирующие
РНК	shRNA		рецептор коротких шпилек
VAMP7	мембранный белок, связанный с везикулами 7

ССЫЛКИ

• Aittaleb M, Boguth CA, Tesmer JJ.Структура и функция факторов обмена генов нуклеотидов, регулируемых гетеротримерным G-белком. Mol Pharmacol. 2010. 77: 111–125. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Anitei M, Hoflack B. Динамика мостиковой мембраны и цитоскелета в секреторных и эндоцитарных путях. Nat Cell Biol. 2012; 14: 11–19. [PubMed] [Google Scholar]
• Anitei M, Stange C, Parshina I, Baust T, Schenck A, Raposo G, Kirchhausen T., Hoflack B. Белковые комплексы, содержащие CYFIP / Sra / PIR121, координируют передачу сигналов Arf1 и Rac1 во время клатрин-AP -1-покрытый биогенез носителя в TGN.Nat Cell Biol. 2010. 12: 330–340. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Балла А., Туйметова Г., Баршишат М., Гейзт М., Балла Т. Характеристика изоформ фосфатидилинозитол-4-киназы типа II выявила ассоциацию ферментов с эндосомными везикулярными компартментами. J Biol Chem. 2002; 277: 20041–20050. [PubMed] [Google Scholar]
• Барылко Б., Влодарски П., Биннс Д.Д., Гербер С.Х., Эрнест С., Судхоф Т.С., Гричин Н., Албанези Дж.П. Анализ каталитического домена фосфатидилинозитол-4-киназы II типа.J Biol Chem. 2002; 277: 44366–44375. [PubMed] [Google Scholar]
• Baust T, Anitei M, Czupalla C, Parshyna I, Bourel L, Thiele C, Krause E, Hoflack B. Белковые сети, поддерживающие функцию AP-3 в нацеливании на белки лизосомных мембран. Mol Biol Cell. 2008; 19: 1942–1951. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Bear JE. Сортировка эндосом в WASH. Dev Cell. 2009. 17: 583–584. [PubMed] [Google Scholar]
• Биркенфельд Дж., Налбант П., Юн Ш., Бокоч Г. М.. Клеточные функции GEF-h2, Rho-GEF, регулируемого микротрубочками: измененная активность GEF-h2 является решающим фактором патогенеза заболевания.Trends Cell Biol. 2008. 18: 210–219. [PubMed] [Google Scholar]
• Blackstone C. Клеточные пути наследственной спастической параплегии. Annu Rev Neurosci. 2012; 35: 25–47. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Блазиус А.Л., Брандл К., Крозат К., Ся Й, Хованант К., Кребс П., Смарт Н.Г., Замполли А., Руджери З.М., Бейтлер Б.А. Мыши с мутациями Dock7 имеют общую гипопигментацию и белые пятна, но демонстрируют нормальную неврологическую функцию. Proc Natl Acad Sci USA. 2009. 106: 2706–2711.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Bonifacino JS, Glick BS. Механизмы почкования и слияния пузырьков. Клетка. 2004. 116: 153–166. [PubMed] [Google Scholar]
• Брокер С., Энгельбрехт-Вандре С., Унгерманн С. Мультисубъединичные связывающие комплексы и их роль в слиянии мембран. Curr Biol. 2010; 20: R943 – R952. [PubMed] [Google Scholar]
• Бултема Дж. Дж., Ди Пьетро С. М.. Rab32 и Rab38, специфичные к типу клеток, взаимодействуют с повсеместным механизмом биогенеза лизосом для синтеза специализированных органелл, связанных с лизосомами.Малые GTPases. 2013; 4: 16–21. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Campellone KG, Welch MD. Гонка вооружений нуклеаторов: клеточный контроль сборки актина. Nat Rev. Mol Cell Biol. 2010; 11: 237–251. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Карнелл М., Зеч Т., Каламинус С.Д., Ура С., Хагедорн М., Джонстон С.А., Май Р.С., Солдати Т., Маски Л.М., Insall RH. Полимеризация актина, вызванная WASH, вызывает извлечение V-АТФазы и нейтрализацию везикул перед экзоцитозом. J Cell Biol. 2011; 193: 831–839.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Clemen CS, et al. Струмпеллин — новый валозин-содержащий белок связывающий партнер, связывающий наследственную спастическую параплегию с заболеваниями агрегации белков. Головной мозг. 2010; 133: 2920–2941. [PubMed] [Google Scholar]
• Клифт-О’Грейди Л., Деснос К., Лихтенштейн Ю., Фаундез В., Хорнг Дж. Т., Келли Р. Б.. Восстановление биогенеза синаптических пузырьков из клеточных мембран PC12. Методы. 1998. 16: 150–159. [PubMed] [Google Scholar]
• Коннер С.Д., Шмид С.Л.Регулируемые порталы входа в камеру. Природа. 2003; 422: 37–44. [PubMed] [Google Scholar]
• Craige B, Salazar G, Faundez V. Фосфатидилинозитол-4-хиназа типа II альфа содержит мотив сортировки AP-3 и киназный домен, которые необходимы для трафика эндосом. Mol Biol Cell. 2008; 19: 1415–1426. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Delevoye C, et al. AP-1 и KIF13A координируют сортировку и позиционирование эндосом во время биогенеза меланосом. J Cell Biol. 2009. 187: 247–264.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Dell’Angelica EC. AP-3-зависимая торговля людьми и болезни: первое десятилетие. Curr Opin Cell Biol. 2009; 21: 552–559. [PubMed] [Google Scholar]
• Dell’Angelica EC, Shotelersuk V, Aguilar RC, Gahl WA, Bonifacino JS. Измененный трафик лизосомных белков при синдроме Германского-Пудлака из-за мутаций в бета-субъединице 3A адаптера AP-3. Mol Cell. 1999; 3: 11–21. [PubMed] [Google Scholar]
• Деннис Дж., Младший, Шерман Б.Т., Хосак Д.А., Ян Дж., Гао В., Лейн ХК, Лемпицки Р.А.ДЭВИД: База данных для аннотаций, визуализации и интегрированного обнаружения. Genome Biol. 2003; 4: P3. [PubMed] [Google Scholar]
• Derivery E, Sousa C, Gautier JJ, Lombard B, Loew D, Gautreau A. Активатор Arp2 / 3 WASH контролирует деление эндосом через большой мультипротеиновый комплекс. Dev Cell. 2009; 17: 712–723. [PubMed] [Google Scholar]
• Ди Пьетро С. М., Фалькон-Перес Дж. М., Тенза Д., Сетти С. Р., Маркс М. С., Рапосо Дж., Dell’Angelica EC. BLOC-1 взаимодействует с BLOC-2 и комплексом AP-3, облегчая перенос белков в эндосомы.Mol Biol Cell. 2006; 17: 4027-4038. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Duleh SN, Welch MD. WASH и комплекс Arp2 / 3 регулируют форму и транспорт эндосом. Цитоскелет (Хобокен) 2010; 67: 193–206. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Duleh SN, Welch MD. Регуляция переноса интегрина, клеточной адгезии и миграции клеток с помощью WASH и комплекса Arp2 / 3. Цитоскелет (Хобокен) 2012; 69: 1047–1058. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Ferguson SM, De Camilli P.Динамин, ГТФаза, ремоделирующая мембраны. Nat Rev Mol Cell Biol. 2012; 13: 75–88. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Finsterer J, Loscher W, Quasthoff S, Wanschitz J, Auer-Grumbach M, Stevanin G. Наследственные спастические параплегии с аутосомно-доминантным, рецессивным, X-сцепленным или материнским признаком наследства. J Neurol Sci. 2012; 318: 1–18. [PubMed] [Google Scholar]
• Freeman C, Seaman MN, Reid E. Наследственный белок спастической параплегии strumpellin: характеристика нейронов и влияние патологических мутаций на сборку и функцию комплекса WASH.Biochim Biophys Acta. 2013; 1832: 160–173. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Gao Y, Zorman S, Gundersen G, Xi Z, Ma L, Sirinakis G, Rothman JE, Zhang Y. Отдельные воссозданные нейронные комплексы SNARE застегиваются на три различных этапа. Наука. 2012; 337: 1340–1343. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Gokhale A, Larimore J, Werner E, So L, Moreno-De-Luca A, Lese-Martin C, Lupashin VV, Smith Y, Faundez V. Количественная протеомика и Генетический анализ фактора восприимчивости к шизофрении дисбиндин выявляет новые роли в биогенезе комплекса органелл, связанных с лизосомами 1.J Neurosci. 2012a; 32: 3697–3711. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Gokhale A, Perez-Cornejo P, Duran C, Hartzell HC, Faundez V. Комплексная стратегия идентификации стехиометрических взаимодействий с мембранными белками. Сотовый Логист. 2012b; 2: 1–8. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Gomez TS, Billadeau DD. Комплекс WASH, содержащий FAM21, регулирует ретромер-зависимую сортировку. Dev Cell. 2009; 17: 699–711. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Gomez TS, Gorman JA, de Narvajas AA, Koenig AO, Billadeau DD.Дефекты движения в фибробластах, нокаутированных по WASH, происходят из-за разрушенных эндосомных и лизосомных сетей. Mol Biol Cell. 2012; 23: 3215–3228. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Guo J, Wenk MR, Pellegrini L, Onofri F, Benfenati F, De Camilli P. Фосфатидилинозитол-4-киназа типа IIalpha отвечает за активность фосфатидилинозитол-4-киназы, связанную с синаптические везикулы. Proc Natl Acad Sci USA. 2003; 100: 3995–4000. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Хао Й. Х., Дойл Дж. М., Раманатан С., Гомес Т. С., Цзя Д., Сюй М., Чен З. Дж., Билладо Д. Д., Розен М. К., Поттс П. Р..Регуляция WASH-зависимой полимеризации актина и транспорта белков путем убиквитинирования. Клетка. 2013; 152: 1051–1064. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Harbour ME, Breusegem SY, Antrobus R, Freeman C, Reid E, Seaman MN. Карго-селективный ретромерный комплекс является центром рекрутирования белковых комплексов, которые регулируют динамику эндосомных канальцев. J Cell Sci. 2010; 123: 3703–3717. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Harbour ME, Breusegem SY, Seaman MN. Рекрутирование эндосомного комплекса WASH опосредуется удлиненным «хвостом» связывания Fam21 с ретромерным белком Vps35.Биохим Дж. 2012; 442: 209–220. [PubMed] [Google Scholar]
• Helfer E, Harbour ME, Henriot V, Lakisic G, Sousa-Blin C, Volceanov L, Seaman MN, Gautreau A. Эндосомное рекрутирование комплекса WASH: активные последовательности и мутации, нарушающие взаимодействие с ретромер. Biol Cell. 2013; 105: 191–207. [PubMed] [Google Scholar]
• Хуанг да В. и др. Ресурсы DAVID по биоинформатике: расширенная база данных аннотаций и новые алгоритмы для лучшего извлечения биологии из больших списков генов. Nucleic Acids Res.2007; 35: W169 – W175. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Huizing M, Helip-Wooley A, Westbroek W., Gunay-Aygun M, Gahl WA. Нарушения биогенеза лизосомальных органелл: клиническая и молекулярная генетика. Анну Рев Геномикс Хум Генет. 2008. 9: 359–386. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Джиа Д., Гомес Т.С., Билладо Д.Д., Розен М.К. Множественные повторяющиеся элементы в хвосте FAM21 связывают регуляторный комплекс актина WASH с ретромером. Mol Biol Cell. 2012; 23: 2352–2361.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Джиа Д., Гомес Т.С., Метлагель З., Уметани Дж., Отвиновски З., Розен М.К., Билладо Д.Д. Регуляторы актина WASH и WAVE семейства белков синдрома Вискотта-Олдрича (WASP) контролируются аналогичными структурно родственными комплексами. Proc Natl Acad Sci USA. 2010; 107: 10442–10447. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Kaksonen M, Peng HB, Rauvala H. Ассоциация кортактина с динамическим актином в ламеллиподиях и на эндосомальных пузырьках.J Cell Sci. 2000; 113: 4421–4426. [PubMed] [Google Scholar]
• Каксонен М., Торет С.П., Друбин Д.Г. Модульная конструкция аппарата эндоцитоза, опосредованного клатрином и актином. Клетка. 2005; 123: 305–320. [PubMed] [Google Scholar]
• Каксонен М., Торет С.П., Друбин Д.Г. Использование динамики актина для клатрин-опосредованного эндоцитоза. Nat Rev Mol Cell Biol. 2006; 7: 404–414. [PubMed] [Google Scholar]
• Кантети П., Диас М.Э., Педен А.Е., Сеонг Е.Э., Долан Д.Ф., Робинсон М.С., Ноэбельс Дж. Л., Бурмейстер М.Л.Генетический и фенотипический анализ мутанта мыши mh (2J), аллеля Ap3d, вызванного вставкой элемента IAP. Мамм Геном. 2003. 14: 157–167. [PubMed] [Google Scholar]
• Kennerson ML, et al. Миссенс-мутации в гене переносчика меди ATP7A вызывают Х-сцепленную дистальную наследственную моторную нейропатию. Am J Hum Genet. 2010. 86: 343–352. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Larimore J, et al. Фактор восприимчивости к шизофрении дисбиндин и связанный с ним комплекс сортируют грузы от тел клеток к синапсу.Mol Biol Cell. 2011; 22: 4854–4867. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Li W, et al. Синдром Германского-Пудлака типа 7 (HPS-7) является результатом мутантного дисбиндина, члена биогенеза связанного с лизосомами комплекса органелл 1 (BLOC-1) Nat Genet. 2003. 35: 84–89. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Lichtenstein Y, Desnos C, Faundez V, Kelly RB, Clift-O’Grady L. Везикуляция и сортировка эндосом, полученных из PC12, in vitro. Proc Natl Acad Sci USA. 1998; 95: 11223–11228.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Лю Р., Абреу-Бланко М.Т., Барри К.С., Линардопулу Е.В., Осборн Г.Э., Паркхерст С.М. Wash действует ниже Rho и связывает линейные и разветвленные факторы нуклеации актина. Разработка. 2009. 136: 2849–2860. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Ломант А.Дж., Фэрбенкс Г. Химические исследования расширенных биологических структур: синтез и свойства расщепляемого белка сшивающего реагента [35S] дитиобис (сукцинимидилпропионат) J Mol Biol.1976; 104: 243–261. [PubMed] [Google Scholar]
• Манн М. Функциональная и количественная протеомика с использованием SILAC. Nat Rev. Mol Cell Biol. 2006; 7: 952–958. [PubMed] [Google Scholar]
• McMahon HT, Boucrot E. Молекулярный механизм и физиологические функции клатрин-опосредованного эндоцитоза. Nat Rev. Mol Cell Biol. 2011; 12: 517–533. [PubMed] [Google Scholar]
• Мерико Д., Иссерлин Р., Стюкер О., Эмили А., Бадер Г. Д.. Карта обогащения: сетевой метод визуализации и интерпретации обогащения набора генов.PloS One. 2010; 5: e13984. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Minogue S, Waugh MG, De Matteis MA, Stephens DJ, Berditchevski F, Hsuan JJ. Фосфатидилинозитол-4-киназа необходима для эндосомного переноса и деградации рецептора EGF. J Cell Sci. 2006; 119: 571–581. [PubMed] [Google Scholar]
• Монфрегола Дж., Наполитано Дж., Д’Урсо М., Лаппалайнен П., Урсини М.В. Функциональная характеристика белка синдрома Вискотта-Олдрича и гомолога рубца (WASH), бимодульного фактора, способствующего нуклеации, способного взаимодействовать с биогенезом связанной с лизосомами субъединицы 2 органеллы (BLOS2) и гамма-тубулина.J Biol Chem. 2010; 285: 16951–16957. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Мурен О.Л., Галлетта Б.Дж., Купер Дж.А. Роль сборки актина в эндоцитозе. Анну Рев Биохим. 2012. 81: 661–686. [PubMed] [Google Scholar]
• Mossinger J, Wieffer M, Krause E, Freund C., Gerth F, Krauss M, Haucke V. Функция фосфатидилинозитол-4-киназы IIальфа в эндосомах регулируется убиквитинлигазой Itch. EMBO Rep. 2012; 13: 1087–1094. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Nakagawa T., Setou M, Seog D, Ogasawara K, Dohmae N, Takio K, Hirokawa N.Новый мотор, KIF13A, транспортирует маннозо-6-фосфатный рецептор к плазматической мембране посредством прямого взаимодействия с комплексом AP-1. Клетка. 2000; 103: 569–581. [PubMed] [Google Scholar]
• Newell-Litwa K, Chintala S, Jenkins S, Pare JF, McGaha L, Smith Y, Faundez V. Hermansky-Pudlak, белковые комплексы, AP-3 и BLOC-1, по-разному регулируют пресинаптический состав в полосатом теле и гиппокампе. J Neurosci. 2010. 30: 820–831. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Newell-Litwa K, Salazar G, Smith Y, Faundez V.Роль комплексов BLOC-1 и AP-3 в сортировке грузов в синаптические везикулы. Mol Biol Cell. 2009; 20: 1441–1453. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Ньюэлл-Литва К., Сеонг Э., Бурмейстер М., Фаундез В. Нейрональные и ненейрональные функции механизма сортировки AP-3. J Cell Sci. 2007; 120: 531–541. [PubMed] [Google Scholar]
• Ong SE, Blagoev B, Kratchmarova I., Kristensen DB, Steen H, Pandey A, Mann M. Мечение стабильных изотопов аминокислот в культуре клеток, SILAC, как простой и точный подход к экспрессии протеомика.Mol Cell Proteom. 2002; 1: 376–386. [PubMed] [Google Scholar]
• Онг С.Э., Манн М. Практический рецепт мечения стабильных изотопов аминокислотами в культуре клеток (SILAC) Nat Protoc. 2006; 1: 2650–2660. [PubMed] [Google Scholar]
• Педен А.А., Радж Р.Э., Луи У.В., Робинсон М.С. Сборка и функция комплексов AP-3 в клетках, экспрессирующих мутантные субъединицы. J Cell Biol. 2002. 156: 327–336. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Perez-Cornejo P, Gokhale A, Duran C, Cui Y, Xiao Q, Hartzell HC, Faundez V.Аноктамин 1 (Tmem16A) Ca2 + -активированный хлоридный канал стехиометрически взаимодействует с сетью эзрин-радиксин-моэзин. Proc Natl Acad Sci USA. 2012; 109: 10376–10381. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Piotrowski JT, Gomez TS, Schoon RA, Mangalam AK, Billadeau DD. WASH-нокаутные Т-клетки демонстрируют дефектный перенос рецепторов, пролиферацию и эффекторную функцию. Mol Cell Biol. 2013; 33: 958–973. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Puthenveedu MA, Lauffer B, Temkin P, Vistein R, Carlton P, Thorn K, Taunton J, Weiner OD, Parton RG, von Zastrow M.Последовательно-зависимая сортировка рециклирующих белков с помощью стабилизированных актином эндосомных микродоменов. Клетка. 2010. 143: 761–773. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Квалманн Б., Кессельс М.М., Келли Р.Б. Молекулярные связи между эндоцитозом и актиновым цитоскелетом. J Cell Biol. 2000; 150: F111 – F116. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Raposo G, Marks MS. Меланосомы — темные органеллы просветляют транспорт через эндосомную мембрану. Nat Rev. Mol Cell Biol. 2007. 8: 786–797. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Raposo G, Marks MS, Cutler DF.Органеллы, связанные с лизосомами: специализация компартментов после Гольджи. Curr Opin Cell Biol. 2007; 19: 394–401. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Riedl J, et al. Lifeact: универсальный маркер для визуализации F-актина. Нат методы. 2008; 5: 605–607. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Россман К.Л., Дер С.Дж., Сондек Дж. GEF означает: включение ГТФаз RHO с факторами обмена гуаниновых нуклеотидов. Nat Rev Mol Cell Biol. 2005; 6: 167–180. [PubMed] [Google Scholar]
• Rottner K, Hanisch J, Campellone KG.WASH, WHAMM и JMY: регуляция комплекса Arp2 / 3 и не только. Trends Cell Biol. 2010. 20: 650–661. [PubMed] [Google Scholar]
• Rotty JD, Wu C, Bear JE. Новое понимание регуляции и клеточных функций комплекса ARP2 / 3. Nat Rev Mol Cell Biol. 2012; 14: 7–12. [PubMed] [Google Scholar]
• Salazar G, et al. Дефицит комплекса BLOC-1 изменяет нацеливание на грузы адапторного белкового комплекса-3. Mol Biol Cell. 2006; 17: 4014–4026. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Salazar G, Zlatic S, Craige B, Peden AA, Pohl J, Faundez V.Белковые комплексы синдрома Германского-Пудлака связываются с фосфатидилинозитол-4-киназой типа II альфа в нейрональных и ненейрональных клетках. J Biol Chem. 2009. 284: 1790–1802. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Schmid EM, McMahon HT. Интеграция молекулярной и сетевой биологии для декодирования эндоцитоза. Природа. 2007; 448: 883–888. [PubMed] [Google Scholar]
• Шмид С.Л., Фролов В.А. Dynamin: функциональная конструкция мембранного катализатора деления. Annu Rev Cell Dev Biol. 2011; 27: 79–105.[PubMed] [Google Scholar]
• Seaman MN. Ретромерный комплекс — рециклинг эндосомного белка и не только. J Cell Sci. 2012; 125: 4693–4702. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Setty SR, Tenza D, Sviderskaya EV, Bennett DC, Raposo G, Marks MS. Клеточно-специфический транспорт ATP7A поддерживает медьзависимую активность тирозиназы в меланосомах. Природа. 2008; 454: 1142–1146. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Setty SR, et al. BLOC-1 необходим для груз-специфической сортировки от вакуолярных ранних эндосом к органеллам, связанным с лизосомами.Mol Biol Cell. 2007. 18: 768–780. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Simons JP, et al. Потеря активности фосфатидилинозитол-4-киназы 2альфа вызывает позднюю дегенерацию аксонов спинного мозга. Proc Natl Acad Sci USA. 2009. 106: 11535–11539. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Starcevic M, Dell’Angelica EC. Идентификация снапина и трех новых белков (BLOS1, BLOS2 и BLOS3 / снижение пигментации) как субъединиц биогенеза комплекса-1 связанных с лизосомами органелл (BLOC-1) J Biol Chem.2004; 279: 28393–28401. [PubMed] [Google Scholar]
• Styers ML, Salazar G, Love R, Peden AA, Kowalczyk AP, Faundez V. Механизм эндолизосомной сортировки взаимодействует с цитоскелетом промежуточных волокон. Mol Biol Cell. 2004. 15: 5369–5382. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Сведлоу Дж. Р., Ху К., Эндрюс П. Д., Роос Д. С., Мюррей Дж. М.. Измерение содержания тубулина в Toxoplasma gondii : сравнение лазерной сканирующей конфокальной и широкопольной флуоресцентной микроскопии.Proc Natl Acad Sci USA. 2002; 99: 2014–2019. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Сведлоу Дж. Р., Седат Дж. У., Агард Д. А.. Деконволюция в оптической микроскопии. В: Янссон П.А., редактор. Деконволюция изображений и спектров. Сан-Диего, Калифорния: Academic Press; 1997. С. 284–307. [Google Scholar]
• Тейлор MJ, Perrais D, Merrifield CJ. Высокоточный обзор молекулярной динамики клатрин-опосредованного эндоцитоза у млекопитающих. PLoS Biol. 2011; 9: e1000604. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Trinkle-Mulcahy L, et al.Идентификация конкретных партнеров взаимодействия белков с использованием количественной масс-спектрометрии и протеомов бус. J Cell Biol. 2008. 183: 223–239. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Valdmanis PN, et al. Мутации в гене KIAA0196 в локусе SPG8 вызывают наследственную спастическую параплегию. Am J Hum Genet. 2007. 80: 152–161. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Велтман Д.М., Insall RH. Белки семейства WASP: их эволюция и физиологические последствия. Mol Biol Cell.2010; 21: 2880–2893. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Вэй А.Х., Синдром Ли В. Хермански-Пудлака: пигментные и непигментные дефекты и их патогенез. Pigment Cell Melanoma Res. 2013; 26: 176–192. [PubMed] [Google Scholar]
• Викнер В., Шекман Р. Слияние мембран. Nat Struct Mol Biol. 2008. 15: 658–664. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Yi L, Donsante A, Kennerson ML, Mercer JF, Garbern JY, Kaler SG. Измененная внутриклеточная локализация и взаимодействие валозин-содержащего белка (p97 VCP) лежат в основе дистальной моторной нейропатии, связанной с ATP7A.Human Mol Genet. 2012; 21: 1794–1807. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Zech T, Calaminus SD, Caswell P, Spence HJ, Carnell M, Insall RH, Norman J, Machesky LM. Активатор Arp2 / 3 WASH регулирует инвазивную миграцию, опосредованную альфа5бета1-интегрином. J Cell Sci. 2011; 124: 3753–3759. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Zeng Y, Ramya TN, Dirksen A, Dawson PE, Paulson JC. Высокоэффективное мечение сиалилированных гликопротеинов на живых клетках. Нат методы. 2009; 6: 207–209.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Zlatic SA, Ryder PV, Salazar G, Faundez V. Выделение лабильных мультибелковых комплексов с помощью in vivo контролируемого клеточного сшивания и иммуномагнитной аффинной хроматографии. J Vis Exp. 2010; pii: 1855. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

Комплекс WASH, эндосомальный активатор Arp2 / 3, взаимодействует с комплексом синдрома Германского – Пудлака BLOC-1 и его грузовой фосфатидилинозитол-4-киназой типа IIα

Мол. Biol Cell.2013 15 июля; 24 (14): 2269–2284.

PV Ryder

^a Кафедра клеточной биологии, Университет Эмори, Атланта, Джорджия 30322

R. Vistein

^b Биологические науки, Университет Карнеги-Меллона, Питтсбург, Пенсильвания 15213

A. Gokhale

a Департамент клеточной биологии, Университет Эмори, Атланта, Джорджия, 30322

MN Seaman

^c Кембриджский институт медицинских исследований / Департамент клинической биохимии, Кембриджский университет, Кембридж CB2 2QR, Соединенное Королевство

M.А. Путенведу

^b Биологические науки, Университет Карнеги-Меллона, Питтсбург, Пенсильвания 15213

В. Фаундес

^a Кафедра клеточной биологии, Университет Эмори, Атланта, Джорджия 30322

Кейт Э. Мостов, редактор мониторинга

Калифорнийский университет, Сан-Франциско

^a Отделение клеточной биологии, Университет Эмори, Атланта, Джорджия 30322

^b Биологические науки, Университет Карнеги-Меллона, Питтсбург, Пенсильвания 15213

^c Кембриджский институт медицинских исследований / Департамент клинической биохимии, Кембриджский университет, Кембридж CB2 2QR, Соединенное Королевство

Получено 12 февраля 2013 г .; Пересмотрено 7 мая 2013 г .; Принята в печать 9 мая 2013 г.

Авторские права © 2013 Ryder et al. Эта статья распространяется Американским обществом клеточной биологии по лицензии авторов. Через два месяца после публикации он становится общедоступным под лицензией Creative Commons License с указанием авторства и некоммерческого использования 3.0 (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/3.0).

«ASCB®», «Американское общество клеточной биологии®» и «Молекулярная биология клетки®» являются зарегистрированными товарными знаками Американского общества клеточной биологии.

Эта статья цитируется в других статьях в PMC.

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы

GUID: BA30A07A-40CD-4CC1-88B7-13C9D028F158

GUID: B4A6060A-6E0D-4CBC-B6CD-0575149F0A33

GUID: 35190B96-B6B0-4753-8759-E8A5825B8BF5

GUID: AA52F3A6-1B0A-4E8B-AA34-541864D

Abstract

Компоненты механизмов биогенеза везикул, такие как белки оболочки, могут взаимодействовать с актиновым цитоскелетом для сортировки грузов по нескольким путям.Однако неизвестно, являются ли эти взаимодействия общим требованием для разнообразных маршрутов трафика эндосом. В этом исследовании мы идентифицируем актиновые регуляторы цитоскелета как ранее нераспознанные интеракторы комплексов, ассоциированных с синдромом Hermansky-Pudlak. Два комплекса, мутировавшие при синдроме Германского-Пудлака, комплекс адаптивного белка-3 и биогенез связанного с лизосомами комплекса органелл-1 (BLOC-1), взаимодействуют и регулируются липидкиназой фосфатидилинозитол-4-киназой типа IIα (PI4KIIα) .Поэтому мы предположили, что PI4KIIα взаимодействует с новыми регуляторами этих комплексов. Чтобы проверить эту гипотезу, мы иммуноаффинно очистили PI4KIIα из меченных изотопами клеточных лизатов для количественной идентификации взаимодействующих веществ. Поразительно, что выделение PI4KIIα предпочтительно кообогащено белками, которые регулируют актиновый цитоскелет, включая факторы обмена гуанина для GTPases семейства Rho, таких как RhoGEF1 и несколько субъединиц комплекса WASH. Мы биохимически подтвердили некоторые из этих взаимодействий PI4KIIα.Важно, что комплекс BLOC-1, комплекс WASH, RhoGEF1 или истощение PI4KIIα изменяют содержание и / или субклеточное распределение BLOC-1-чувствительных грузов PI4KIIα, ATP7A и VAMP7. Мы пришли к выводу, что комплекс синдрома Hermansky-Pudlak BLOC-1 и его груз PI4KIIα взаимодействуют с регуляторами актинового цитоскелета.

ВВЕДЕНИЕ

Везикулярный транспорт — это общий клеточный механизм, с помощью которого органеллы секреторного и эндоцитарного путей избирательно обмениваются компонентами.Этот механизм обмена требует скоординированных шагов, которые включают сортировку и концентрацию груза мембранных белков в формирующихся пузырьках, деформацию и расслоение мембран, направленное движение через цитозоль и слияние в органелле-мишени (Bonifacino and Glick, 2004). Многие из этих шагов требуют механической силы, которая генерируется в путях передачи пузырьков за счет объединения специализированных молекулярных машин. Эти молекулярные машины включают белки оболочки, которые сортируют груз мембранных белков, белки BAR-домена, чтобы ощущать или вызывать деформацию мембраны, динамин GTPase для разрыва мембраны, а также связки и растворимые комплексы рецептора белка прикрепления (SNARE), чувствительного к N -этилмалеимиду (SNARE), для слияние мембран (Kaksonen et al., 2005; Шмид и МакМахон, 2007; МакМахон и Букро, 2011 г .; Викнер и Шекман, 2008; Brocker et al. , 2010; Тейлор и др. , 2011). В то время как некоторые из этих машин по своей природе способны генерировать силы, например, динамин и комплексы слияния SNARE (Schmid and Frolov, 2011; Ferguson and De Camilli, 2012; Gao et al. , 2012), другие требуют ассоциации с актином или цитоскелет микротрубочек. Например, белки оболочки сортируют груз мембранных белков на возникающие везикулы.В дополнение, однако, некоторые белки оболочки также связывают цитоскелетные компоненты как для биогенеза везикул, так и для направленного движения (Nakagawa et al. , 2000; Styers et al. , 2004; Kaksonen et al. , 2006; Delevoye et al. др. , 2009; Anitei и др. , 2010; Anitei and Hoflack, 2012; Mooren и др. , 2012).

Фундаментальный вопрос без ответа касается степени, в которой это цитоскелетное взаимодействие является общим принципом функции белков оболочки.Одним из наиболее хорошо охарактеризованных взаимодействий между аппаратом доставки пузырьков и цитоскелетом является образование пузырьков на плазматической мембране с помощью клатриновой и адапторной оболочки AP-2. В этом пути биогенеза везикул факторы, связанные с оболочкой и оболочкой, такие как белки BAR-домена, локально регулируют полимеризацию и организацию актиновых филаментов. Полимеризация актина в значительной степени зарождается комплексом Arp2 / 3 и его активатором, фактором, способствующим нуклеации, нервным белком синдрома Вискотта – Олдрича (N-WASP; Conner and Schmid, 2003; Kaksonen et al., 2005, 2006; Шмид и МакМахон, 2007; МакМахон и Букро, 2011 г .; Тейлор и др. , 2011 г .; Mooren et al. , 2012). Недавняя идентификация фактора, способствующего зародышеобразованию, который специфически локализуется в эндосомах, гомологе WASP и SCAR (WASH; Derivery et al. , 2009; Gomez and Billadeau, 2009), предполагает, что ассоциация оболочки с актиновым цитоскелетом может быть общий принцип, действующий в генерации пузырьков. Подтверждая эту возможность, истощение WASH приводит к функциональным дефектам рециклинга, путей переноса от эндосомы к Гольджи и от эндосомы к лизосомам (Derivery et al., 2009 г .; Гомес и Билладо, 2009; Gomez et al. , 2012 г .; Дуле и Велч, 2010; Carnell et al. , 2011 г .; Zech et al. , 2011 г .; Harbour et al. , 2012 г .; Hao et al. , 2013; Piotrowski et al. , 2013). Однако на сегодняшний день описано, что WASH взаимодействует только с одним комплексом эндосомной оболочки, ретромерным комплексом, который в первую очередь сортирует грузы по пути от эндосомы к Гольджи (Gomez and Billadeau, 2009; Gomez et al., 2012 г .; Harbour et al. , 2012 г .; Jia et al. , 2012 г .; Моряк, 2012 г .; Hao et al. , 2013; Helfer et al. , 2013). Следовательно, координируется ли эндосомная оболочка с актиновым цитоскелетом в качестве общего принципа, не было проверено.

Мы предоставляем доказательства, подтверждающие эту гипотезу, путем беспристрастной идентификации взаимодействия между комплексом WASH и сортировочными комплексами, связанными с синдромом Германского – Пудлака. Этот синдром генетически определяется дефектами четырех молекулярных комплексов: оболочки адапторного белкового комплекса-3 (AP-3) и биогенеза связанных с лизосомами комплексов органелл от -1 до -3 (BLOC-1 до BLOC-3).Кроме того, генетические дефекты в специфических Rabs и регуляторных ферментах запускают фенотипы, подобные синдрому Hermansky-Pudlak (Bultema and Di Pietro, 2013). Дефекты этих комплексов у млекопитающих и беспозвоночных приводят к гипопигментации, дисфункции тромбоцитов, фиброзу легких и, в некоторых случаях, иммунной дисфункции и неврологическим фенотипам (Newell-Litwa et al. , 2007; Raposo and Marks, 2007; Raposo и др. , 2007; Huizing и др. , 2008; Dell’Angelica, 2009; Wei and Li, 2013).Эти фенотипы являются следствием нарушенного переноса грузов между ранними эндосомами и органеллами-мишенями, такими как связанные с лизосомами органеллы и синаптические пузырьки (Newell-Litwa et al. , 2007; Raposo and Marks, 2007; Raposo et al. , 2007). ; Huizing и др. , 2008; Dell’Angelica, 2009; Wei and Li, 2013). Следовательно, изучение молекул и функциональных механизмов этих комплексов расширяет наше понимание молекулярных основ синдрома Hermansky-Pudlak и позволяет нам проверить фундаментальные вопросы, касающиеся принципов процессов везикулярного транспорта.

Чтобы идентифицировать функциональные механизмы комплексов, связанных с синдромом Германского-Пудлака, мы сосредотачиваемся на прикрепленной к мембране и локализованной в эндосомах липидкиназе, фосфатидилинозитол-4-киназе типа IIα (PI4KIIα; Balla et al. , 2002; Guo ). и др. , 2003; Миноуг и др. , 2006; Крейдж и др. , 2008). Биохимические и генетические данные показывают, что PI4KIIα регулирует и связывает два комплекса, мутировавших при синдроме Германского-Пудлака, AP-3 и BLOC-1 (Craige et al., 2008 г .; Salazar et al. , 2009 г .; Larimore et al. , 2011 г .; Gokhale et al. , 2012а). Поэтому мы предположили, что PI4KIIα будет взаимодействовать с новыми белками, модулирующими функцию BLOC-1 и AP-3. Чтобы проверить эту гипотезу, мы выделили PI4KIIα и его интеракторы путем количественной иммуноаффинной очистки из лизатов поперечно-сшитых клеток in vivo. PI4KIIα предпочтительно коизолирован с белками, которые регулируют полимеризацию актинового цитоскелета, включая комплекс WASH и RhoGEF1.Истощение PI4KIIα, субъединиц BLOC-1, RhoGEF1 или комплекса WASH изменяет содержание других компонентов во взаимодействии PI4KIIα, тем самым устанавливая генетические взаимодействия в дополнение к физическим взаимодействиям. Кроме того, истощение комплекса WASH привело к изменениям в морфологии эндосомы PI4KIIα и неправильной локализации двух грузов BLOC-1, переносчика меди болезни Менкеса ATP7A и лизосомного SNARE, VAMP7. Мы предполагаем, что различные оболочки, такие как clathrin-AP-2, retromer и AP-3-BLOC-1, используют общие принципы для накопления силы или создания дискретных мембранных доменов с помощью локализованной сборки актинового полимера.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Интерактом PI4KIIα обогащает актин-регуляторные белки

PI4KIIα связывает комплексы AP-3 и BLOC-1, и эти взаимодействия регулируют его внутриклеточное распределение (Craige et al. , 2008; Salazar et al. ). , 2009; Ларимор и др. , 2011; Гохале и др. , 2012a). Кроме того, липидкиназная активность PI4KIIα регулирует рекрутирование комплекса оболочки AP-3 и BLOC-1 на эндосомные мембраны (Craige et al., 2008 г .; Salazar et al. , 2009 г.). Поэтому мы предположили, что интеракторы PI4KIIα являются ранее неизвестными регуляторами комплексов AP-3 и BLOC-1, ассоциированных с синдромом Hermansky-Pudlak. Мы проверили эту гипотезу путем выделения эндогенного PI4KIIα и взаимодействующих белков. Чтобы изолировать PI4KIIα, мы продуцировали антитело к пептиду, содержащему мотив сортировки дилейцина, который необходим для взаимодействия PI4KIIα с комплексами AP-3 и BLOC-1 (дополнительный рисунок S1A; Craige et al., 2008 г.). Мутация мотива сортировки дилейцина отменяет распознавание PI4KIIα этим антителом с помощью иммуноблоттинга (дополнительный рисунок S1A). Поэтому мы предположили, что это антитело будет конкурировать с AP-3 за связывание с PI4KIIα и, таким образом, предпочтительно обогащать PI4KIIα, который не связывается с AP-3. Эта стратегия дизайна позволила обогатить PI4KIIα-взаимодействующие белки, которые находятся выше или ниже связывания AP-3. Установив, что это антитело специфически распознает PI4KIIα, мы иммунопреципитировали PI4KIIα из лизатов клеток нейробластомы с минимальными поперечными связями SHSY-5Y (дополнительный рисунок S1A и).Как мы подробно охарактеризовали, эта стратегия перекрестного сшивания: 1) стабилизирует белковые взаимодействия, что позволяет применять строгие стратегии биохимической изоляции, как описано ниже; 2) использует проницаемый для клеток и химически восстанавливаемый сшивающий агент, дитиобис сукцинимидилпропионат (DSP; Lomant and Fairbanks, 1976), который позволяет сшивание in vivo, но поддается идентификации белков с помощью масс-спектрометрии и иммуноблоттинга; и 3) ненасыщает, чтобы минимизировать стабилизацию неродственных белковых комплексов (Salazar et al., 2009 г .; Zlatic et al. , 2010; Gokhale et al. , 2012а, б; Perez-Cornejo et al. , 2012). Окрашивание серебром иммунопреципитированных белковых комплексов выявило несколько полипептидов, которые коизолируются с PI4KIIα (, дорожка 5). Как и ожидалось, некоторые из этих коизолированных полипептидов не были обнаружены в контрольных реакциях, где избыток антигенного пептида PI4KIIα превосходил эндогенный белок за связывание с иммунопреципитационным антителом (полоса 4). Однако при элюировании белковых комплексов из шариков, покрытых антителами, буфером для образца Лэммли высвобождались фоновые полипептиды, которые препятствовали идентификации PI4KIIα и взаимодействующих белков с помощью окрашивания серебром (дорожки 3–5).По этой причине мы элюировали белковые комплексы после иммунопреципитации путем инкубации промытых шариков с избытком антигенного пептида PI4KIIα (, дорожка 7). Эта стратегия иммуноаффинной очистки значительно снизила фоновые контаминанты и иммуноглобулины, что было выявлено окрашиванием серебром и иммуноблоттингом (сравните дорожки 4 и 5 с дорожками 6 и 7). Наконец, иммуноблоттинг продемонстрировал, что наш подход к иммуноаффинной очистке высоко обогащен PI4KIIα (сравните дорожки 2 и 7).

Интерактом PI4KIIα обогащает регулирующие актин белки.(A) PI4KIIα был иммуноаффинно очищен из гомогенатов клеток нейробластомы SHSY-5Y, поперечно сшитых с помощью DSP. PI4KIIα и соизолирующие белки разделяли с помощью SDS-PAGE и окрашивали серебром (дорожка 5). Некоторые полипептиды отсутствуют в контролях, которые включают покрытые антителом шарики без лизата (дорожка 3) или инкубации, в которые был включен избыток антигенного пептида PI4KIIα (дорожка 4). Элюцию гранул проводили буфером для образцов Лэммли (дорожки 3–5). Дорожки 6 и 7 изображают элюаты антигенных пептидов из шариков, аналогичные таковым в дорожках 4 и 5.Иммуноаффинная очистка позволила селективно элюировать коизолирующие белки PI4KIIα на низком фоне (сравните дорожки 6 и 7; дорожки 6 ‘и 7’ отображают полосы 6 и 7 с усиленным контрастом). Стрелкой отмечена полоса, содержащая PI4KIIα. Серебряное пятно представляет собой репрезентативное изображение двух независимых экспериментов. Внизу, иммуноблот PI4KIIα в параллельном наборе анализов, как и в SDS-PAGE, окрашенном серебром. Цепи иммуноглобулина G отмечены звездочками. Ввод составляет 1 и 0,33% для иммунопреципитации и иммуноаффинной очистки соответственно.(B) Графики представляют PI4KIIα и очищающие белки (подробности см. В дополнительной таблице S1). Оси x и y показывают кратность обогащения SILAC и общее количество спектральных отсчетов, используемых для идентификации белка, соответственно. Контрольные точки выделяют PI4KIIα (зеленый) и Nedd4-1. (C) Бирюзовые и красные точки выделяют связанные с актином белки, коизолированные с PI4KIIα. К ним относятся коэффициенты обмена ВВП RhoGEF1, DOCK7 и GEF-h2. Красные точки указывают на связанные с актином белки, которые являются субъединицами или взаимодействующими элементами комплекса WASH: струмпеллин (KIAA0196), SWIP (KIAA1033), Fam21B, FKBP15, кэпирующий белок α и кэпирующий белок β.(D) Синие точки выделяют белки, связанные с переносом через мембрану, коизолированные с PI4KIIα, включая тяжелую цепь клатрина (CLTC), динамин-2 (DNM2) и субъединицу β3A комплекса AP-3 (AP3B1). (E) Анализ функциональных аннотаций идентифицированных белков с использованием аннотаций Gene Ontology выявил преобладание белков, связанных с актином. Обогащение таких категорий, как цитоскелет (30/124 интеракторов) и актиновый цитоскелет (13/124), было значительным при p = 1,62 × 10 ⁻⁷ и 7.67 × 10 ⁻⁷ соответственно. См. Дополнительную информацию в таблице S2. (F) Сетевой анализ предполагаемых компонентов взаимодействия PI4KIIα и субъединиц BLOC-1. PI4KIIα (зеленый), субъединицы BLOC-1 (синий) и субъединицы комплекса WASH (красный) выделены.

Аналитически установив селективный подход к выделению PI4KIIα и взаимодействующих белков, мы выполнили препаративную иммуноаффинную очистку сшитых комплексов PI4KIIα. Мы идентифицировали интеракторы с помощью количественной масс-спектрометрии с использованием мечения стабильных изотопов аминокислотами в культуре клеток (SILAC; Ong et al., 2002; Манн, 2006). Клетки нейробластомы SHSY-5Y выращивали до равновесия либо в среде с легкой меткой, в которой аминокислоты аргинин и лизин содержат изотопы ¹² C и ¹⁴ N (среда R0K0), либо в среде с тяжелой меткой, в которой эти аминокислоты содержат ¹³ C и ¹⁵ N (среда R10K8; дополнительный рисунок S1B). После включения этих изотопных меток аминокислот, PI4KIIα иммунопреципитировали из лизатов меченных светом клеток. В качестве контроля иммунопреципитацию из лизатов меченых тяжелых клеток проводили в присутствии избытка антигенного пептида PI4KIIα (дополнительный рисунок S1B).Как описано ранее, оба образца затем конкурентно элюировали из шариков с избытком антигенного пептида PI4KIIα. Элюированные полипептиды, меченные легкой и тяжелой меткой, смешивали в соотношении 1: 1 для тандемного масс-спектрометрического анализа. Эта очистка позволила обогатить PI4KIIα примерно в 55 раз, и его относительное содержание было представлено 220 спектральными отсчетами (, зеленая точка). Кроме того, мы идентифицировали 701 соизолирующий белок с двумя или более уникальными пептидами. Из общего количества 702 белков 268 были обогащены иммуноаффинной очисткой PI4KIIα более чем в два раза по сравнению с контролем, пороговое значение SILAC, которое мы ранее продемонстрировали, обогащает взаимодействия, которые могут быть подтверждены генетически (Gokhale et al., 2012а, б; Perez-Cornejo et al. , 2012). Однако одним известным ограничением очистки на основе гранул является тенденция белков неспецифически связываться с гранулами, покрытыми антителами (Trinkle-Mulcahy et al. , 2008). Чтобы преодолеть это ограничение, мы отфильтровали любые полипептиды, которые неспецифически связываются либо только с гранулами, либо с гранулами, покрытыми неродственными антителами. Применение этих фильтров позволило идентифицировать 123 соизолирующих белка в дополнение к PI4KIIα для дальнейшего изучения (и дополнительную таблицу S1).

Мы сначала охарактеризовали интерактом PI4KIIα, выполнив функциональный анализ аннотаций 124 идентифицированных белков с использованием аннотаций Gene Ontology (). Этот анализ показал, что белки цитоскелета (30/124) и белки цитоскелета актина (13/124) были обогащены во взаимодействии PI4KIIα по сравнению со случайной выборкой генома человека ( p = 1,62 × 10 ⁻⁷ и 7,67 × 10 ⁻⁷ соответственно). Например, связанные с актином белки в интерактоме PI4KIIα включают регуляторные белки для малых GTPases, такие как RhoGEF1 (ARHGEF1), выделитель цитокинеза 7 (DOCK7) и GEF-h2 (ARHGEF2), которые являются факторами обмена гуанина для RhoA, cdc42. , и Rho-Rac GTPases, соответственно (, бирюзовые точки; Rossman et al., 2005; Birkenfeld et al. , 2008 г .; Blasius et al. , 2009 г .; Aittaleb et al. , 2010). Кроме того, анализ функциональной аннотации показал очень значительное обогащение белков, обозначенных как «транспортные белки, опосредованные везикулами» (13/124), как и было предсказано, учитывая роль PI4KIIα в регуляции AP-3-зависимого биогенеза везикул (; p ). = 1,19 × 10 ⁻³ ; Дополнительная таблица S2). Эти опосредованные везикулами транспортные белки включают тяжелую цепь клатрина, субъединицу β комплекса AP-3 (AP3B1) и динамин-2 (DYN-2;, синие точки).В дополнение к функциональной аннотации мы выполнили сетевой анализ для выявления ранее опубликованных прямых взаимодействий между этими очищающимися белками. Наша цель состояла в том, чтобы идентифицировать функциональные субкомплексы и хабы с высокой связностью с сетями, которые совместно очищаются с PI4KIIα и могут играть роль в AP-3- и BLOC-1-опосредованном биогенезе везикул (; Gokhale et al. , 2012b). По этой причине мы включили в этот анализ восемь субъединиц комплекса BLOC-1. Сетевой анализ выявил присутствие трех из пяти субъединиц комплекса WASH (FAM21B, KIAA0196 и KIAA1033) и трех известных взаимодействующих элементов комплекса WASH (FKBP15, CAPZA1 и CAPZB; красные точки; Campellone and Welch, 2010; Jia et al., 2010; Rottner et al. , 2010; Rotty et al. , 2012). Комплекс WASH локализуется в ранних эндосомах, где, как предполагается, он полимеризует актин для сортировки груза или расщепления везикул, подтверждая роль комплекса WASH в PI4KIIα-регулируемом, BLOC-1-опосредованном биогенезе везикул.

Биохимическое и генетическое подтверждение PI4KIIα-взаимодействующих белков

Мы подтвердили взаимодействия PI4KIIα, идентифицированные с помощью масс-спектрометрии SILAC, путем независимой иммуноаффинной очистки PI4KIIα с последующим иммуноблоттингом для проверки наличия представляющих интерес белков.Мы обнаружили, что PI4KIIα взаимодействует с опосредованными пузырьками транспортными белками, такими как тяжелая цепь клатрина и субъединица паллидина BLOC-1 (дорожки 6 и 7). Взаимодействующие белки были обнаружены только в изоляциях PI4KIIα, но не в контроле, где избыток антигенного пептида использовался, чтобы противостоять иммунопреципитации комплексов PI4KIIα (дорожки 4 и 5). В соответствии с нашими предыдущими сообщениями, обнаружение взаимодействий между PI4KIIα и транспортными белками, опосредованными пузырьками, требует лечения с помощью кросс-линкерного DSP, предположительно потому, что эти ассоциации лабильны и / или временны.Кроме того, мы обнаружили, что PI4KIIα взаимодействует с двумя известными взаимодействующими элементами комплексов BLOC-1 и AP-3 соответственно — антиоксидантным ферментом пероксиредоксин-1 (Prdx-1) и убиквитинлигазой Nedd4-1 (Mossinger et al. , 2012;, дорожки 6 и 7; также см. Салазар и др. , 2009; Гохале и др. , 2012a). Nedd4-1 представляет нижние границы наших порогов значимости с точки зрения спектрального счета и пороговых значений обогащения для нашей количественной оценки SILAC, тем самым подтверждая, что эти пороги минимизируют включение ложноотрицательных результатов в интерактивный PI4KIIα (три спектральных счета, 3.69-кратное обогащение; ). Наконец, мы проверили взаимодействие между PI4KIIα и белками, которые регулируют актиновый цитоскелет, поскольку функциональная аннотация и сетевой анализ показали, что эти взаимодействия были очень значимыми. Мы подтвердили взаимодействие между PI4KIIα и субъединицей струмпеллина комплекса WASH и двумя факторами обмена гуанина для малых GTPases RhoGEF1 и Dock7. Следует отметить, что эти соурификации не требовали перекрестного линкера DSP, что позволяет предположить, что PI4KIIα взаимодействует с этими белками либо с более высоким сродством, либо с более длительным периодом полужизни, чем с белками, связанными с переносом через мембрану (дорожки 6 и 7).Чтобы дополнительно проверить специфичность этих взаимодействий, мы выделили PI4KIIα, помеченный гемагглютинином (HA), из клеток HEK293T путем иммунопреципитации HA. Мы подтвердили присутствие RhoGEF1 в этих белковых комплексах, демонстрируя, что эти взаимодействия могут быть обнаружены независимо от стратегии очистки (, дорожка 3). Взятые вместе, эти результаты указывают на то, что интерактом PI4KIIα обогащает белки, аннотация генной онтологии которых существенно вовлекает их в функцию актина.

Биохимическое подтверждение белков, взаимодействующих с PI4KIIα.(A) PI4KIIα был иммуноаффинно очищен из неперекрестно-сшитых (нечетные дорожки) и DSP-перекрестно-сшитых (четные дорожки) экстрактов растворимых в детергенте клеток нейробластомы SHSY-5Y. Иммунные комплексы были разделены с помощью SDS-PAGE и проанализированы с помощью иммуноблоттинга с антителами против PI4KIIα, тяжелой цепи клатрина (CHC), паллидина, пероксиредоксина-1 (Prdx-1), RhoGEF1, Dock7 и субъединицы комплекса WASH strumpellin и Nedd4-1. Коизолирующие белки не были обнаружены в контрольных реакциях, где был включен избыток антигенного пептида PI4KIIα, чтобы победить эндогенный PI4KIIα (дорожки 4 и 5).Дорожка 3 показывает покрытые антителом шарики, инкубированные в отсутствие клеточного лизата. Входы составляют 0,25%. (B) Клетки HEK293T, временно экспрессирующие HA-меченый PI4KIIα, были DSP-сшиты (дорожки 3 и 4), а растворимые в детергенте экстракты были иммунопреципитированы антителами HA. Иммунные комплексы были разделены с помощью SDS-PAGE и проанализированы с помощью иммуноблоттинга с указанными антителами. RhoGEF1 присутствует в иммунопреципитации НА (дорожка 3), но не в контрольных пептидах вне конкуренции (дорожка 4). Дорожка 2 показывает покрытые антителом шарики, инкубированные в отсутствие клеточного лизата.Входные данные составляют 0,5%, и n = 3. (C, D) Клетки SHSY-5Y, стабильно экспрессирующие помеченную FLAG субъединицу комплекса BLOC-1 (дисбиндин), инкубировали в отсутствие (D, дорожки 1, 4, и 6) или присутствие (C, все дорожки и D, дорожки 2, 5 и 7) сшивающего агента DSP, и растворимые в детергенте экстракты иммунопреципитировали антителами против PI4KIIα (C) или эпитопа FLAG (D). Иммунные комплексы были разделены с помощью SDS-PAGE и проанализированы с помощью иммуноблоттинга с антителами против указанных белков, идентифицированных в интерактоме PI4KIIα.Также включены два груза мембранных белков BLOC-1, v-SNARE VAMP7 и переносчик меди болезни Менкеса ATP7A. Как и в случае A и B, контролями являются антигенные пептиды вне конкуренции (C, дорожка 4 и D, дорожки 6 и 7). Дорожки C2 и D3 показывают покрытые антителом шарики, инкубированные в отсутствие клеточного лизата. Входы составляют 0,5%.

Наш сетевой анализ интерактома PI4KIIα и субъединиц BLOC-1 предположил связи между PI4KIIα-взаимодействующими белками и субъединицами BLOC-1 (). Более того, BLOC-1 регулирует субклеточную локализацию PI4KIIα (Larimore et al., 2011). По этим причинам мы предсказали, что эти ранее нераспознанные связанные с актином взаимодействующие элементы PI4KIIα будут совместно изолироваться с BLOC-1. Чтобы проверить это предсказание, мы использовали линию клеток SHSY-5Y, которая стабильно экспрессирует помеченную FLAG субъединицу дисбиндина BLOC-1. Эта помеченная субъединица включается в функциональные комплексы BLOC-1 (Larimore et al. , 2011; Gokhale et al. , 2012a). Во-первых, мы подтвердили, что эта субъединица BLOC-1 может быть обнаружена при иммуноаффинной очистке PI4KIIα (дорожка 3).Затем мы проверили, будут ли взаимодействовать PI4KIIα в белковых комплексах BLOC-1, выделенных с помощью иммуноаффинной очистки FLAG (дорожки 4 и 5). Как сообщалось ранее, PI4KIIα может быть обнаружен этим методом (дорожка 5; Larimore et al. , 2011). Кроме того, два взаимодействующих элемента PI4KIIα, RhoGEF1 и комплексная субъединица WASH струмпеллин, коизолируются с комплексами BLOC-1 (, дорожка 5). Кроме того, мы также обнаружили присутствие двух известных грузов BLOC-1, переносчика меди болезни Менкеса ATP7A и лизосомного SNARE VAMP7 (Salazar et al., 2006; Setty et al. , 2008 г .; Newell-Litwa et al. , 2009, 2010). Эти взаимодействия не были обнаружены в контролях, в которых избыток пептида FLAG был включен в реакцию, чтобы превзойти FLAG-дисбиндин за связывание с антителом для иммунопреципитации (сравните дорожки 5 и 7). Наши результаты показывают, что выделение белковых комплексов PI4KIIα или BLOC-1 надежно копуризует актин-регуляторный аппарат. Совместная очистка субъединиц PI4KIIα, strumpellin, RhoGEF1 и BLOC-1 указывает на то, что эти белки могут действовать согласованно, чтобы регулировать BLOC-1-зависимый трафик.

Мутация или истощение субъединицы комплекса мембранного транспорта обычно коррелирует с понижающей регуляцией других субъединиц комплекса и с изменениями общего клеточного содержания грузов пути и связанных факторов (Peden et al. , 2002; Kantheti et al. , 2003; Li и др. , 2003; Starcevic and Dell’Angelica, 2004; Jia и др. , 2010). Мы использовали этот принцип для независимого тестирования компонентов интерактома PI4KIIα. Мы предсказали, что пертурбация либо PI4KIIα, либо BLOC-1 будет влиять на содержание компонентов взаимодействия PI4KIIα, если эти белки являются регуляторами BLOC-1-зависимого пути биогенеза везикул.PI4KIIα и две субъединицы BLOC-1, приглушенная и паллидин, были независимо истощены короткой шпильчатой ​​РНК (shRNA) в клетках HEK293T (). Полуколичественный анализ иммуноблоттинга показал, что истощение PI4KIIα активировало содержание RhoGEF1, а также субъединиц AP-3 и BLOC-1. Последнее наблюдение согласуется с существованием трехкомпонентного комплекса между PI4KIIα, AP-3 и BLOC-1 (Salazar et al. , 2009;). Эти отношения между компонентами интерактома PI4KIIα также наблюдались после истощения комплекса BLOC-1 ().Общее клеточное содержание субъединиц PI4KIIα, RhoGEF1 и BLOC-1 было значительно снижено в ответ на истощение либо приглушенного, либо паллидина (). Затем мы проанализировали содержание двух хорошо охарактеризованных грузов BLOC-1, лизосомного SNARE, VAMP7 и переносчика меди, мутировавшего при болезни Менкеса, ATP7A (OMIM 309400; Salazar et al. , 2006; Setty et al. ). , 2008; Newell-Litwa и др. , 2009, 2010). Общее клеточное содержание обоих этих грузов было значительно снижено в BLOC-1-истощенных клетках, но не в PI4KIIα-истощенных клетках (Mann-Whitney U test p <0.05; , красные ящики). Нормальное содержание VAMP7 и ATP7A в клетках, истощенных по PI4KIIα, предполагает, что повышающая регуляция субъединиц комплекса BLOC-1 может быть компенсаторной.

Генетическое подтверждение белков, взаимодействующих с PI4KIIα. (A, D) Клетки HEK293T обрабатывали контрольной siRNA scramble или siRNA, нацеленной на PI4KIIα. (B, D) Клетки HEK293T обрабатывали лентивирусами, несущими контрольную шРНК скремблирования или шРНК, нацеленную на паллидин или приглушенные субъединицы комплекса BLOC-1. (C, E) Клетки меланомы человека MNT-1 обрабатывали лентивирусами, несущими контрольную shRNA scramble или shRNA, нацеленную на субъединицу BLOC-1 паллидин, RhoGEF1 или комплексную субъединицу WASH струмпеллин.Лизаты клеток HEK293T и MNT-1 разделяли с помощью SDS-PAGE, а общее содержание в клетках представляющих интерес белков измеряли с помощью полуколичественного иммуноблоттинга. Коробчатые диаграммы на D и E отображают количественные оценки, где целевой белок выделен синим цветом, а значительно измененные антигены отмечены красным. Затенение серым цветом соответствует 50–100% контроля. Все эксперименты проводили в трех биологических повторностях, по крайней мере, с одним определением на повторность. Все значимые значения p составляют <0,025 и были определены непараметрическим анализом с использованием группового критерия суммы рангов Краскела – Уоллиса с последующим критерием суммы рангов Вилкоксона – Манна – Уитни.Субъединица АР-3 β3A (D) и Hsp90 (D, E) использовали в качестве контроля для сравнений.

Затем мы проверили, влияет ли shRNA-опосредованное истощение BLOC-1, струмпеллина или RhoGEF1 на общее содержание в клетках других компонентов взаимодействия PI4KIIα. Во-первых, мы исследовали последствия истощения BLOC-1 в клеточной линии меланомы MNT-1, типе клеток, в котором локализация BLOC-1 в канальцевых эндосомах была определена на субклеточном уровне с помощью электронной микроскопии (Di Pietro et al., 2006). В соответствии с нашим открытием в клетках HEK293T, общее клеточное содержание PI4KIIα-интерактора RhoGEF1 снижалось в клетках MNT1, лишенных BLOC-1 (). Истощение компонентов интерактома PI4KIIα, RhoGEF1 и струмпеллина, не изменяет общего клеточного содержания субъединиц BLOC-1 (). Однако грузы BLOC-1 VAMP7 и ATP7A были значительно изменены (). Общее клеточное содержание ATP7A увеличивалось в ответ на BLOC-1, RhoGEF1 или истощение струмпеллина в клетках MNT1 (; 2.В 3 ± 0,12–, 2,2 ± 0,46– и 1,6 ± 0,13 раза по сравнению с контролем соответственно). Кроме того, уровни VAMP7 были значительно снижены при истощении BLOC-1, значительно увеличились при истощении RhoGEF1 и не изменились при истощении струмпеллина. Эти данные свидетельствуют о нарушении регуляции стационарных уровней этих грузов BLOC-1 при истощении компонентов взаимодействия PI4KIIα и тем самым устанавливают генетические взаимодействия между компонентами взаимодействия PI4KIIα.

Комплекс WASH и нитчатый актин располагаются на PI4KIIα-положительных ранних эндосомах

Комплекс WASH представляет собой актин-регуляторный комплекс, который локализуется в ранних эндосомах (Derivery et al., 2009 г .; Гомес и Билладо, 2009; Gomez et al. , 2012 г .; Дуле и Велч, 2010; Carnell et al. , 2011 г .; Zech et al. , 2011 г .; Harbour et al. , 2012). Аналогичным образом, PI4KIIα локализуется в ранних эндосомах, где он связывается с BLOC-1 (Balla et al. , 2002; Guo et al. , 2003; Minogue et al. , 2006; Craige et al. , 2008; Салазар и др. , 2009). Таким образом, мы предсказали, что PI4KIIα-положительные эндосомы содержат BLOC-1, комплекс WASH и актин.Чтобы проверить это предсказание, мы сначала отделили эндосомные компартменты от гомогенатов клеток HEK293T с помощью скоростной седиментации сахарозы (Clift-O’Grady et al. , 1998; Lichtenstein et al. , 1998). Как и ожидалось, PI4KIIα соединяется с 35% сахарозой с рецептором трансферрина, эндосомным маркером (). Кроме того, в этих фракциях присутствовали комплексная субъединица WASH струмпеллин, комплексная субъединица BLOC-1 паллидин и актин (). Паллидин и актин преимущественно обнаруживались на вершине градиентов, где осаждаются свободные цитозольные белки (Clift-O’Grady et al., 1998; Lichtenstein et al. , 1998). Присутствие нитевидного актина на PI4KIIα-содержащих эндосомах было подтверждено визуализацией живых клеток флуоресцентно меченного EGFP-PI4KIIα с помощью флуоресцентного зонда LifeAct (; Riedl et al. , 2008). Мы отслеживали флуоресцентно меченые антитела FLAG, связанные с экзофациальной меткой, сконструированной в β2-адренергическом рецепторе (SSF-B2AR;). Мы стимулировали интернализацию комплексов рецептор-FLAG-антитело путем добавления изопротеренола, агониста адренергических рецепторов, для функционального определения ранних эндосом (Puthenveedu et al., 2010). В этих ранних эндосомах разветвленные актиновые сети были обнаружены с помощью cortactin-dsRed (), который был сконцентрирован в основании небольших пальцевидных выступов, обогащенных PI4KIIα. Небольшие количества паллидина и актина, кооседиментирующие и / или колокализующиеся с PI4KIIα и эндосомными маркерами, отражают временный характер этих ассоциаций при анализе в отсутствие кросс-линкерного DSP. Таким образом, мы однозначно идентифицировали, что PI4KIIα и разветвленный актин совместно локализуются в функционально определенных ранних эндосомах.

PI4KIIα, комплексная субъединица WASH струмпеллин и актиновые компоненты цитоскелета на ранних эндосомах. (A, B) Клетки HEK293T были гомогенизированы, и низкоскоростные супернатанты были разделены скоростной седиментацией сахарозы на градиенте сахарозы 10–45%. PI4KIIα и субъединица комплекса WASH струмпеллин ко-седиментируются с 35% сахарозой с эндосомными органеллами, как идентифицировано рецептором трансферрина (TrfR). Цитозольные фракции осаждаются в верхней части градиента (10% сахарозы). (B) Относительное распределение указанных белков для фракционирования, показанного на A.Изображения и профиль распределения представляют два независимых эксперимента. (C) Визуализация живых клеток флуоресцентно меченных PI4KIIα и LifeAct для визуализации нитчатого актина в клетках HEK293T подтвердила присутствие актина в PI4KIIα-положительных органеллах ( n = 12 клеток). (D) Клетки HEK293T, стабильно экспрессирующие PI4KIIα-GFP и сигнальные последовательности FLAG-меченых β2-адренергических рецепторов (SSF-B2AR), временно трансфицировали mCortactin-dsRed и визуализировали через 10 мин после добавления 10 мкМ изопротеренола.Одиночный конфокальный стек был захвачен в трех каналах с интервалом в 1 с. (E) Увеличенное изображение эндосомы, обозначенное стрелкой в ​​A, в течение 10-секундного периода. (F) Схема овального профиля, используемого для создания следов интенсивности флуоресценции вокруг эндосом. (G) Типичный график нормализованной интенсивности флуоресценции для каждого белка в указанной выше эндосоме.

Мы проверили присутствие комплекса WASH в PI4KIIα-положительных эндосомах путем визуализации EGFP-меченных субъединиц комплекса WASH и эндогенного PI4KIIα с помощью деконволюционной микроскопии с высоким разрешением.Wash2-, strumpellin-, SWIP / KIAA1033- и Fam21-EGFP все были тесно связаны с сигналом PI4KIIα (). Эта физическая близость была особенно очевидна в трехмерных проекциях данных z -стека, где субъединицы комплекса WASH, по-видимому, оборачиваются вокруг органелл, содержащих PI4KIIα (). Мы наблюдали низкую степень перекрытия между сигналами наивысшей интенсивности и, таким образом, измерили совместную локализацию strumpellin-EGFP и Wash2-EGFP с эндогенным PI4KIIα с использованием коэффициента колокализации Пирсона.Коэффициент Пирсона составлял 9,1 ± 2,5 и 13,1 ± 1,9 для strumpellin-EGFP и Wash2-EGFP, соответственно, подтверждая низкую корреляцию интенсивности между перекрывающимися сигналами (). Однако мы проверили специфичность этого рассчитанного коэффициента, повернув один канал на 15 ° и проанализировав совместную локализацию PI4KIIα с митохондриальным зондом MitoTracker. Коэффициент колокализации Пирсона между PI4KIIα и MitoTracker был отрицательным, что отражает полное отсутствие перекрытия этих сигналов ().Это наблюдение было подтверждено, поскольку ротация каналов не изменяла отрицательный коэффициент Пирсона между PI4KIIα и MitoTracker. Напротив, вращение либо strumpellin-EGFP, либо Wash2-EGFP на 15 ° снизило коэффициент Пирсона до значений, неотличимых от значений колокализации MitoTracker ( p ≥ 0,05;). Эти результаты показывают, что комплекс WASH и актиновые филаменты располагаются в субдоменах PI4KIIα-содержащих эндосом. Эти находки подтверждают, что аппарат Wash2-actin способен регулировать транспортировку PI4KIIα и др. Грузов BLOC-1 из ранних эндосом.

PI4KIIα колокализуется с комплексом WASH. (A, C) Клетки HEK293T либо временно трансфицировали EGFP-меченными субъединицами комплекса WASH, либо окрашивали зеленым MitoTracker, фиксировали и обрабатывали для непрямой иммунофлуоресцентной микроскопии. Изображения были получены с помощью деконволюционной микроскопии с высоким разрешением. Показаны проекции стопки z . (B, D) Визуализация изоповерхности стека z , созданная с помощью программного обеспечения Imaris. (E) Расчет коэффициента корреляции Пирсона между интенсивностями сигналов strumpellin-EGFP, WASH-EGFP или MitoTracker и эндогенного PI4KIIα.Корреляция пропадала при повороте одного канала на 15 °. Здесь n = 6 для WASH-EGFP, n = 7 для strumpellin-EGFP и n = 9 для MitoTracker-A488. Статистические сравнения проводились с помощью непараметрического анализа с использованием группового критерия суммы рангов Краскела – Уоллиса с последующими индивидуальными критериями суммы рангов Вилкоксона – Манна – Уитни.

Комплекс WASH модулирует нацеливание на грузы BLOC-1

Истощение комплекса WASH характеризуется появлением увеличенных загруженных грузом канальцев из эндосом и неправильной сортировкой груза (Gomez and Billadeau, 2009; Gomez et al., 2012 г .; Harbour et al. , 2012 г .; Jia et al. , 2012 г .; Моряк, 2012 г .; Helfer et al. , 2013). Поэтому мы предположили, что PI4KIIα присутствует в трубчатых структурах, длина которых регулируется комплексом WASH. Чтобы проверить эту гипотезу, мы экспрессировали PI4KIIα-EGFP в клетках HEK293T, стабильно экспрессирующих FLAG-меченный β2-адренергический рецептор, и визуализировали клетки с помощью микроскопии живых клеток. Эндосомы были однозначно идентифицированы по индуцированной лигандом интернализации флуоресцентных антител FLAG, связанных с экзофациальным доменом β2-адренорецептора.Трубочки, содержащие PI4KIIα и / или β2-адренергический рецептор, выходят из ранних эндосом, и их размер увеличивается в клетках, истощенных комплексом WASH (19). В целом размер ранних эндосом, содержащих PI4KIIα и β2-адренергический рецептор, не зависел от дефицита комплекса WASH (). Напротив, истощение BLOC-1 путем нацеливания shRNA на паллидин характеризовалось увеличением этих ранних эндосом без увеличения канальцев (2). Изменения в архитектуре ранних эндосом, содержащих PI4KIIα и β2-адренергический рецептор, за счет истощения комплексов BLOC-1 или WASH подтверждают модель, в которой комплексы WASH во взаимодействии с BLOC-1 регулируют нацеливание грузов BLOC-1 из ранних эндосом.

Истощение паллидина и струмпеллина изменяет морфологию эндосом. (A) Клетки HEK293T, стабильно экспрессирующие сигнальные последовательности FLAG-меченных β2-адренергических рецепторов (SSF-B2AR) и PI4KIIα-EGFP, трансдуцировали лентивирусами scrambled, pallidin или strumpellin shRNA. Клетки, обедненные паллидином, получали изображение через 8 дней после начала трансдукции, а клетки, истощенные по струмпеллину, отображали через 5 дней после трансдукции. Клетки выращивали в условиях отбора после 2-го дня трансдукции. Все нокдауны сравнивали с параллельной трансдукцией скремблированной кшРНК.Изображения представляют собой максимальные проекции трех конфокальных срезов, снятых с интервалами 0,3 мкм. (B) Частотная гистограмма окружности эндосомы для клеток, обработанных скремблированной (синий) или паллидиновой (красный) shРНК. Вставка слева изображает вероятностный график тех же данных. Значение p , определенное непараметрическим критерием Колмогорова – Смирнова. Здесь n = 150 для контрольных клеток и n = 117 для клеток, обедненных паллидином. (C) Процент клеток, экспрессирующих скремблированную или струмпеллиновую shРНК, отображающих эндосомные канальцы.Отбор клеток выполняли в канале SSF-B2AR и ослепляли на PI4KIIα перед интернализацией антитела FLAG, затем визуализировали через 15 минут после добавления 10 мкМ изопротеренола. Значение p определяли непараметрическим точным критерием Фишера. Здесь n = 112 для контрольных клеток и n = 101 для клеток, обедненных паллидином.

Мы предсказали, что дефицит комплекса WASH изменит субклеточное распределение грузов BLOC-1, если эти комплексы действуют по одному и тому же пути.Чтобы проверить это предсказание, мы обработали клетки меланомы MNT1 кшРНК, нацеленной на субъединицу струмпеллина комплекса WASH или контроль скремблирования. Мы оценили уровень на клеточной поверхности двух грузов BLOC-1: переносчика меди Менкеса ATP7A и лизосомного белка SNARE VAMP7 (Salazar et al. , 2006; Setty et al. , 2008; Newell-Litwa et al. , 2009, 2010). Как описано ранее, мы наблюдали увеличение общего клеточного содержания ATP7A в ~ 1,5 раза при истощении комплекса WASH (дорожки 1–4).Однако уровни ATP7A на клеточной поверхности увеличиваются в 3,3 ± 0,8 раза при истощении комплекса WASH (дорожки 5 и 6; среднее значение ± SEM). Сходным образом уровни VAMP7 на клеточной поверхности увеличивались в 2,5 ± 0,6 раза при истощении комплекса WASH по сравнению с контролем, тогда как общие клеточные уровни VAMP7 были умеренно, но незначительно затронуты (полосы 5 и 6 и). Это увеличение клеточной поверхности было специфическим для грузов BLOC-1, а не глобальных возмущений, так как общее клеточное содержание и уровни рецептора трансферрина на клеточной поверхности не были затронуты в клетках, истощенных комплексом WASH ().Более того, окрашивание серебром общего биотинилированного белка клеточной поверхности не показало глобального увеличения белков клеточной поверхности из-за истощения комплекса WASH (). Таким образом, грузы BLOC-1 не попадают на поверхность клетки при истощении комплекса WASH. Эти данные подтверждают модель, в которой комплексы WASH изменяют движение грузов BLOC-1.

Истощение комплекса WASH изменяет субклеточное распределение грузов BLOC-1. (A) Клетки меланомы MNT1 обрабатывали кшРНК, направленной против субъединицы струмпеллина комплекса WASH или контроля скремблирования.Белки клеточной поверхности метили поверхностным биотинилированием и выделяли стрептавидиновыми шариками. Репрезентативные иммуноблоты показывают увеличение поверхностного содержания ATP7A и Vamp7, двух грузов BLOC-1, в истощении комплекса WASH. (B) Рецептор трансферрина (TrfR) измеряли в качестве контроля. Окрашивание выделенных белков серебром не выявило глобального снижения содержания белков на клеточной поверхности (сравните дорожки 5 и 6). (C) Количественная оценка поверхностной экспрессии представляющих интерес белков при истощении комплекса WASH по сравнению с контролем скремблирования.Данные являются средними ± SEM. Мы обнаружили значительное увеличение грузов ATP7A и Vamp7 в BLOC-1 в 3,3 ± 0,8 раза и 2,5 ± 0,6 раза, соответственно. Рецептор трансферрина существенно не изменился. Значение p определяли с помощью непараметрического критерия суммы рангов Вилкоксона – Манна – Уитни. Всего было n = 8 определений из четырех независимых экспериментов.

ОБСУЖДЕНИЕ

В этом исследовании мы идентифицировали ранее нераспознанные компоненты пути сортировки мембранных белков, затронутые при синдроме Hermansky – Pudlak, путем выделения заякоренной в мембране липидкиназы PI4KIIα.PI4KIIα связывает и регулирует два комплекса, мутировавших при синдроме Германского-Пудлака, комплексы AP-3 и BLOC-1, посредством мотива сортировки дилейцина и его киназной активности (Craige et al. , 2008; Salazar et al. , 2009; Ларимор и др. , 2011; Гохале и др. , 2012a). Мы поэтому предположили, что PI4KIIα взаимодействует с нераспознанными компонентами пути транспорта везикул, требующих комплекса BLOC-1 – AP-3 – PI4KIIα. PI4KIIα может взаимодействовать с этими компонентами либо одновременно со связыванием с AP-3 и BLOC-1, и / или на стадиях, предшествующих или следующих за связыванием с этими комплексами.Поэтому мы разработали стратегию для обогащения взаимодействующих PI4KIIα перед и после события распознавания мотива сортировки дилейцина PI4KIIα. Для достижения этой цели мы получили антитело против пептида из 20 остатков PI4KIIα, который содержит сортирующий мотив ERQPLL. Мутации этого мотива в ERQPAA достаточно для предотвращения распознавания PI4KIIα этим антителом при иммуноблоттинге. Хотя мотив ERQPLL присутствует в пяти других белках, кодируемых в геноме человека, ни один из этих белков не обогащен во взаимодействии PI4KIIα, что гарантирует, что это антитело специфически распознает PI4KIIα (www.mrc-lmb.cam.ac.uk/genomes/madanm/harvey/). Мы использовали это антитело для иммуноаффинной очистки PI4KIIα из меченных изотопами клеточных лизатов (SILAC), что позволило количественно идентифицировать взаимодействующие белки по сравнению с неспецифическими загрязнителями и иммуноглобулинами (Ong et al. , 2002; Mann, 2006; Zlatic et al. , 2010; Гохале и др. , 2012a). Поразительно, что выделение PI4KIIα предпочтительно кообогащено белками, которые регулируют актиновый цитоскелет, включая факторы обмена гуанина для GTPases семейства Rho, RhoGEF1, DOCK7 и GEF-h2, а также нескольких субъединиц комплекса WASH.Кроме того, PI4KIIα соизолирован с мембранными белками, такими как тяжелая цепь клатрина и субъединица β3A комплекса AP-3. Эти комплексы, транспортирующие через мембрану, коизолированы с PI4KIIα при более низкой стехиометрии по сравнению с регуляторами актина, как и предполагалось в нашей стратегии выделения. Мы биохимически подтвердили некоторые из этих взаимодействий PI4KIIα. Кроме того, мы предсказали, что если компоненты взаимодействия PI4KIIα будут взаимодействовать, то нарушение этих белков изменит общее содержание в клетке других компонентов взаимодействия.Исходя из этого руководящего обоснования, мы установили, что генетическое истощение самого PI4KIIα, комплекса BLOC-1, RhoGEF1 или комплекса WASH изменяет общее клеточное содержание либо компонентов взаимодействия PI4KIIα, либо грузов BLOC-1, переносчика меди болезни Менкеса ATP7A и лизосомный SNARE VAMP7 (Salazar et al. , 2006; Setty et al. , 2008; Newell-Litwa et al. , 2009, 2010). Мы пришли к выводу, что эти новые интеракторы PI4KIIα биохимически и генетически взаимодействуют с компонентами актинового цитоскелета.Мы предпочитаем модель, в которой грузы мембранных белков сортируются с помощью BLOC-1-зависимого механизма в трубчатые носители, размер которых контролируется комплексом WASH, возможно, за счет генерирования силы для разрыва мембраны.

Мы сосредоточили наши усилия на описании последствий этих взаимодействий для комплекса WASH. Wash2 представляет собой фактор, способствующий зародышеобразованию I типа, который связывает комплекс Arp2 / 3 для локального зародышеобразования и организации полимеризации разветвленных актиновых филаментов (Derivery et al., 2009 г .; Jia et al. , 2010; Велтман и Инсолл, 2010; Rotty et al. , 2012). Комплекс WASH локализуется в трубчатых доменах ранних эндосом, где предполагается, что полимеризация актина создает локализованные мембранные домены для сортировки грузов и / или регулирует морфологию канальцев путем рассечения мембраны (Gomez and Billadeau, 2009; Gomez et al. , 2012; Duleh и Welch, 2010, 2012; Harbour и др., , 2012; Helfer, и др., , 2013). Наша работа идентифицирует комплекс WASH как ранее неизвестный интерактор BLOC-1 и PI4KIIα.Это утверждение основано на следующих выводах и обосновании. Мы обнаружили, что субъединицы комплекса WASH локализуются в органеллах, содержащих PI4KIIα, и соосаждены с субъединицами комплекса BLOC-1, что согласуется с предыдущим сообщением о том, что Wash2 взаимодействует с субъединицей BLOS2 комплекса BLOC-1 с помощью дрожжевого двухгибридного анализа и иммунопреципитации меченые субъединицы (Monfregola et al. , 2010). Кроме того, мы обнаружили, что PI4KIIα содержится в небольших трубчатых структурах, которые исходят из ранних эндосом, которые функционально помечены интернализованными β-адренергическими рецепторами.Если BLOC-1 и комплекс WASH координируются, чтобы регулировать морфологию ранних эндосомных канальцев и / или сортировку грузов, то мы предсказали, что морфологические и неправильные фенотипы будут возникать при нарушении белковых комплексов. Во-первых, мы предсказали ранние морфологические изменения эндосом в истощении комплексов BLOC-1 и WASH, ведущие либо к увеличению эндосом, либо к эндосомным канальцам. Действительно, мы обнаружили, что истощение BLOC-1 увеличивает размер функционально идентифицированных ранних эндосом без увеличения размера канальцев.Этот фенотип согласуется с нашими предыдущими находками, что эндосомы увеличиваются в размере после истощения AP-3, BLOC-1 или PI4KIIα (Salazar et al. , 2009). Кроме того, при истощении комплекса WASH мы обнаружили удлинение ранних эндосомных PI4KIIα-содержащих канальцев, что согласуется с предыдущими сообщениями, демонстрирующими увеличение длины эндосомных канальцев при истощении Wash2 (Derivery et al. , 2009; Gomez and Billadeau, 2009). Во-вторых, мы предсказали неправильную сортировку груза BLOC-1 при истощении комплекса WASH, что может указывать на нарушение потока грузов или мембраны из эндосом.Мы сконцентрировались на неправильном переносе специфических эндолизосомных грузов на поверхность клетки, что является характерным фенотипом для дефицитов AP-3, BLOC-1 и PI4KIIα (Dell’Angelica et al. , 1999; Peden et al. , 2002; Ди Пьетро и др. , 2006; Салазар и др. , 2006; Сетти и др. , 2007; Бауст и др. , 2008). Два груза BLOC-1, ATP7A и VAMP7, неправильно локализуются на поверхности клетки при истощении комплекса WASH. Этот фенотип был специфическим для эндолизосомного груза, поскольку уровни на клеточной поверхности рецептора, который подвергается конститутивной рециклингу, рецептора трансферрина, не изменились.

Как BLOC-1 и комплекс WASH механистически координируются, чтобы регулировать морфологию эндосом и сортировку грузов? Полимеризация актина выполняет множество функций в сортировке и транспортировке мембранных белков, включая создание доменов для пространственной организации механизма сортировки, обеспечение механической поддержки деформации мембраны во время отпочкования везикул, создание силы, способствующей расслоению мембраны везикул, и продвижение носителей после завершения бутонизации (Qualmann и др. , 2000).Фенотип неправильной сортировки груза BLOC-1, наблюдаемый после истощения комплекса WASH, предполагает роль Wash2 на стадиях, происходящих на или выше мембранного разрыва пузырьков. Полимеризация актина комплексом WASH, как предполагается, генерирует силу, необходимую для разрыва мембраны, — гипотеза, ожидающая проверки путем биохимического восстановления in vitro (Bear, 2009; Derivery et al. , 2009; Gomez and Billadeau, 2009; Rotty et al. , 2012). Однако эта модель согласуется с бинарной биохимической ассоциацией субъединиц комплекса WASH, PI4KIIα, BLOC-1 и грузов ATP7A и VAMP7 BLOC-1, описанной здесь и в нашей предыдущей работе (Salazar et al., 2009 г .; Larimore et al. , 2011). Кроме того, эта модель предсказывает, что эти компоненты взаимодействуют одновременно, что еще предстоит задокументировать. Альтернативная гипотеза состоит в том, что PI4KIIα и комплекс BLOC-1 независимо связываются с комплексом WASH, чтобы регулировать его активность. Независимо от того, действуют ли BLOC-1 и PI4KIIα совместно или как независимые факторы, мы предполагаем, что комплекс WASH действует как общий механизм нуклеации разветвленной полимеризации актина в эндосомах с пространственной специфичностью или специфичностью груза, определяемой различными предшествующими дополнительными факторами, такими как оболочка и / или липидные модификации.

PI4KIIα является интересным кандидатом в активатор комплекса WASH из-за его способности продуцировать PI4P (Balla et al. , 2002; Barylko et al. , 2002). Предполагается, что субъединица Fam21 комплекса WASH, компонент интерактома PI4KIIα, локализует WASH на эндосомных мембранах путем связывания фосфоинозитидов и субъединиц комплекса сортировки белков мембраны, таких как субъединица Vps35 ретромерного комплекса (Gomez and Billadeau, 2009; Harbor et al. al., 2012 г .; Helfer et al. , 2013). Fam21 связывает PI4P in vitro, липидный продукт PI4KIIα (Jia et al. , 2010). PI4KIIα и PI4P могут, таким образом, либо рекрутировать комплекс WASH на ранние эндосомные мембраны, либо стабилизировать комплекс на этих мембранах для функции внутри AP-3-BLOC-1 или множественных путей сортировки. Как обсуждается ниже, генетическое нарушение субъединицы комплекса WASH и PI4K2A вызывает общие нейродегенеративные фенотипы у пациентов и мышей, поддерживая регуляторную роль PI4KIIα в локализации WASH (Valdmanis et al., 2007; Simons et al. , 2009 г .; Clemen et al. , 2010). Кроме того, компоненты интерактома PI4KIIα могут регулировать активацию комплекса WASH. Общей чертой факторов, способствующих зародышеобразованию, таких как Wash2, является их регуляция и активация малыми GTPases. Регуляторная GTPase для комплекса WASH остается неуловимой в клетках млекопитающих. У Drosophila melanogaster описано генетических взаимодействий между Rho и Wash2 (Liu et al. , 2009).Высокостехиометрическая ассоциация фактора обмена гуанина RhoA, RhoGEF1, с PI4KIIα и сходство между истощением струмпеллина и истощением RhoGEF1 в клетках MNT1 предполагают регуляторный механизм между этими двумя взаимодействующими элементами PI4KIIα. Будущие эксперименты необходимы для проверки точных молекулярных и функциональных отношений между PI4KIIα, RhoGEF1, комплексом WASH и комплексом BLOC-1.

В дополнение к расширению нашей концепции пути везикулярного транспорта, контролируемого комплексом синдрома Германского-Пудлака BLOC-1, наши результаты имеют новое значение для понимания нейродегенеративных заболеваний, которые влияют на аксоны центральных или периферических мотонейронов, таких как наследственная спастическая параплегия (HSP).Точечные мутации в субъединице комплекса WASH струмпеллин вызывают аутосомно-доминантный HSP (OMIM 610657), который характеризуется дегенерацией аксонов, проецирующихся в спинной мозг из моторной коры головного мозга (Valdmanis et al. , 2007; Clemen et al. , 2010). Более 50 генов были связаны с HSP у человека (Finsterer et al. , 2012). Общей темой этого заболевания является дегенерация центральных нейронов с длинными аксонами, предположительно из-за высокой нагрузки на поддержание синапса, удаленного от тела соответствующей клетки.В соответствии с этой темой, многие из 50 идентифицированных генов представляют собой комплексы переноса через мембрану эндосом (Blackstone, 2012). Не описано никаких взаимодействий между струмпеллином и другими генами, вызывающими HSP, что затрудняет размещение струмпеллина и комплекса WASH в клеточной структуре, чтобы понять, как мутации в белке струмпеллина приводят к заболеванию. Недавнее исследование показало, что субъединицы струмпеллина, содержащие мутации, вызывающие заболевание HSP, собираются в комплексы WASH, которые локализуются в ранних эндосомах нейронов и не имеют очевидных последствий для рециклинга β-адренергических рецепторов, опосредованного ретромерным комплексом (Freeman et al., 2013). Наши данные предполагают, что компоненты взаимодействия PI4KIIα могут быть альтернативным путем, нарушенным этими мутациями. Эта гипотеза подтверждается HSP-подобным фенотипом, который возникает после целенаправленного разрушения PI4KIIα у мышей (Simons et al. , 2009). Помимо роли PI4KIIα в дегенерации центральных мотонейронов, наши данные предполагают связь с механизмами болезни в дегенерации аксонов периферических мотонейронов. Точечные мутации ATP7A-карго BLOC-1 у людей вызывают дегенерацию периферических моторных аксонов (Kennerson et al., 2010; Yi et al. , 2012). В этой статье мы обнаружили, что ATP7A неправильно локализован в клетках, лишенных струмпеллина. Кроме того, PI4KIIα сам по себе является грузом BLOC-1, что указывает на то, что он также может неправильно локализоваться в пертурбациях струмпеллина, которые вызывают HSP у людей. Поэтому мы предполагаем, что нарушение компонентов взаимодействия PI4KIIα может вносить вклад в патофизиологию дегенерации аксонов центральных и периферических мотонейронов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Антитела и культура клеток

Антитела, использованные в этом исследовании, перечислены в дополнительной таблице S3.Антитело PI4KIIα, используемое здесь для иммунопреципитации, вестерн-блоттинга и иммунофлуоресцентной микроскопии, было получено против последовательности 51-PGHDRERQPLLDRARGAAAQ-70 и описано в Larimore et al. (2011). Мы получили этот антигенный пептид путем индивидуального пептидного синтеза (Bio-Synthesis, Lewisville, TX). Антигенный пептид разбавляли до 20 мМ исходного раствора в 0,5 M MOPS, pH 7,4 и хранили при -80 ° C.

Клетки

HEK293T и SHSY-5Y (Американская коллекция типовых культур, Манассас, Вирджиния) поддерживали в DMEM с 4.5 г / л глюкозы, 1-глутамина и пирувата натрия (Cellgro, Manassas, VA) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS; HyClone, Logan, UT) и 100 мкг / мл пенициллина / стрептомицина (HyClone) при 37 ° C и 10% CO ₂ . Клетки MNT1 поддерживали в среде DMEM с добавлением 20% среды AIM-V (Life Technologies, Карлсбад, Калифорния), 10% FBS (инактивированный нагреванием при 65 ° C в течение 60 мин) и 100 мкг / мл пенициллина / стрептомицина при 37 ° C. и 5% CO ₂ .

Для мечения SILAC клетки выращивали либо в легкой среде, содержащей только ¹² C и ¹⁴ N аминокислот аргинина и лизина (R0K0), либо в тяжелой среде, содержащей ¹³ C и ¹⁵ N в этих аминокислотах. аминокислоты (R10K8).Все реагенты для мечения SILAC были получены от Dundee Cell Products (Данди, Великобритания). Клетки выращивали за семь пассажей, чтобы гарантировать максимальное включение этих аминокислот. Наша предыдущая работа показала, что эти условия приводят к включению этих аминокислот в общий клеточный пул> 97,5% (Ong and Mann, 2006; Gokhale et al. , 2012a; Perez-Cornejo et al. , 2012).

ДНК-экспрессирующие конструкции

Были использованы следующие экспрессионные конструкции PI4KIIα: PI4KIIα-EGFP WT, PI4KIIα-HA WT, PI4KIIα-HA D308A и PI4KIIα-HA LL60,61AA (Craige et al., 2008 г.). Конструкция дисбиндина с меткой FLAG описана в предыдущей работе (Gokhale et al. , 2012a). Wash2-EGFP, Strumpellin-EGFP, KIAA1033-EGFP и FAM21-EGFP были описаны ранее (Harbor et al. , 2010). Кортактин-dsRed и β2-адренергические рецепторы, меченные сигнальной последовательностью FLAG (SSF-B2AR), были описаны ранее (Kaksonen et al. , 2000; Puthenveedu et al. , 2010).

Иммунопреципитация и иммуноаффинная хроматография

Клетки нейробластомы SHSY-5Y выращивали до слияния и минимально сшивали, как описано ранее (Zlatic et al., 2010; Gokhale et al. , 2012а, б; Perez-Cornejo et al. , 2012). Вкратце, клетки быстро перемещали из инкубатора на ледяную баню и дважды промывали ледяным фосфатно-солевым буфером (PBS) с добавлением CaCl ₂ (0,1 мМ) и MgCl ₂ (1 мМ) (PBS- Ca-Mg). После этой промывки клетки инкубировали в течение 2 часов в 1 мМ DSP, разведенном в PBS-Ca-Mg или контроле только в диметилсульфоксидном носителе. После сшивания реакцию DSP гасили добавлением 25 мМ Трис, pH 7.4, раствор 15 мин. Затем клетки дважды промывали ледяным PBS-Ca-Mg и лизировали в течение 30 минут в буфере A (150 мМ NaCl, 10 мМ 4- (2-гидроксиэтил) -1-пиперазинэтансульфоновая кислота [HEPES], 1 мМ этиленгликоль. тетрауксусная кислота [EGTA], 0,1 мМ MgCl ₂ ) с 0,5% Triton X-100, дополненным полной антипротеазой (Roche, Indianapolis, IN). После лизиса обломки клеток соскребали с планшетов и лизаты центрифугировали при 16 100 × г в течение 15 мин. Супернатант собирали и разбавляли до 1 мг / мл.Для иммунопреципитации 500 мкг этого осветленного клеточного лизата наносили на 30 мкл магнитных шариков Dynal (Invitrogen, Carlsbad, CA), покрытых представляющим интерес антителом для иммунопреципитации. Эти реакции иммунопреципитации инкубировали в течение 2 ч с вращением «конец за концом» при 4 ° C. Для контроля конкуренции пептида PI4KIIα антигенный пептид PI4KIIα включали в реакцию иммунопреципитации в концентрации 40 мкМ. Для конкурентных контролей FLAG был включен пептид 3X FLAG в концентрации 340 мкМ, как описано ранее (Gokhale et al., 2012а; Perez-Cornejo et al. , 2012). Для конкурентных контролей HA пептид HA был включен в концентрации 10 мкМ. После 2-часовой инкубации шарики пять раз промывали в буфере A с 0,1% Triton X-100. Затем белки элюировали из шариков либо кипячением в буфере для образцов Лэммли при 75 ° C в течение 5 минут, либо инкубированием с антигенным пептидом в течение 2 часов на льду. Пептиды разбавляли в буфере для лизиса до их концентрации элюирования (антигенный пептид PI4KIIα, 200 мкМ; пептид 3X FLAG, 340 мкМ).Образцы разделяли электрофорезом в SDS – PAGE с последующим окрашиванием серебром или иммуноблоттингом для обнаружения отдельных белков. Для анализа SILAC было проведено 18 иммуноаффинных хроматографий и 18 контрольных реакций. Элюаты этих реакций объединяли и осаждали трихлоруксусной кислотой, чтобы сконцентрировать образцы для SDS-PAGE и масс-спектрометрического анализа. Образцы были проанализированы для идентификации белка SILAC в MS Bioworks (Анн-Арбор, Мичиган) и Emory CND Proteomics Facility (Атланта, Джорджия).Меченые SILAC образцы разделяли на 4–12% минигеле Bis-Tris Novex (Invitrogen) с использованием буферной системы MOPS и окрашивали кумасси, и дорожку вырезали на 20 равных сегментов с использованием сетки. Кусочки геля обрабатывали с использованием робота (ProGest; Digilab, Мальборо, Массачусетс), как описано (Gokhale et al. , 2012a; Perez-Cornejo et al. , 2012).

Переходный нокдаун белка и анализ иммуноблоттинга

Для нокдауна shRNA-опосредованного белка конструкции в pLKO.1 вектор был получен от Open Biosystems (Хантсвилл, Алабама). Идентификаторы клонов для целевых конструкций следующие: приглушенный (Bloc1s5), TRCN0000129117; паллидин (Bloc1s6), TRCN0000122781; струмпеллин, TRCN0000128018; и RhoGEF1, TRCN0000033567. Вектор управления скремблированием был получен от Addgene (Кембридж, Массачусетс; Vector 1864). Клетки HEK293T, засеянные в шестилуночные планшеты, трансфицировали 1 мкг ДНК конструкции shRNA в течение ночи с помощью Lipofectamine 2000 (Life Technologies) в соответствии с инструкциями производителя.Клетки MNT1 и SHSY-5Y высевали в шестилуночные планшеты и обрабатывали 1-2 мкл лентивирусных частиц с высоким титром, содержащих соответствующую лентивирусную конструкцию. Ядро вирусного вектора Emory NINDS подготовило все лентивирусы с высоким титром. Через два дня после доставки конструкции shРНК трансформированные клетки отбирали обработкой 2 мкг / мл пуромицина (Invitrogen) в подходящей питательной среде, как описано. Общая продолжительность лечения составляла 5–10 дней, чтобы обеспечить эффективный нокдаун интересующих белков.Олигонуклеотидные последовательности малых интерферирующих РНК (миРНК) против PI4KIIα и контролей, а также процедуры были описаны ранее (Craige et al. , 2008; Salazar et al. , 2009).

Для иммуноблот-анализа уровней белка клетки выращивали до слияния в шестилуночных планшетах. Клетки обрабатывали лентивирусами в течение 7 дней. Планшеты быстро перемещали на ледяную баню и сразу же дважды промывали ледяным PBS. Затем клетки помещали в буфер A и центрифугировали при 16 100 × г в течение 1 мин для получения осадка.Клетки MNT1 инкубировали в течение 10 мин в буфере А перед подъемом для облегчения высвобождения из планшета для культуры ткани. Осадки клеток ресуспендировали в 100 мкл буфера А, дополненного полной антипротеазой. Затем клетки лизировали ультразвуком (три цикла по пять импульсов по 1 с). Лизаты разбавляли до 1 мг / мл и разделяли с помощью SDS-PAGE и иммуноблоттинга. На лунку загружали от 5 до 15 мкг клеточного лизата.

Иммунофлуоресцентная микроскопия

Клетки HEK293T трансфицировали в шестилуночных планшетах 1 мкг конструкции ДНК с помощью липофектамина 2000 в течение 4 часов, а затем переводили в среду для выращивания.Через 24 ч клетки высевали на покровные стекла, покрытые матригелем. На следующий день покровные стекла перемещали на лед, дважды промывали ледяным PBS, а затем фиксировали 4% параформальдегидом в PBS в течение 20 минут. Для клеток, окрашенных красителем A488 MitoTracker (Invitrogen), клетки инкубировали с 500 нМ красителем MitoTracker, разведенным в питательной среде в течение 30 мин. После инкубации клетки немедленно фиксировали при 37 ° C в 4% параформальдегиде. После фиксации все покровные стекла дважды промывали PBS, а затем блокировали и обеспечивали проницаемость в течение 30 мин при комнатной температуре в растворе 0.02% сапонина (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури), 15% лошадиной сыворотки (HyClone), 2% бычьего сывороточного альбумина (Roche) и 1% желатина рыбьей кожи (Sigma-Aldrich) в PBS. Первичные антитела (дополнительная таблица S3) разводили в блокирующем растворе и применяли в течение 30 мин при 37 ° C. После инкубации первичных антител покровные стекла трижды промывали блокирующим раствором. Покровные стекла инкубировали в течение 30 минут при 37 ° C с вторичными антителами, конъюгированными с флуорофором (дополнительная таблица S3), разведенными в блокирующем растворе.Покровные стекла промывали два раза в блокирующем растворе, один раз в PBS и один раз в сверхчистой воде, а затем помещали на предметные стекла в установочной среде Gelvatol (Sigma-Aldrich).

Для микроскопии деконволюции фиксированных клеток изображения получали на инвертированном микроскопе Zeiss Axiovert 200M (Carl Zeiss, Jena, Germany) с набором фильтров Sedat (Chroma Technology, Brattleboro, VT). Программное обеспечение Slidebook 4.0 OSX использовалось для запуска многоволновой системы трехмерной микроскопии с широким полем поля (Intelligent Imaging Innovations, Денвер, Колорадо).Изображения были визуализированы с помощью 100-кратного масляного дифференциального интерференционного контрастного объектива с числовой апертурой 1,4 и сняты с помощью охлаждаемой камеры Cool-Snap HQ с зарядовой связью научного уровня (Photometrics, Tucson, AZ) с чипом ORCA-ER (Hamamatsu Photonics, Хамамацу, Япония). Изображения были получены при длине волны 200 нм между плоскостями z . Для удаления расфокусированного света использовался ограниченный итерационный алгоритм деконволюции с ограничением ближайшего соседа с гауссовым сглаживанием (Swedlow и др. , 1997, 2002).Изображения были экспортированы из программного обеспечения Slidebook 4.0 как 8-битные серии TIF. Для анализа колокализации из сфокусированных плоскостей изображения вычитали фон с помощью 10-пиксельного алгоритма катящегося шарика на Фиджи (ImageJ; Национальные институты здравоохранения, Бетесда, Мэриленд). Была выбрана представляющая интерес область, непосредственно окружающая отдельные ячейки, и коэффициент Пирсона был рассчитан с помощью подключаемого модуля Coloc 2. Трехмерные реконструкции были созданы из деконволютированных 8-битных изображений серии TIF, импортированных в Imaris 6.3.1 с использованием ручного определения порога и минимального ограничения громкости в 4 вокселя (Bitplane Scientific Software, Цюрих, Швейцария).

Для визуализации живых клеток EGFP-меченного PI4KIIα и меченного mCherry пептида LifeAct клетки HEK293T, экспрессирующие флуоресцентно меченые белковые конструкции, высевали в покрытые матригелем культуральные чашки со стеклянным дном (Matek Corporation, Ashland, MA). Перед визуализацией клетки поддерживали в ростовой среде HEK293T, как описано, при 37ºC и 10% CO ₂ . Непосредственно перед визуализацией применялась среда для визуализации, состоящая из сбалансированного солевого раствора Хэнка за вычетом фенолового красного и NaHCO ₂ (Sigma-Aldrich) с добавлением 10% FBS (HyClone).Клетки получали с помощью инвертированного микроскопа Nikon TE2000 (Nikon Instruments, Мелвилл, Нью-Йорк), оснащенного гибридным сканером Perfect Focus и камерой для регулирования температуры до 37 ° C и 5% CO ₂ . Изображения были получены с помощью масляного объектива с числовой апертурой 100 ×, 1,49 и наборов фильтров 500–550 / 570–620 с использованием программного обеспечения NIS-Elements AR 3.1 (Nikon). Клетки поочередно возбуждали лазерами с длиной волны 488 и 568 нм каждые 4,25 с, и было получено одно изображение конфокальной плоскости.Изображения были экспортированы в виде 8-битных серий TIF в программе NIS-Elements, а рисунки были скомпилированы в Photoshop (Adobe, Сан-Хосе, Калифорния).

Для визуализации живых клеток PI4KIIα с мечеными функционально меченными эндосомами флуоресцентные метки были взяты из экспрессированных белковых конструкций (GFP и dsRed) или антитела против FLAG M1, конъюгированного с красителем Alexa 647. Клетки выращивали на покровных стеклах и поддерживали в 10% FBS (Life Technologies), DMEM с высоким содержанием глюкозы (HyClone) и отображали в Opti-MEME (Life Technologies) с 10% FBS и забуферивали до pH 7.4 с 40 мМ HEPES. Конфокальные изображения живых клеток получали на системе Revolution XD Spinning Disk (Андор, Белфаст, Великобритания) с инвертированным микроскопом Nikon Eclipse Ti. Объектив, использованный для захвата, представлял собой флуоресцентный объектив с числовой апертурой 100 × / 1,49 от компании Nikon с полным внутренним отражением. И микроскоп, и объективы были помещены в шкаф для контроля температуры, поддерживаемый на уровне 37 ° C. Источниками света служили твердотельные лазеры с длиной волны 488, 561 и 647 нм, а изображения получали на камеру электронного умножителя с зарядовой связью iXON + 897 с использованием Andor iQ.Анализ изображений проводился на необработанных изображениях в ImageJ. Изображения не подвергались никаким изменениям, кроме назначения цвета и яркости / контраста для многоканальных изображений. Для оценки канальцев слепым методом отбирали клетки в канале β2-адрегенергического рецептора. Мы считали, что клетка имеет фенотип канальцев, если она содержит более одного объекта, который примерно в четыре раза длиннее, чем ширина в диапазоне размеров эндосом. Клетки были поставлены в фокус с использованием только канала β2-дрегенергического рецептора перед агонистом, чтобы избежать смещения при выборе клеток с фенотипом.Все имена файлов были рандомизированы для слепой оценки.

Фракционирование клеток

Конфлюэнтные клетки HEK293T дважды промывали ледяным PBS, а затем переносили во внутриклеточный буфер (38 мМ аспартат калия, 38 мМ глутамат калия, 38 мМ глюконат калия, 20 мМ MOPS-KOH, pH 7,2, 5 мМ восстановленный глутатион, 5 мМ карбонат натрия, 2,5 мМ сульфат магния, 2 мМ EGTA). Клетки центрифугировали при 800 × г для получения осадка, а затем ресуспендировали в минимальном объеме внутриклеточного буфера, дополненного 5-кратной концентрацией полной антипротеазы.Клетки гомогенизировали с использованием устройства для взлома клеток с зазором 12 мкм (Clift-O’Grady et al. , 1998; Lichtenstein et al. , 1998). От 200 до 250 мкл гомогената (450-800 мкг) наносили слоями на 10-45% градиенты сахарозы, забуференные 20 мМ MOPS (pH 7,2), которые получали с использованием Gradient Master (Biocomp Instruments, Фредериктон, Канада). Градиенты сахарозы центрифугировали в течение 1 ч при 210 000 × g при 4 ° C в роторе Beckman SW55Ti и фракции анализировали с помощью иммуноблоттинга.Показатели преломления сахарозы для каждой фракции измеряли рефрактометром (Leica, Wetzlar, Германия).

Поверхностная маркировка и извлечение стрептавидина

После 7 дней обработки лентивирусами, нацеленными на скрембл или струмпеллин, планшеты сливающихся клеток MNT1 перемещали в ледяную баню и дважды промывали ледяным PBS-Ca-Mg (0,1 мМ CaCl ₂ и 1 мМ MgCl ₂ в PBS). Все использованные растворы были ледяными при нанесении на клетки, и клетки поддерживали на ледяной бане на всем протяжении.После промываний клетки инкубировали в 1 мМ растворе периодата натрия (Sigma-Aldrich), приготовленном в PBS-Ca-Mg, в течение 30 мин, после чего раствор периодата удаляли и гасящий раствор 1 мМ глицерина в PBS-Ca-Mg. был добавлен (Zeng et al. , 2009). Затем клетки дважды промывали PBS-Ca-Mg и наносили раствор для лигирования биотина из 100 мкМ аминооксибиотина (Biotium, Hayward, CA) и 10 мМ анилина (Sigma-Aldrich) на 90 мин. После лигирования биотина клетки дважды промывали PBS-Ca-Mg и лизировали в течение 30 мин в буфере A с 0.5% Triton X-100, дополненный полной антипротеазой. Эта процедура биотинилирования основана на образующемся периодатом альдегиде на сиаловых кислотах. Этот процесс катализируется анилин-зависимым лигированием с соответствующей меткой. Катализ анилином ускоряет лигирование, облегчая реакцию с низкими концентрациями аминооксибиотина при нейтральном pH для мечения большинства сиалилированных гликопротеинов клеточной поверхности (Zeng et al. , 2009). После лизиса обломки клеток соскребали с планшетов и лизаты центрифугировали при 16 100 × г в течение 15 мин.Супернатант собирали и разбавляли до 0,2 мг / мл. Небольшой объем (50 мкл) покрытых нейтр-авидином агарозных шариков (Thermo Scientific, Waltham, MA) предварительно дважды промывали в буфере A с 0,1% Triton X-100, и 100 мкг клеточного лизата инкубировали с шариками в течение 2 часов. с непрерывным вращением при 4 ° C. Затем шарики промывали пять раз в буфере A с 0,1% Triton X-100 в течение 5 минут с вращением «конец за концом» при 4 ° C. Белки элюировали из шариков кипячением в буфере для образцов Лэммли при 75 ° C в течение 5 минут, и образцы анализировали с помощью SDS-PAGE с последующим окрашиванием серебром или иммуноблоттингом.

Вычислительный и статистический анализ

Функциональная аннотация гена для набора PI4KIIα-взаимодействующих белков (дополнительная таблица S2) была выполнена с использованием терминов базы данных для аннотаций, визуализации и интегрированного обнаружения (DAVID, версия 6.7) и генной онтологии (GO). (Деннис и др. , 2003; Хуанг да и др. , 2007). Плагин Cytoscape Enrichment Map использовался для отображения совпадения терминов генной онтологии в Cytoscape (версия 2.8.3; Merico et al., 2010). Размер узла был сопоставлен с количеством генов в категории GO, а цвет узла был сопоставлен со значением p для обогащения данной категории. Для сетевого анализа была построена карта сетевого взаимодействия с использованием GeneGo Metacore (версия 6.11, сборка 41105) для взаимодействующих с PI4KIIα белков (дополнительная таблица S1) и субъединиц BLOC-1. Сеть была визуализирована в Cytoscape, и цвет узлов был сопоставлен с интересующими белками.

Условия экспериментов сравнивали с помощью программы KaleidaGraph, версия 4.1.3 (Synergy Software, Reading, PA) или StatPlus Mac Built5.6.0pre / Universal (AnalystSoft, Ванкувер, Канада). Данные представлены в виде прямоугольных диаграмм, отображающих четыре квартиля данных, причем «прямоугольник» содержит два средних квартиля, разделенных медианой. Верхний и нижний квартили представлены одиночными линиями, отходящими от прямоугольника.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами Национальных институтов здравоохранения ({«type»: «entrez-nucleotide», «attrs»: {«text»: «GM077569», «term_id»: «221372554»}} } GM077569 и NS42599) и Детский центр нейробиологии CHOA В.F. P.V.R. был поддержан стипендией F31NS0765 Национальной исследовательской службы. Этот исследовательский проект частично поддержан Интегрированным ядром микроскопии клеточной визуализации Университета Эмори и вирусными ядрами Национального института неврологических расстройств и инсульта Национального института неврологии Эмори, грантом P30NS055077. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Используемые сокращения:

90bis7 РНК

ATP7A	АТФаза Cu ++, транспортирующая альфа-полипептид
BLOC	биогенез комплекса органелл, связанных с липосомами
DSP	зеленый флуоресцентный протеин
HA	гемагглютинин
ВЭЖХ	высокоэффективная жидкостная хроматография
HPS		Hermansky-Pudlak МС	масс-спектрометрия
МС / МС	тандемная масс-спектрометрия
PI4KIIα	фосфатидилинозитол-4-киназа типа IIα
8 PY4P 90spositol 90spit48		90sposit	PI4 солевой раствор с фосфатным буфером
SILAC	мечение стабильных изотопов аминокислотами в клеточной культуре
миРНК	малые интерферирующие
РНК	shRNA		рецептор коротких шпилек
VAMP7	мембранный белок, связанный с везикулами 7

ССЫЛКИ

• Aittaleb M, Boguth CA, Tesmer JJ.Структура и функция факторов обмена генов нуклеотидов, регулируемых гетеротримерным G-белком. Mol Pharmacol. 2010. 77: 111–125. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Anitei M, Hoflack B. Динамика мостиковой мембраны и цитоскелета в секреторных и эндоцитарных путях. Nat Cell Biol. 2012; 14: 11–19. [PubMed] [Google Scholar]
• Anitei M, Stange C, Parshina I, Baust T, Schenck A, Raposo G, Kirchhausen T., Hoflack B. Белковые комплексы, содержащие CYFIP / Sra / PIR121, координируют передачу сигналов Arf1 и Rac1 во время клатрин-AP -1-покрытый биогенез носителя в TGN.Nat Cell Biol. 2010. 12: 330–340. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Балла А., Туйметова Г., Баршишат М., Гейзт М., Балла Т. Характеристика изоформ фосфатидилинозитол-4-киназы типа II выявила ассоциацию ферментов с эндосомными везикулярными компартментами. J Biol Chem. 2002; 277: 20041–20050. [PubMed] [Google Scholar]
• Барылко Б., Влодарски П., Биннс Д.Д., Гербер С.Х., Эрнест С., Судхоф Т.С., Гричин Н., Албанези Дж.П. Анализ каталитического домена фосфатидилинозитол-4-киназы II типа.J Biol Chem. 2002; 277: 44366–44375. [PubMed] [Google Scholar]
• Baust T, Anitei M, Czupalla C, Parshyna I, Bourel L, Thiele C, Krause E, Hoflack B. Белковые сети, поддерживающие функцию AP-3 в нацеливании на белки лизосомных мембран. Mol Biol Cell. 2008; 19: 1942–1951. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Bear JE. Сортировка эндосом в WASH. Dev Cell. 2009. 17: 583–584. [PubMed] [Google Scholar]
• Биркенфельд Дж., Налбант П., Юн Ш., Бокоч Г. М.. Клеточные функции GEF-h2, Rho-GEF, регулируемого микротрубочками: измененная активность GEF-h2 является решающим фактором патогенеза заболевания.Trends Cell Biol. 2008. 18: 210–219. [PubMed] [Google Scholar]
• Blackstone C. Клеточные пути наследственной спастической параплегии. Annu Rev Neurosci. 2012; 35: 25–47. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Блазиус А.Л., Брандл К., Крозат К., Ся Й, Хованант К., Кребс П., Смарт Н.Г., Замполли А., Руджери З.М., Бейтлер Б.А. Мыши с мутациями Dock7 имеют общую гипопигментацию и белые пятна, но демонстрируют нормальную неврологическую функцию. Proc Natl Acad Sci USA. 2009. 106: 2706–2711.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Bonifacino JS, Glick BS. Механизмы почкования и слияния пузырьков. Клетка. 2004. 116: 153–166. [PubMed] [Google Scholar]
• Брокер С., Энгельбрехт-Вандре С., Унгерманн С. Мультисубъединичные связывающие комплексы и их роль в слиянии мембран. Curr Biol. 2010; 20: R943 – R952. [PubMed] [Google Scholar]
• Бултема Дж. Дж., Ди Пьетро С. М.. Rab32 и Rab38, специфичные к типу клеток, взаимодействуют с повсеместным механизмом биогенеза лизосом для синтеза специализированных органелл, связанных с лизосомами.Малые GTPases. 2013; 4: 16–21. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Campellone KG, Welch MD. Гонка вооружений нуклеаторов: клеточный контроль сборки актина. Nat Rev. Mol Cell Biol. 2010; 11: 237–251. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Карнелл М., Зеч Т., Каламинус С.Д., Ура С., Хагедорн М., Джонстон С.А., Май Р.С., Солдати Т., Маски Л.М., Insall RH. Полимеризация актина, вызванная WASH, вызывает извлечение V-АТФазы и нейтрализацию везикул перед экзоцитозом. J Cell Biol. 2011; 193: 831–839.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Clemen CS, et al. Струмпеллин — новый валозин-содержащий белок связывающий партнер, связывающий наследственную спастическую параплегию с заболеваниями агрегации белков. Головной мозг. 2010; 133: 2920–2941. [PubMed] [Google Scholar]
• Клифт-О’Грейди Л., Деснос К., Лихтенштейн Ю., Фаундез В., Хорнг Дж. Т., Келли Р. Б.. Восстановление биогенеза синаптических пузырьков из клеточных мембран PC12. Методы. 1998. 16: 150–159. [PubMed] [Google Scholar]
• Коннер С.Д., Шмид С.Л.Регулируемые порталы входа в камеру. Природа. 2003; 422: 37–44. [PubMed] [Google Scholar]
• Craige B, Salazar G, Faundez V. Фосфатидилинозитол-4-хиназа типа II альфа содержит мотив сортировки AP-3 и киназный домен, которые необходимы для трафика эндосом. Mol Biol Cell. 2008; 19: 1415–1426. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Delevoye C, et al. AP-1 и KIF13A координируют сортировку и позиционирование эндосом во время биогенеза меланосом. J Cell Biol. 2009. 187: 247–264.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Dell’Angelica EC. AP-3-зависимая торговля людьми и болезни: первое десятилетие. Curr Opin Cell Biol. 2009; 21: 552–559. [PubMed] [Google Scholar]
• Dell’Angelica EC, Shotelersuk V, Aguilar RC, Gahl WA, Bonifacino JS. Измененный трафик лизосомных белков при синдроме Германского-Пудлака из-за мутаций в бета-субъединице 3A адаптера AP-3. Mol Cell. 1999; 3: 11–21. [PubMed] [Google Scholar]
• Деннис Дж., Младший, Шерман Б.Т., Хосак Д.А., Ян Дж., Гао В., Лейн ХК, Лемпицки Р.А.ДЭВИД: База данных для аннотаций, визуализации и интегрированного обнаружения. Genome Biol. 2003; 4: P3. [PubMed] [Google Scholar]
• Derivery E, Sousa C, Gautier JJ, Lombard B, Loew D, Gautreau A. Активатор Arp2 / 3 WASH контролирует деление эндосом через большой мультипротеиновый комплекс. Dev Cell. 2009; 17: 712–723. [PubMed] [Google Scholar]
• Ди Пьетро С. М., Фалькон-Перес Дж. М., Тенза Д., Сетти С. Р., Маркс М. С., Рапосо Дж., Dell’Angelica EC. BLOC-1 взаимодействует с BLOC-2 и комплексом AP-3, облегчая перенос белков в эндосомы.Mol Biol Cell. 2006; 17: 4027-4038. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Duleh SN, Welch MD. WASH и комплекс Arp2 / 3 регулируют форму и транспорт эндосом. Цитоскелет (Хобокен) 2010; 67: 193–206. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Duleh SN, Welch MD. Регуляция переноса интегрина, клеточной адгезии и миграции клеток с помощью WASH и комплекса Arp2 / 3. Цитоскелет (Хобокен) 2012; 69: 1047–1058. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Ferguson SM, De Camilli P.Динамин, ГТФаза, ремоделирующая мембраны. Nat Rev Mol Cell Biol. 2012; 13: 75–88. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Finsterer J, Loscher W, Quasthoff S, Wanschitz J, Auer-Grumbach M, Stevanin G. Наследственные спастические параплегии с аутосомно-доминантным, рецессивным, X-сцепленным или материнским признаком наследства. J Neurol Sci. 2012; 318: 1–18. [PubMed] [Google Scholar]
• Freeman C, Seaman MN, Reid E. Наследственный белок спастической параплегии strumpellin: характеристика нейронов и влияние патологических мутаций на сборку и функцию комплекса WASH.Biochim Biophys Acta. 2013; 1832: 160–173. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Gao Y, Zorman S, Gundersen G, Xi Z, Ma L, Sirinakis G, Rothman JE, Zhang Y. Отдельные воссозданные нейронные комплексы SNARE застегиваются на три различных этапа. Наука. 2012; 337: 1340–1343. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Gokhale A, Larimore J, Werner E, So L, Moreno-De-Luca A, Lese-Martin C, Lupashin VV, Smith Y, Faundez V. Количественная протеомика и Генетический анализ фактора восприимчивости к шизофрении дисбиндин выявляет новые роли в биогенезе комплекса органелл, связанных с лизосомами 1.J Neurosci. 2012a; 32: 3697–3711. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Gokhale A, Perez-Cornejo P, Duran C, Hartzell HC, Faundez V. Комплексная стратегия идентификации стехиометрических взаимодействий с мембранными белками. Сотовый Логист. 2012b; 2: 1–8. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Gomez TS, Billadeau DD. Комплекс WASH, содержащий FAM21, регулирует ретромер-зависимую сортировку. Dev Cell. 2009; 17: 699–711. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Gomez TS, Gorman JA, de Narvajas AA, Koenig AO, Billadeau DD.Дефекты движения в фибробластах, нокаутированных по WASH, происходят из-за разрушенных эндосомных и лизосомных сетей. Mol Biol Cell. 2012; 23: 3215–3228. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Guo J, Wenk MR, Pellegrini L, Onofri F, Benfenati F, De Camilli P. Фосфатидилинозитол-4-киназа типа IIalpha отвечает за активность фосфатидилинозитол-4-киназы, связанную с синаптические везикулы. Proc Natl Acad Sci USA. 2003; 100: 3995–4000. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Хао Й. Х., Дойл Дж. М., Раманатан С., Гомес Т. С., Цзя Д., Сюй М., Чен З. Дж., Билладо Д. Д., Розен М. К., Поттс П. Р..Регуляция WASH-зависимой полимеризации актина и транспорта белков путем убиквитинирования. Клетка. 2013; 152: 1051–1064. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Harbour ME, Breusegem SY, Antrobus R, Freeman C, Reid E, Seaman MN. Карго-селективный ретромерный комплекс является центром рекрутирования белковых комплексов, которые регулируют динамику эндосомных канальцев. J Cell Sci. 2010; 123: 3703–3717. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Harbour ME, Breusegem SY, Seaman MN. Рекрутирование эндосомного комплекса WASH опосредуется удлиненным «хвостом» связывания Fam21 с ретромерным белком Vps35.Биохим Дж. 2012; 442: 209–220. [PubMed] [Google Scholar]
• Helfer E, Harbour ME, Henriot V, Lakisic G, Sousa-Blin C, Volceanov L, Seaman MN, Gautreau A. Эндосомное рекрутирование комплекса WASH: активные последовательности и мутации, нарушающие взаимодействие с ретромер. Biol Cell. 2013; 105: 191–207. [PubMed] [Google Scholar]
• Хуанг да В. и др. Ресурсы DAVID по биоинформатике: расширенная база данных аннотаций и новые алгоритмы для лучшего извлечения биологии из больших списков генов. Nucleic Acids Res.2007; 35: W169 – W175. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Huizing M, Helip-Wooley A, Westbroek W., Gunay-Aygun M, Gahl WA. Нарушения биогенеза лизосомальных органелл: клиническая и молекулярная генетика. Анну Рев Геномикс Хум Генет. 2008. 9: 359–386. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Джиа Д., Гомес Т.С., Билладо Д.Д., Розен М.К. Множественные повторяющиеся элементы в хвосте FAM21 связывают регуляторный комплекс актина WASH с ретромером. Mol Biol Cell. 2012; 23: 2352–2361.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Джиа Д., Гомес Т.С., Метлагель З., Уметани Дж., Отвиновски З., Розен М.К., Билладо Д.Д. Регуляторы актина WASH и WAVE семейства белков синдрома Вискотта-Олдрича (WASP) контролируются аналогичными структурно родственными комплексами. Proc Natl Acad Sci USA. 2010; 107: 10442–10447. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Kaksonen M, Peng HB, Rauvala H. Ассоциация кортактина с динамическим актином в ламеллиподиях и на эндосомальных пузырьках.J Cell Sci. 2000; 113: 4421–4426. [PubMed] [Google Scholar]
• Каксонен М., Торет С.П., Друбин Д.Г. Модульная конструкция аппарата эндоцитоза, опосредованного клатрином и актином. Клетка. 2005; 123: 305–320. [PubMed] [Google Scholar]
• Каксонен М., Торет С.П., Друбин Д.Г. Использование динамики актина для клатрин-опосредованного эндоцитоза. Nat Rev Mol Cell Biol. 2006; 7: 404–414. [PubMed] [Google Scholar]
• Кантети П., Диас М.Э., Педен А.Е., Сеонг Е.Э., Долан Д.Ф., Робинсон М.С., Ноэбельс Дж. Л., Бурмейстер М.Л.Генетический и фенотипический анализ мутанта мыши mh (2J), аллеля Ap3d, вызванного вставкой элемента IAP. Мамм Геном. 2003. 14: 157–167. [PubMed] [Google Scholar]
• Kennerson ML, et al. Миссенс-мутации в гене переносчика меди ATP7A вызывают Х-сцепленную дистальную наследственную моторную нейропатию. Am J Hum Genet. 2010. 86: 343–352. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Larimore J, et al. Фактор восприимчивости к шизофрении дисбиндин и связанный с ним комплекс сортируют грузы от тел клеток к синапсу.Mol Biol Cell. 2011; 22: 4854–4867. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Li W, et al. Синдром Германского-Пудлака типа 7 (HPS-7) является результатом мутантного дисбиндина, члена биогенеза связанного с лизосомами комплекса органелл 1 (BLOC-1) Nat Genet. 2003. 35: 84–89. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Lichtenstein Y, Desnos C, Faundez V, Kelly RB, Clift-O’Grady L. Везикуляция и сортировка эндосом, полученных из PC12, in vitro. Proc Natl Acad Sci USA. 1998; 95: 11223–11228.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Лю Р., Абреу-Бланко М.Т., Барри К.С., Линардопулу Е.В., Осборн Г.Э., Паркхерст С.М. Wash действует ниже Rho и связывает линейные и разветвленные факторы нуклеации актина. Разработка. 2009. 136: 2849–2860. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Ломант А.Дж., Фэрбенкс Г. Химические исследования расширенных биологических структур: синтез и свойства расщепляемого белка сшивающего реагента [35S] дитиобис (сукцинимидилпропионат) J Mol Biol.1976; 104: 243–261. [PubMed] [Google Scholar]
• Манн М. Функциональная и количественная протеомика с использованием SILAC. Nat Rev. Mol Cell Biol. 2006; 7: 952–958. [PubMed] [Google Scholar]
• McMahon HT, Boucrot E. Молекулярный механизм и физиологические функции клатрин-опосредованного эндоцитоза. Nat Rev. Mol Cell Biol. 2011; 12: 517–533. [PubMed] [Google Scholar]
• Мерико Д., Иссерлин Р., Стюкер О., Эмили А., Бадер Г. Д.. Карта обогащения: сетевой метод визуализации и интерпретации обогащения набора генов.PloS One. 2010; 5: e13984. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Minogue S, Waugh MG, De Matteis MA, Stephens DJ, Berditchevski F, Hsuan JJ. Фосфатидилинозитол-4-киназа необходима для эндосомного переноса и деградации рецептора EGF. J Cell Sci. 2006; 119: 571–581. [PubMed] [Google Scholar]
• Монфрегола Дж., Наполитано Дж., Д’Урсо М., Лаппалайнен П., Урсини М.В. Функциональная характеристика белка синдрома Вискотта-Олдрича и гомолога рубца (WASH), бимодульного фактора, способствующего нуклеации, способного взаимодействовать с биогенезом связанной с лизосомами субъединицы 2 органеллы (BLOS2) и гамма-тубулина.J Biol Chem. 2010; 285: 16951–16957. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Мурен О.Л., Галлетта Б.Дж., Купер Дж.А. Роль сборки актина в эндоцитозе. Анну Рев Биохим. 2012. 81: 661–686. [PubMed] [Google Scholar]
• Mossinger J, Wieffer M, Krause E, Freund C., Gerth F, Krauss M, Haucke V. Функция фосфатидилинозитол-4-киназы IIальфа в эндосомах регулируется убиквитинлигазой Itch. EMBO Rep. 2012; 13: 1087–1094. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Nakagawa T., Setou M, Seog D, Ogasawara K, Dohmae N, Takio K, Hirokawa N.Новый мотор, KIF13A, транспортирует маннозо-6-фосфатный рецептор к плазматической мембране посредством прямого взаимодействия с комплексом AP-1. Клетка. 2000; 103: 569–581. [PubMed] [Google Scholar]
• Newell-Litwa K, Chintala S, Jenkins S, Pare JF, McGaha L, Smith Y, Faundez V. Hermansky-Pudlak, белковые комплексы, AP-3 и BLOC-1, по-разному регулируют пресинаптический состав в полосатом теле и гиппокампе. J Neurosci. 2010. 30: 820–831. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Newell-Litwa K, Salazar G, Smith Y, Faundez V.Роль комплексов BLOC-1 и AP-3 в сортировке грузов в синаптические везикулы. Mol Biol Cell. 2009; 20: 1441–1453. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Ньюэлл-Литва К., Сеонг Э., Бурмейстер М., Фаундез В. Нейрональные и ненейрональные функции механизма сортировки AP-3. J Cell Sci. 2007; 120: 531–541. [PubMed] [Google Scholar]
• Ong SE, Blagoev B, Kratchmarova I., Kristensen DB, Steen H, Pandey A, Mann M. Мечение стабильных изотопов аминокислот в культуре клеток, SILAC, как простой и точный подход к экспрессии протеомика.Mol Cell Proteom. 2002; 1: 376–386. [PubMed] [Google Scholar]
• Онг С.Э., Манн М. Практический рецепт мечения стабильных изотопов аминокислотами в культуре клеток (SILAC) Nat Protoc. 2006; 1: 2650–2660. [PubMed] [Google Scholar]
• Педен А.А., Радж Р.Э., Луи У.В., Робинсон М.С. Сборка и функция комплексов AP-3 в клетках, экспрессирующих мутантные субъединицы. J Cell Biol. 2002. 156: 327–336. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Perez-Cornejo P, Gokhale A, Duran C, Cui Y, Xiao Q, Hartzell HC, Faundez V.Аноктамин 1 (Tmem16A) Ca2 + -активированный хлоридный канал стехиометрически взаимодействует с сетью эзрин-радиксин-моэзин. Proc Natl Acad Sci USA. 2012; 109: 10376–10381. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Piotrowski JT, Gomez TS, Schoon RA, Mangalam AK, Billadeau DD. WASH-нокаутные Т-клетки демонстрируют дефектный перенос рецепторов, пролиферацию и эффекторную функцию. Mol Cell Biol. 2013; 33: 958–973. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Puthenveedu MA, Lauffer B, Temkin P, Vistein R, Carlton P, Thorn K, Taunton J, Weiner OD, Parton RG, von Zastrow M.Последовательно-зависимая сортировка рециклирующих белков с помощью стабилизированных актином эндосомных микродоменов. Клетка. 2010. 143: 761–773. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Квалманн Б., Кессельс М.М., Келли Р.Б. Молекулярные связи между эндоцитозом и актиновым цитоскелетом. J Cell Biol. 2000; 150: F111 – F116. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Raposo G, Marks MS. Меланосомы — темные органеллы просветляют транспорт через эндосомную мембрану. Nat Rev. Mol Cell Biol. 2007. 8: 786–797. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Raposo G, Marks MS, Cutler DF.Органеллы, связанные с лизосомами: специализация компартментов после Гольджи. Curr Opin Cell Biol. 2007; 19: 394–401. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Riedl J, et al. Lifeact: универсальный маркер для визуализации F-актина. Нат методы. 2008; 5: 605–607. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Россман К.Л., Дер С.Дж., Сондек Дж. GEF означает: включение ГТФаз RHO с факторами обмена гуаниновых нуклеотидов. Nat Rev Mol Cell Biol. 2005; 6: 167–180. [PubMed] [Google Scholar]
• Rottner K, Hanisch J, Campellone KG.WASH, WHAMM и JMY: регуляция комплекса Arp2 / 3 и не только. Trends Cell Biol. 2010. 20: 650–661. [PubMed] [Google Scholar]
• Rotty JD, Wu C, Bear JE. Новое понимание регуляции и клеточных функций комплекса ARP2 / 3. Nat Rev Mol Cell Biol. 2012; 14: 7–12. [PubMed] [Google Scholar]
• Salazar G, et al. Дефицит комплекса BLOC-1 изменяет нацеливание на грузы адапторного белкового комплекса-3. Mol Biol Cell. 2006; 17: 4014–4026. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Salazar G, Zlatic S, Craige B, Peden AA, Pohl J, Faundez V.Белковые комплексы синдрома Германского-Пудлака связываются с фосфатидилинозитол-4-киназой типа II альфа в нейрональных и ненейрональных клетках. J Biol Chem. 2009. 284: 1790–1802. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Schmid EM, McMahon HT. Интеграция молекулярной и сетевой биологии для декодирования эндоцитоза. Природа. 2007; 448: 883–888. [PubMed] [Google Scholar]
• Шмид С.Л., Фролов В.А. Dynamin: функциональная конструкция мембранного катализатора деления. Annu Rev Cell Dev Biol. 2011; 27: 79–105.[PubMed] [Google Scholar]
• Seaman MN. Ретромерный комплекс — рециклинг эндосомного белка и не только. J Cell Sci. 2012; 125: 4693–4702. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Setty SR, Tenza D, Sviderskaya EV, Bennett DC, Raposo G, Marks MS. Клеточно-специфический транспорт ATP7A поддерживает медьзависимую активность тирозиназы в меланосомах. Природа. 2008; 454: 1142–1146. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Setty SR, et al. BLOC-1 необходим для груз-специфической сортировки от вакуолярных ранних эндосом к органеллам, связанным с лизосомами.Mol Biol Cell. 2007. 18: 768–780. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Simons JP, et al. Потеря активности фосфатидилинозитол-4-киназы 2альфа вызывает позднюю дегенерацию аксонов спинного мозга. Proc Natl Acad Sci USA. 2009. 106: 11535–11539. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Starcevic M, Dell’Angelica EC. Идентификация снапина и трех новых белков (BLOS1, BLOS2 и BLOS3 / снижение пигментации) как субъединиц биогенеза комплекса-1 связанных с лизосомами органелл (BLOC-1) J Biol Chem.2004; 279: 28393–28401. [PubMed] [Google Scholar]
• Styers ML, Salazar G, Love R, Peden AA, Kowalczyk AP, Faundez V. Механизм эндолизосомной сортировки взаимодействует с цитоскелетом промежуточных волокон. Mol Biol Cell. 2004. 15: 5369–5382. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Сведлоу Дж. Р., Ху К., Эндрюс П. Д., Роос Д. С., Мюррей Дж. М.. Измерение содержания тубулина в Toxoplasma gondii : сравнение лазерной сканирующей конфокальной и широкопольной флуоресцентной микроскопии.Proc Natl Acad Sci USA. 2002; 99: 2014–2019. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Сведлоу Дж. Р., Седат Дж. У., Агард Д. А.. Деконволюция в оптической микроскопии. В: Янссон П.А., редактор. Деконволюция изображений и спектров. Сан-Диего, Калифорния: Academic Press; 1997. С. 284–307. [Google Scholar]
• Тейлор MJ, Perrais D, Merrifield CJ. Высокоточный обзор молекулярной динамики клатрин-опосредованного эндоцитоза у млекопитающих. PLoS Biol. 2011; 9: e1000604. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Trinkle-Mulcahy L, et al.Идентификация конкретных партнеров взаимодействия белков с использованием количественной масс-спектрометрии и протеомов бус. J Cell Biol. 2008. 183: 223–239. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Valdmanis PN, et al. Мутации в гене KIAA0196 в локусе SPG8 вызывают наследственную спастическую параплегию. Am J Hum Genet. 2007. 80: 152–161. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Велтман Д.М., Insall RH. Белки семейства WASP: их эволюция и физиологические последствия. Mol Biol Cell.2010; 21: 2880–2893. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Вэй А.Х., Синдром Ли В. Хермански-Пудлака: пигментные и непигментные дефекты и их патогенез. Pigment Cell Melanoma Res. 2013; 26: 176–192. [PubMed] [Google Scholar]
• Викнер В., Шекман Р. Слияние мембран. Nat Struct Mol Biol. 2008. 15: 658–664. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Yi L, Donsante A, Kennerson ML, Mercer JF, Garbern JY, Kaler SG. Измененная внутриклеточная локализация и взаимодействие валозин-содержащего белка (p97 VCP) лежат в основе дистальной моторной нейропатии, связанной с ATP7A.Human Mol Genet. 2012; 21: 1794–1807. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Zech T, Calaminus SD, Caswell P, Spence HJ, Carnell M, Insall RH, Norman J, Machesky LM. Активатор Arp2 / 3 WASH регулирует инвазивную миграцию, опосредованную альфа5бета1-интегрином. J Cell Sci. 2011; 124: 3753–3759. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Zeng Y, Ramya TN, Dirksen A, Dawson PE, Paulson JC. Высокоэффективное мечение сиалилированных гликопротеинов на живых клетках. Нат методы. 2009; 6: 207–209.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Zlatic SA, Ryder PV, Salazar G, Faundez V. Выделение лабильных мультибелковых комплексов с помощью in vivo контролируемого клеточного сшивания и иммуномагнитной аффинной хроматографии. J Vis Exp. 2010; pii: 1855. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

Комплекс WASH, эндосомальный активатор Arp2 / 3, взаимодействует с комплексом синдрома Германского – Пудлака BLOC-1 и его грузовой фосфатидилинозитол-4-киназой типа IIα

Мол. Biol Cell.2013 15 июля; 24 (14): 2269–2284.

PV Ryder

^a Кафедра клеточной биологии, Университет Эмори, Атланта, Джорджия 30322

R. Vistein

^b Биологические науки, Университет Карнеги-Меллона, Питтсбург, Пенсильвания 15213

A. Gokhale

a Департамент клеточной биологии, Университет Эмори, Атланта, Джорджия, 30322

MN Seaman

^c Кембриджский институт медицинских исследований / Департамент клинической биохимии, Кембриджский университет, Кембридж CB2 2QR, Соединенное Королевство

M.А. Путенведу

^b Биологические науки, Университет Карнеги-Меллона, Питтсбург, Пенсильвания 15213

В. Фаундес

^a Кафедра клеточной биологии, Университет Эмори, Атланта, Джорджия 30322

Кейт Э. Мостов, редактор мониторинга

Калифорнийский университет, Сан-Франциско

^a Отделение клеточной биологии, Университет Эмори, Атланта, Джорджия 30322

^b Биологические науки, Университет Карнеги-Меллона, Питтсбург, Пенсильвания 15213

^c Кембриджский институт медицинских исследований / Департамент клинической биохимии, Кембриджский университет, Кембридж CB2 2QR, Соединенное Королевство

Получено 12 февраля 2013 г .; Пересмотрено 7 мая 2013 г .; Принята в печать 9 мая 2013 г.

Авторские права © 2013 Ryder et al. Эта статья распространяется Американским обществом клеточной биологии по лицензии авторов. Через два месяца после публикации он становится общедоступным под лицензией Creative Commons License с указанием авторства и некоммерческого использования 3.0 (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/3.0).

«ASCB®», «Американское общество клеточной биологии®» и «Молекулярная биология клетки®» являются зарегистрированными товарными знаками Американского общества клеточной биологии.

Эта статья цитируется в других статьях в PMC.

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы

GUID: BA30A07A-40CD-4CC1-88B7-13C9D028F158

GUID: B4A6060A-6E0D-4CBC-B6CD-0575149F0A33

GUID: 35190B96-B6B0-4753-8759-E8A5825B8BF5

GUID: AA52F3A6-1B0A-4E8B-AA34-541864D

Abstract

Компоненты механизмов биогенеза везикул, такие как белки оболочки, могут взаимодействовать с актиновым цитоскелетом для сортировки грузов по нескольким путям.Однако неизвестно, являются ли эти взаимодействия общим требованием для разнообразных маршрутов трафика эндосом. В этом исследовании мы идентифицируем актиновые регуляторы цитоскелета как ранее нераспознанные интеракторы комплексов, ассоциированных с синдромом Hermansky-Pudlak. Два комплекса, мутировавшие при синдроме Германского-Пудлака, комплекс адаптивного белка-3 и биогенез связанного с лизосомами комплекса органелл-1 (BLOC-1), взаимодействуют и регулируются липидкиназой фосфатидилинозитол-4-киназой типа IIα (PI4KIIα) .Поэтому мы предположили, что PI4KIIα взаимодействует с новыми регуляторами этих комплексов. Чтобы проверить эту гипотезу, мы иммуноаффинно очистили PI4KIIα из меченных изотопами клеточных лизатов для количественной идентификации взаимодействующих веществ. Поразительно, что выделение PI4KIIα предпочтительно кообогащено белками, которые регулируют актиновый цитоскелет, включая факторы обмена гуанина для GTPases семейства Rho, таких как RhoGEF1 и несколько субъединиц комплекса WASH. Мы биохимически подтвердили некоторые из этих взаимодействий PI4KIIα.Важно, что комплекс BLOC-1, комплекс WASH, RhoGEF1 или истощение PI4KIIα изменяют содержание и / или субклеточное распределение BLOC-1-чувствительных грузов PI4KIIα, ATP7A и VAMP7. Мы пришли к выводу, что комплекс синдрома Hermansky-Pudlak BLOC-1 и его груз PI4KIIα взаимодействуют с регуляторами актинового цитоскелета.

ВВЕДЕНИЕ

Везикулярный транспорт — это общий клеточный механизм, с помощью которого органеллы секреторного и эндоцитарного путей избирательно обмениваются компонентами.Этот механизм обмена требует скоординированных шагов, которые включают сортировку и концентрацию груза мембранных белков в формирующихся пузырьках, деформацию и расслоение мембран, направленное движение через цитозоль и слияние в органелле-мишени (Bonifacino and Glick, 2004). Многие из этих шагов требуют механической силы, которая генерируется в путях передачи пузырьков за счет объединения специализированных молекулярных машин. Эти молекулярные машины включают белки оболочки, которые сортируют груз мембранных белков, белки BAR-домена, чтобы ощущать или вызывать деформацию мембраны, динамин GTPase для разрыва мембраны, а также связки и растворимые комплексы рецептора белка прикрепления (SNARE), чувствительного к N -этилмалеимиду (SNARE), для слияние мембран (Kaksonen et al., 2005; Шмид и МакМахон, 2007; МакМахон и Букро, 2011 г .; Викнер и Шекман, 2008; Brocker et al. , 2010; Тейлор и др. , 2011). В то время как некоторые из этих машин по своей природе способны генерировать силы, например, динамин и комплексы слияния SNARE (Schmid and Frolov, 2011; Ferguson and De Camilli, 2012; Gao et al. , 2012), другие требуют ассоциации с актином или цитоскелет микротрубочек. Например, белки оболочки сортируют груз мембранных белков на возникающие везикулы.В дополнение, однако, некоторые белки оболочки также связывают цитоскелетные компоненты как для биогенеза везикул, так и для направленного движения (Nakagawa et al. , 2000; Styers et al. , 2004; Kaksonen et al. , 2006; Delevoye et al. др. , 2009; Anitei и др. , 2010; Anitei and Hoflack, 2012; Mooren и др. , 2012).

Фундаментальный вопрос без ответа касается степени, в которой это цитоскелетное взаимодействие является общим принципом функции белков оболочки.Одним из наиболее хорошо охарактеризованных взаимодействий между аппаратом доставки пузырьков и цитоскелетом является образование пузырьков на плазматической мембране с помощью клатриновой и адапторной оболочки AP-2. В этом пути биогенеза везикул факторы, связанные с оболочкой и оболочкой, такие как белки BAR-домена, локально регулируют полимеризацию и организацию актиновых филаментов. Полимеризация актина в значительной степени зарождается комплексом Arp2 / 3 и его активатором, фактором, способствующим нуклеации, нервным белком синдрома Вискотта – Олдрича (N-WASP; Conner and Schmid, 2003; Kaksonen et al., 2005, 2006; Шмид и МакМахон, 2007; МакМахон и Букро, 2011 г .; Тейлор и др. , 2011 г .; Mooren et al. , 2012). Недавняя идентификация фактора, способствующего зародышеобразованию, который специфически локализуется в эндосомах, гомологе WASP и SCAR (WASH; Derivery et al. , 2009; Gomez and Billadeau, 2009), предполагает, что ассоциация оболочки с актиновым цитоскелетом может быть общий принцип, действующий в генерации пузырьков. Подтверждая эту возможность, истощение WASH приводит к функциональным дефектам рециклинга, путей переноса от эндосомы к Гольджи и от эндосомы к лизосомам (Derivery et al., 2009 г .; Гомес и Билладо, 2009; Gomez et al. , 2012 г .; Дуле и Велч, 2010; Carnell et al. , 2011 г .; Zech et al. , 2011 г .; Harbour et al. , 2012 г .; Hao et al. , 2013; Piotrowski et al. , 2013). Однако на сегодняшний день описано, что WASH взаимодействует только с одним комплексом эндосомной оболочки, ретромерным комплексом, который в первую очередь сортирует грузы по пути от эндосомы к Гольджи (Gomez and Billadeau, 2009; Gomez et al., 2012 г .; Harbour et al. , 2012 г .; Jia et al. , 2012 г .; Моряк, 2012 г .; Hao et al. , 2013; Helfer et al. , 2013). Следовательно, координируется ли эндосомная оболочка с актиновым цитоскелетом в качестве общего принципа, не было проверено.

Мы предоставляем доказательства, подтверждающие эту гипотезу, путем беспристрастной идентификации взаимодействия между комплексом WASH и сортировочными комплексами, связанными с синдромом Германского – Пудлака. Этот синдром генетически определяется дефектами четырех молекулярных комплексов: оболочки адапторного белкового комплекса-3 (AP-3) и биогенеза связанных с лизосомами комплексов органелл от -1 до -3 (BLOC-1 до BLOC-3).Кроме того, генетические дефекты в специфических Rabs и регуляторных ферментах запускают фенотипы, подобные синдрому Hermansky-Pudlak (Bultema and Di Pietro, 2013). Дефекты этих комплексов у млекопитающих и беспозвоночных приводят к гипопигментации, дисфункции тромбоцитов, фиброзу легких и, в некоторых случаях, иммунной дисфункции и неврологическим фенотипам (Newell-Litwa et al. , 2007; Raposo and Marks, 2007; Raposo и др. , 2007; Huizing и др. , 2008; Dell’Angelica, 2009; Wei and Li, 2013).Эти фенотипы являются следствием нарушенного переноса грузов между ранними эндосомами и органеллами-мишенями, такими как связанные с лизосомами органеллы и синаптические пузырьки (Newell-Litwa et al. , 2007; Raposo and Marks, 2007; Raposo et al. , 2007). ; Huizing и др. , 2008; Dell’Angelica, 2009; Wei and Li, 2013). Следовательно, изучение молекул и функциональных механизмов этих комплексов расширяет наше понимание молекулярных основ синдрома Hermansky-Pudlak и позволяет нам проверить фундаментальные вопросы, касающиеся принципов процессов везикулярного транспорта.

Чтобы идентифицировать функциональные механизмы комплексов, связанных с синдромом Германского-Пудлака, мы сосредотачиваемся на прикрепленной к мембране и локализованной в эндосомах липидкиназе, фосфатидилинозитол-4-киназе типа IIα (PI4KIIα; Balla et al. , 2002; Guo ). и др. , 2003; Миноуг и др. , 2006; Крейдж и др. , 2008). Биохимические и генетические данные показывают, что PI4KIIα регулирует и связывает два комплекса, мутировавших при синдроме Германского-Пудлака, AP-3 и BLOC-1 (Craige et al., 2008 г .; Salazar et al. , 2009 г .; Larimore et al. , 2011 г .; Gokhale et al. , 2012а). Поэтому мы предположили, что PI4KIIα будет взаимодействовать с новыми белками, модулирующими функцию BLOC-1 и AP-3. Чтобы проверить эту гипотезу, мы выделили PI4KIIα и его интеракторы путем количественной иммуноаффинной очистки из лизатов поперечно-сшитых клеток in vivo. PI4KIIα предпочтительно коизолирован с белками, которые регулируют полимеризацию актинового цитоскелета, включая комплекс WASH и RhoGEF1.Истощение PI4KIIα, субъединиц BLOC-1, RhoGEF1 или комплекса WASH изменяет содержание других компонентов во взаимодействии PI4KIIα, тем самым устанавливая генетические взаимодействия в дополнение к физическим взаимодействиям. Кроме того, истощение комплекса WASH привело к изменениям в морфологии эндосомы PI4KIIα и неправильной локализации двух грузов BLOC-1, переносчика меди болезни Менкеса ATP7A и лизосомного SNARE, VAMP7. Мы предполагаем, что различные оболочки, такие как clathrin-AP-2, retromer и AP-3-BLOC-1, используют общие принципы для накопления силы или создания дискретных мембранных доменов с помощью локализованной сборки актинового полимера.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Интерактом PI4KIIα обогащает актин-регуляторные белки

PI4KIIα связывает комплексы AP-3 и BLOC-1, и эти взаимодействия регулируют его внутриклеточное распределение (Craige et al. , 2008; Salazar et al. ). , 2009; Ларимор и др. , 2011; Гохале и др. , 2012a). Кроме того, липидкиназная активность PI4KIIα регулирует рекрутирование комплекса оболочки AP-3 и BLOC-1 на эндосомные мембраны (Craige et al., 2008 г .; Salazar et al. , 2009 г.). Поэтому мы предположили, что интеракторы PI4KIIα являются ранее неизвестными регуляторами комплексов AP-3 и BLOC-1, ассоциированных с синдромом Hermansky-Pudlak. Мы проверили эту гипотезу путем выделения эндогенного PI4KIIα и взаимодействующих белков. Чтобы изолировать PI4KIIα, мы продуцировали антитело к пептиду, содержащему мотив сортировки дилейцина, который необходим для взаимодействия PI4KIIα с комплексами AP-3 и BLOC-1 (дополнительный рисунок S1A; Craige et al., 2008 г.). Мутация мотива сортировки дилейцина отменяет распознавание PI4KIIα этим антителом с помощью иммуноблоттинга (дополнительный рисунок S1A). Поэтому мы предположили, что это антитело будет конкурировать с AP-3 за связывание с PI4KIIα и, таким образом, предпочтительно обогащать PI4KIIα, который не связывается с AP-3. Эта стратегия дизайна позволила обогатить PI4KIIα-взаимодействующие белки, которые находятся выше или ниже связывания AP-3. Установив, что это антитело специфически распознает PI4KIIα, мы иммунопреципитировали PI4KIIα из лизатов клеток нейробластомы с минимальными поперечными связями SHSY-5Y (дополнительный рисунок S1A и).Как мы подробно охарактеризовали, эта стратегия перекрестного сшивания: 1) стабилизирует белковые взаимодействия, что позволяет применять строгие стратегии биохимической изоляции, как описано ниже; 2) использует проницаемый для клеток и химически восстанавливаемый сшивающий агент, дитиобис сукцинимидилпропионат (DSP; Lomant and Fairbanks, 1976), который позволяет сшивание in vivo, но поддается идентификации белков с помощью масс-спектрометрии и иммуноблоттинга; и 3) ненасыщает, чтобы минимизировать стабилизацию неродственных белковых комплексов (Salazar et al., 2009 г .; Zlatic et al. , 2010; Gokhale et al. , 2012а, б; Perez-Cornejo et al. , 2012). Окрашивание серебром иммунопреципитированных белковых комплексов выявило несколько полипептидов, которые коизолируются с PI4KIIα (, дорожка 5). Как и ожидалось, некоторые из этих коизолированных полипептидов не были обнаружены в контрольных реакциях, где избыток антигенного пептида PI4KIIα превосходил эндогенный белок за связывание с иммунопреципитационным антителом (полоса 4). Однако при элюировании белковых комплексов из шариков, покрытых антителами, буфером для образца Лэммли высвобождались фоновые полипептиды, которые препятствовали идентификации PI4KIIα и взаимодействующих белков с помощью окрашивания серебром (дорожки 3–5).По этой причине мы элюировали белковые комплексы после иммунопреципитации путем инкубации промытых шариков с избытком антигенного пептида PI4KIIα (, дорожка 7). Эта стратегия иммуноаффинной очистки значительно снизила фоновые контаминанты и иммуноглобулины, что было выявлено окрашиванием серебром и иммуноблоттингом (сравните дорожки 4 и 5 с дорожками 6 и 7). Наконец, иммуноблоттинг продемонстрировал, что наш подход к иммуноаффинной очистке высоко обогащен PI4KIIα (сравните дорожки 2 и 7).

Интерактом PI4KIIα обогащает регулирующие актин белки.(A) PI4KIIα был иммуноаффинно очищен из гомогенатов клеток нейробластомы SHSY-5Y, поперечно сшитых с помощью DSP. PI4KIIα и соизолирующие белки разделяли с помощью SDS-PAGE и окрашивали серебром (дорожка 5). Некоторые полипептиды отсутствуют в контролях, которые включают покрытые антителом шарики без лизата (дорожка 3) или инкубации, в которые был включен избыток антигенного пептида PI4KIIα (дорожка 4). Элюцию гранул проводили буфером для образцов Лэммли (дорожки 3–5). Дорожки 6 и 7 изображают элюаты антигенных пептидов из шариков, аналогичные таковым в дорожках 4 и 5.Иммуноаффинная очистка позволила селективно элюировать коизолирующие белки PI4KIIα на низком фоне (сравните дорожки 6 и 7; дорожки 6 ‘и 7’ отображают полосы 6 и 7 с усиленным контрастом). Стрелкой отмечена полоса, содержащая PI4KIIα. Серебряное пятно представляет собой репрезентативное изображение двух независимых экспериментов. Внизу, иммуноблот PI4KIIα в параллельном наборе анализов, как и в SDS-PAGE, окрашенном серебром. Цепи иммуноглобулина G отмечены звездочками. Ввод составляет 1 и 0,33% для иммунопреципитации и иммуноаффинной очистки соответственно.(B) Графики представляют PI4KIIα и очищающие белки (подробности см. В дополнительной таблице S1). Оси x и y показывают кратность обогащения SILAC и общее количество спектральных отсчетов, используемых для идентификации белка, соответственно. Контрольные точки выделяют PI4KIIα (зеленый) и Nedd4-1. (C) Бирюзовые и красные точки выделяют связанные с актином белки, коизолированные с PI4KIIα. К ним относятся коэффициенты обмена ВВП RhoGEF1, DOCK7 и GEF-h2. Красные точки указывают на связанные с актином белки, которые являются субъединицами или взаимодействующими элементами комплекса WASH: струмпеллин (KIAA0196), SWIP (KIAA1033), Fam21B, FKBP15, кэпирующий белок α и кэпирующий белок β.(D) Синие точки выделяют белки, связанные с переносом через мембрану, коизолированные с PI4KIIα, включая тяжелую цепь клатрина (CLTC), динамин-2 (DNM2) и субъединицу β3A комплекса AP-3 (AP3B1). (E) Анализ функциональных аннотаций идентифицированных белков с использованием аннотаций Gene Ontology выявил преобладание белков, связанных с актином. Обогащение таких категорий, как цитоскелет (30/124 интеракторов) и актиновый цитоскелет (13/124), было значительным при p = 1,62 × 10 ⁻⁷ и 7.67 × 10 ⁻⁷ соответственно. См. Дополнительную информацию в таблице S2. (F) Сетевой анализ предполагаемых компонентов взаимодействия PI4KIIα и субъединиц BLOC-1. PI4KIIα (зеленый), субъединицы BLOC-1 (синий) и субъединицы комплекса WASH (красный) выделены.

Аналитически установив селективный подход к выделению PI4KIIα и взаимодействующих белков, мы выполнили препаративную иммуноаффинную очистку сшитых комплексов PI4KIIα. Мы идентифицировали интеракторы с помощью количественной масс-спектрометрии с использованием мечения стабильных изотопов аминокислотами в культуре клеток (SILAC; Ong et al., 2002; Манн, 2006). Клетки нейробластомы SHSY-5Y выращивали до равновесия либо в среде с легкой меткой, в которой аминокислоты аргинин и лизин содержат изотопы ¹² C и ¹⁴ N (среда R0K0), либо в среде с тяжелой меткой, в которой эти аминокислоты содержат ¹³ C и ¹⁵ N (среда R10K8; дополнительный рисунок S1B). После включения этих изотопных меток аминокислот, PI4KIIα иммунопреципитировали из лизатов меченных светом клеток. В качестве контроля иммунопреципитацию из лизатов меченых тяжелых клеток проводили в присутствии избытка антигенного пептида PI4KIIα (дополнительный рисунок S1B).Как описано ранее, оба образца затем конкурентно элюировали из шариков с избытком антигенного пептида PI4KIIα. Элюированные полипептиды, меченные легкой и тяжелой меткой, смешивали в соотношении 1: 1 для тандемного масс-спектрометрического анализа. Эта очистка позволила обогатить PI4KIIα примерно в 55 раз, и его относительное содержание было представлено 220 спектральными отсчетами (, зеленая точка). Кроме того, мы идентифицировали 701 соизолирующий белок с двумя или более уникальными пептидами. Из общего количества 702 белков 268 были обогащены иммуноаффинной очисткой PI4KIIα более чем в два раза по сравнению с контролем, пороговое значение SILAC, которое мы ранее продемонстрировали, обогащает взаимодействия, которые могут быть подтверждены генетически (Gokhale et al., 2012а, б; Perez-Cornejo et al. , 2012). Однако одним известным ограничением очистки на основе гранул является тенденция белков неспецифически связываться с гранулами, покрытыми антителами (Trinkle-Mulcahy et al. , 2008). Чтобы преодолеть это ограничение, мы отфильтровали любые полипептиды, которые неспецифически связываются либо только с гранулами, либо с гранулами, покрытыми неродственными антителами. Применение этих фильтров позволило идентифицировать 123 соизолирующих белка в дополнение к PI4KIIα для дальнейшего изучения (и дополнительную таблицу S1).

Мы сначала охарактеризовали интерактом PI4KIIα, выполнив функциональный анализ аннотаций 124 идентифицированных белков с использованием аннотаций Gene Ontology (). Этот анализ показал, что белки цитоскелета (30/124) и белки цитоскелета актина (13/124) были обогащены во взаимодействии PI4KIIα по сравнению со случайной выборкой генома человека ( p = 1,62 × 10 ⁻⁷ и 7,67 × 10 ⁻⁷ соответственно). Например, связанные с актином белки в интерактоме PI4KIIα включают регуляторные белки для малых GTPases, такие как RhoGEF1 (ARHGEF1), выделитель цитокинеза 7 (DOCK7) и GEF-h2 (ARHGEF2), которые являются факторами обмена гуанина для RhoA, cdc42. , и Rho-Rac GTPases, соответственно (, бирюзовые точки; Rossman et al., 2005; Birkenfeld et al. , 2008 г .; Blasius et al. , 2009 г .; Aittaleb et al. , 2010). Кроме того, анализ функциональной аннотации показал очень значительное обогащение белков, обозначенных как «транспортные белки, опосредованные везикулами» (13/124), как и было предсказано, учитывая роль PI4KIIα в регуляции AP-3-зависимого биогенеза везикул (; p ). = 1,19 × 10 ⁻³ ; Дополнительная таблица S2). Эти опосредованные везикулами транспортные белки включают тяжелую цепь клатрина, субъединицу β комплекса AP-3 (AP3B1) и динамин-2 (DYN-2;, синие точки).В дополнение к функциональной аннотации мы выполнили сетевой анализ для выявления ранее опубликованных прямых взаимодействий между этими очищающимися белками. Наша цель состояла в том, чтобы идентифицировать функциональные субкомплексы и хабы с высокой связностью с сетями, которые совместно очищаются с PI4KIIα и могут играть роль в AP-3- и BLOC-1-опосредованном биогенезе везикул (; Gokhale et al. , 2012b). По этой причине мы включили в этот анализ восемь субъединиц комплекса BLOC-1. Сетевой анализ выявил присутствие трех из пяти субъединиц комплекса WASH (FAM21B, KIAA0196 и KIAA1033) и трех известных взаимодействующих элементов комплекса WASH (FKBP15, CAPZA1 и CAPZB; красные точки; Campellone and Welch, 2010; Jia et al., 2010; Rottner et al. , 2010; Rotty et al. , 2012). Комплекс WASH локализуется в ранних эндосомах, где, как предполагается, он полимеризует актин для сортировки груза или расщепления везикул, подтверждая роль комплекса WASH в PI4KIIα-регулируемом, BLOC-1-опосредованном биогенезе везикул.

Биохимическое и генетическое подтверждение PI4KIIα-взаимодействующих белков

Мы подтвердили взаимодействия PI4KIIα, идентифицированные с помощью масс-спектрометрии SILAC, путем независимой иммуноаффинной очистки PI4KIIα с последующим иммуноблоттингом для проверки наличия представляющих интерес белков.Мы обнаружили, что PI4KIIα взаимодействует с опосредованными пузырьками транспортными белками, такими как тяжелая цепь клатрина и субъединица паллидина BLOC-1 (дорожки 6 и 7). Взаимодействующие белки были обнаружены только в изоляциях PI4KIIα, но не в контроле, где избыток антигенного пептида использовался, чтобы противостоять иммунопреципитации комплексов PI4KIIα (дорожки 4 и 5). В соответствии с нашими предыдущими сообщениями, обнаружение взаимодействий между PI4KIIα и транспортными белками, опосредованными пузырьками, требует лечения с помощью кросс-линкерного DSP, предположительно потому, что эти ассоциации лабильны и / или временны.Кроме того, мы обнаружили, что PI4KIIα взаимодействует с двумя известными взаимодействующими элементами комплексов BLOC-1 и AP-3 соответственно — антиоксидантным ферментом пероксиредоксин-1 (Prdx-1) и убиквитинлигазой Nedd4-1 (Mossinger et al. , 2012;, дорожки 6 и 7; также см. Салазар и др. , 2009; Гохале и др. , 2012a). Nedd4-1 представляет нижние границы наших порогов значимости с точки зрения спектрального счета и пороговых значений обогащения для нашей количественной оценки SILAC, тем самым подтверждая, что эти пороги минимизируют включение ложноотрицательных результатов в интерактивный PI4KIIα (три спектральных счета, 3.69-кратное обогащение; ). Наконец, мы проверили взаимодействие между PI4KIIα и белками, которые регулируют актиновый цитоскелет, поскольку функциональная аннотация и сетевой анализ показали, что эти взаимодействия были очень значимыми. Мы подтвердили взаимодействие между PI4KIIα и субъединицей струмпеллина комплекса WASH и двумя факторами обмена гуанина для малых GTPases RhoGEF1 и Dock7. Следует отметить, что эти соурификации не требовали перекрестного линкера DSP, что позволяет предположить, что PI4KIIα взаимодействует с этими белками либо с более высоким сродством, либо с более длительным периодом полужизни, чем с белками, связанными с переносом через мембрану (дорожки 6 и 7).Чтобы дополнительно проверить специфичность этих взаимодействий, мы выделили PI4KIIα, помеченный гемагглютинином (HA), из клеток HEK293T путем иммунопреципитации HA. Мы подтвердили присутствие RhoGEF1 в этих белковых комплексах, демонстрируя, что эти взаимодействия могут быть обнаружены независимо от стратегии очистки (, дорожка 3). Взятые вместе, эти результаты указывают на то, что интерактом PI4KIIα обогащает белки, аннотация генной онтологии которых существенно вовлекает их в функцию актина.

Биохимическое подтверждение белков, взаимодействующих с PI4KIIα.(A) PI4KIIα был иммуноаффинно очищен из неперекрестно-сшитых (нечетные дорожки) и DSP-перекрестно-сшитых (четные дорожки) экстрактов растворимых в детергенте клеток нейробластомы SHSY-5Y. Иммунные комплексы были разделены с помощью SDS-PAGE и проанализированы с помощью иммуноблоттинга с антителами против PI4KIIα, тяжелой цепи клатрина (CHC), паллидина, пероксиредоксина-1 (Prdx-1), RhoGEF1, Dock7 и субъединицы комплекса WASH strumpellin и Nedd4-1. Коизолирующие белки не были обнаружены в контрольных реакциях, где был включен избыток антигенного пептида PI4KIIα, чтобы победить эндогенный PI4KIIα (дорожки 4 и 5).Дорожка 3 показывает покрытые антителом шарики, инкубированные в отсутствие клеточного лизата. Входы составляют 0,25%. (B) Клетки HEK293T, временно экспрессирующие HA-меченый PI4KIIα, были DSP-сшиты (дорожки 3 и 4), а растворимые в детергенте экстракты были иммунопреципитированы антителами HA. Иммунные комплексы были разделены с помощью SDS-PAGE и проанализированы с помощью иммуноблоттинга с указанными антителами. RhoGEF1 присутствует в иммунопреципитации НА (дорожка 3), но не в контрольных пептидах вне конкуренции (дорожка 4). Дорожка 2 показывает покрытые антителом шарики, инкубированные в отсутствие клеточного лизата.Входные данные составляют 0,5%, и n = 3. (C, D) Клетки SHSY-5Y, стабильно экспрессирующие помеченную FLAG субъединицу комплекса BLOC-1 (дисбиндин), инкубировали в отсутствие (D, дорожки 1, 4, и 6) или присутствие (C, все дорожки и D, дорожки 2, 5 и 7) сшивающего агента DSP, и растворимые в детергенте экстракты иммунопреципитировали антителами против PI4KIIα (C) или эпитопа FLAG (D). Иммунные комплексы были разделены с помощью SDS-PAGE и проанализированы с помощью иммуноблоттинга с антителами против указанных белков, идентифицированных в интерактоме PI4KIIα.Также включены два груза мембранных белков BLOC-1, v-SNARE VAMP7 и переносчик меди болезни Менкеса ATP7A. Как и в случае A и B, контролями являются антигенные пептиды вне конкуренции (C, дорожка 4 и D, дорожки 6 и 7). Дорожки C2 и D3 показывают покрытые антителом шарики, инкубированные в отсутствие клеточного лизата. Входы составляют 0,5%.

Наш сетевой анализ интерактома PI4KIIα и субъединиц BLOC-1 предположил связи между PI4KIIα-взаимодействующими белками и субъединицами BLOC-1 (). Более того, BLOC-1 регулирует субклеточную локализацию PI4KIIα (Larimore et al., 2011). По этим причинам мы предсказали, что эти ранее нераспознанные связанные с актином взаимодействующие элементы PI4KIIα будут совместно изолироваться с BLOC-1. Чтобы проверить это предсказание, мы использовали линию клеток SHSY-5Y, которая стабильно экспрессирует помеченную FLAG субъединицу дисбиндина BLOC-1. Эта помеченная субъединица включается в функциональные комплексы BLOC-1 (Larimore et al. , 2011; Gokhale et al. , 2012a). Во-первых, мы подтвердили, что эта субъединица BLOC-1 может быть обнаружена при иммуноаффинной очистке PI4KIIα (дорожка 3).Затем мы проверили, будут ли взаимодействовать PI4KIIα в белковых комплексах BLOC-1, выделенных с помощью иммуноаффинной очистки FLAG (дорожки 4 и 5). Как сообщалось ранее, PI4KIIα может быть обнаружен этим методом (дорожка 5; Larimore et al. , 2011). Кроме того, два взаимодействующих элемента PI4KIIα, RhoGEF1 и комплексная субъединица WASH струмпеллин, коизолируются с комплексами BLOC-1 (, дорожка 5). Кроме того, мы также обнаружили присутствие двух известных грузов BLOC-1, переносчика меди болезни Менкеса ATP7A и лизосомного SNARE VAMP7 (Salazar et al., 2006; Setty et al. , 2008 г .; Newell-Litwa et al. , 2009, 2010). Эти взаимодействия не были обнаружены в контролях, в которых избыток пептида FLAG был включен в реакцию, чтобы превзойти FLAG-дисбиндин за связывание с антителом для иммунопреципитации (сравните дорожки 5 и 7). Наши результаты показывают, что выделение белковых комплексов PI4KIIα или BLOC-1 надежно копуризует актин-регуляторный аппарат. Совместная очистка субъединиц PI4KIIα, strumpellin, RhoGEF1 и BLOC-1 указывает на то, что эти белки могут действовать согласованно, чтобы регулировать BLOC-1-зависимый трафик.

Мутация или истощение субъединицы комплекса мембранного транспорта обычно коррелирует с понижающей регуляцией других субъединиц комплекса и с изменениями общего клеточного содержания грузов пути и связанных факторов (Peden et al. , 2002; Kantheti et al. , 2003; Li и др. , 2003; Starcevic and Dell’Angelica, 2004; Jia и др. , 2010). Мы использовали этот принцип для независимого тестирования компонентов интерактома PI4KIIα. Мы предсказали, что пертурбация либо PI4KIIα, либо BLOC-1 будет влиять на содержание компонентов взаимодействия PI4KIIα, если эти белки являются регуляторами BLOC-1-зависимого пути биогенеза везикул.PI4KIIα и две субъединицы BLOC-1, приглушенная и паллидин, были независимо истощены короткой шпильчатой ​​РНК (shRNA) в клетках HEK293T (). Полуколичественный анализ иммуноблоттинга показал, что истощение PI4KIIα активировало содержание RhoGEF1, а также субъединиц AP-3 и BLOC-1. Последнее наблюдение согласуется с существованием трехкомпонентного комплекса между PI4KIIα, AP-3 и BLOC-1 (Salazar et al. , 2009;). Эти отношения между компонентами интерактома PI4KIIα также наблюдались после истощения комплекса BLOC-1 ().Общее клеточное содержание субъединиц PI4KIIα, RhoGEF1 и BLOC-1 было значительно снижено в ответ на истощение либо приглушенного, либо паллидина (). Затем мы проанализировали содержание двух хорошо охарактеризованных грузов BLOC-1, лизосомного SNARE, VAMP7 и переносчика меди, мутировавшего при болезни Менкеса, ATP7A (OMIM 309400; Salazar et al. , 2006; Setty et al. ). , 2008; Newell-Litwa и др. , 2009, 2010). Общее клеточное содержание обоих этих грузов было значительно снижено в BLOC-1-истощенных клетках, но не в PI4KIIα-истощенных клетках (Mann-Whitney U test p <0.05; , красные ящики). Нормальное содержание VAMP7 и ATP7A в клетках, истощенных по PI4KIIα, предполагает, что повышающая регуляция субъединиц комплекса BLOC-1 может быть компенсаторной.

Генетическое подтверждение белков, взаимодействующих с PI4KIIα. (A, D) Клетки HEK293T обрабатывали контрольной siRNA scramble или siRNA, нацеленной на PI4KIIα. (B, D) Клетки HEK293T обрабатывали лентивирусами, несущими контрольную шРНК скремблирования или шРНК, нацеленную на паллидин или приглушенные субъединицы комплекса BLOC-1. (C, E) Клетки меланомы человека MNT-1 обрабатывали лентивирусами, несущими контрольную shRNA scramble или shRNA, нацеленную на субъединицу BLOC-1 паллидин, RhoGEF1 или комплексную субъединицу WASH струмпеллин.Лизаты клеток HEK293T и MNT-1 разделяли с помощью SDS-PAGE, а общее содержание в клетках представляющих интерес белков измеряли с помощью полуколичественного иммуноблоттинга. Коробчатые диаграммы на D и E отображают количественные оценки, где целевой белок выделен синим цветом, а значительно измененные антигены отмечены красным. Затенение серым цветом соответствует 50–100% контроля. Все эксперименты проводили в трех биологических повторностях, по крайней мере, с одним определением на повторность. Все значимые значения p составляют <0,025 и были определены непараметрическим анализом с использованием группового критерия суммы рангов Краскела – Уоллиса с последующим критерием суммы рангов Вилкоксона – Манна – Уитни.Субъединица АР-3 β3A (D) и Hsp90 (D, E) использовали в качестве контроля для сравнений.

Затем мы проверили, влияет ли shRNA-опосредованное истощение BLOC-1, струмпеллина или RhoGEF1 на общее содержание в клетках других компонентов взаимодействия PI4KIIα. Во-первых, мы исследовали последствия истощения BLOC-1 в клеточной линии меланомы MNT-1, типе клеток, в котором локализация BLOC-1 в канальцевых эндосомах была определена на субклеточном уровне с помощью электронной микроскопии (Di Pietro et al., 2006). В соответствии с нашим открытием в клетках HEK293T, общее клеточное содержание PI4KIIα-интерактора RhoGEF1 снижалось в клетках MNT1, лишенных BLOC-1 (). Истощение компонентов интерактома PI4KIIα, RhoGEF1 и струмпеллина, не изменяет общего клеточного содержания субъединиц BLOC-1 (). Однако грузы BLOC-1 VAMP7 и ATP7A были значительно изменены (). Общее клеточное содержание ATP7A увеличивалось в ответ на BLOC-1, RhoGEF1 или истощение струмпеллина в клетках MNT1 (; 2.В 3 ± 0,12–, 2,2 ± 0,46– и 1,6 ± 0,13 раза по сравнению с контролем соответственно). Кроме того, уровни VAMP7 были значительно снижены при истощении BLOC-1, значительно увеличились при истощении RhoGEF1 и не изменились при истощении струмпеллина. Эти данные свидетельствуют о нарушении регуляции стационарных уровней этих грузов BLOC-1 при истощении компонентов взаимодействия PI4KIIα и тем самым устанавливают генетические взаимодействия между компонентами взаимодействия PI4KIIα.

Комплекс WASH и нитчатый актин располагаются на PI4KIIα-положительных ранних эндосомах

Комплекс WASH представляет собой актин-регуляторный комплекс, который локализуется в ранних эндосомах (Derivery et al., 2009 г .; Гомес и Билладо, 2009; Gomez et al. , 2012 г .; Дуле и Велч, 2010; Carnell et al. , 2011 г .; Zech et al. , 2011 г .; Harbour et al. , 2012). Аналогичным образом, PI4KIIα локализуется в ранних эндосомах, где он связывается с BLOC-1 (Balla et al. , 2002; Guo et al. , 2003; Minogue et al. , 2006; Craige et al. , 2008; Салазар и др. , 2009). Таким образом, мы предсказали, что PI4KIIα-положительные эндосомы содержат BLOC-1, комплекс WASH и актин.Чтобы проверить это предсказание, мы сначала отделили эндосомные компартменты от гомогенатов клеток HEK293T с помощью скоростной седиментации сахарозы (Clift-O’Grady et al. , 1998; Lichtenstein et al. , 1998). Как и ожидалось, PI4KIIα соединяется с 35% сахарозой с рецептором трансферрина, эндосомным маркером (). Кроме того, в этих фракциях присутствовали комплексная субъединица WASH струмпеллин, комплексная субъединица BLOC-1 паллидин и актин (). Паллидин и актин преимущественно обнаруживались на вершине градиентов, где осаждаются свободные цитозольные белки (Clift-O’Grady et al., 1998; Lichtenstein et al. , 1998). Присутствие нитевидного актина на PI4KIIα-содержащих эндосомах было подтверждено визуализацией живых клеток флуоресцентно меченного EGFP-PI4KIIα с помощью флуоресцентного зонда LifeAct (; Riedl et al. , 2008). Мы отслеживали флуоресцентно меченые антитела FLAG, связанные с экзофациальной меткой, сконструированной в β2-адренергическом рецепторе (SSF-B2AR;). Мы стимулировали интернализацию комплексов рецептор-FLAG-антитело путем добавления изопротеренола, агониста адренергических рецепторов, для функционального определения ранних эндосом (Puthenveedu et al., 2010). В этих ранних эндосомах разветвленные актиновые сети были обнаружены с помощью cortactin-dsRed (), который был сконцентрирован в основании небольших пальцевидных выступов, обогащенных PI4KIIα. Небольшие количества паллидина и актина, кооседиментирующие и / или колокализующиеся с PI4KIIα и эндосомными маркерами, отражают временный характер этих ассоциаций при анализе в отсутствие кросс-линкерного DSP. Таким образом, мы однозначно идентифицировали, что PI4KIIα и разветвленный актин совместно локализуются в функционально определенных ранних эндосомах.

PI4KIIα, комплексная субъединица WASH струмпеллин и актиновые компоненты цитоскелета на ранних эндосомах. (A, B) Клетки HEK293T были гомогенизированы, и низкоскоростные супернатанты были разделены скоростной седиментацией сахарозы на градиенте сахарозы 10–45%. PI4KIIα и субъединица комплекса WASH струмпеллин ко-седиментируются с 35% сахарозой с эндосомными органеллами, как идентифицировано рецептором трансферрина (TrfR). Цитозольные фракции осаждаются в верхней части градиента (10% сахарозы). (B) Относительное распределение указанных белков для фракционирования, показанного на A.Изображения и профиль распределения представляют два независимых эксперимента. (C) Визуализация живых клеток флуоресцентно меченных PI4KIIα и LifeAct для визуализации нитчатого актина в клетках HEK293T подтвердила присутствие актина в PI4KIIα-положительных органеллах ( n = 12 клеток). (D) Клетки HEK293T, стабильно экспрессирующие PI4KIIα-GFP и сигнальные последовательности FLAG-меченых β2-адренергических рецепторов (SSF-B2AR), временно трансфицировали mCortactin-dsRed и визуализировали через 10 мин после добавления 10 мкМ изопротеренола.Одиночный конфокальный стек был захвачен в трех каналах с интервалом в 1 с. (E) Увеличенное изображение эндосомы, обозначенное стрелкой в ​​A, в течение 10-секундного периода. (F) Схема овального профиля, используемого для создания следов интенсивности флуоресценции вокруг эндосом. (G) Типичный график нормализованной интенсивности флуоресценции для каждого белка в указанной выше эндосоме.

Мы проверили присутствие комплекса WASH в PI4KIIα-положительных эндосомах путем визуализации EGFP-меченных субъединиц комплекса WASH и эндогенного PI4KIIα с помощью деконволюционной микроскопии с высоким разрешением.Wash2-, strumpellin-, SWIP / KIAA1033- и Fam21-EGFP все были тесно связаны с сигналом PI4KIIα (). Эта физическая близость была особенно очевидна в трехмерных проекциях данных z -стека, где субъединицы комплекса WASH, по-видимому, оборачиваются вокруг органелл, содержащих PI4KIIα (). Мы наблюдали низкую степень перекрытия между сигналами наивысшей интенсивности и, таким образом, измерили совместную локализацию strumpellin-EGFP и Wash2-EGFP с эндогенным PI4KIIα с использованием коэффициента колокализации Пирсона.Коэффициент Пирсона составлял 9,1 ± 2,5 и 13,1 ± 1,9 для strumpellin-EGFP и Wash2-EGFP, соответственно, подтверждая низкую корреляцию интенсивности между перекрывающимися сигналами (). Однако мы проверили специфичность этого рассчитанного коэффициента, повернув один канал на 15 ° и проанализировав совместную локализацию PI4KIIα с митохондриальным зондом MitoTracker. Коэффициент колокализации Пирсона между PI4KIIα и MitoTracker был отрицательным, что отражает полное отсутствие перекрытия этих сигналов ().Это наблюдение было подтверждено, поскольку ротация каналов не изменяла отрицательный коэффициент Пирсона между PI4KIIα и MitoTracker. Напротив, вращение либо strumpellin-EGFP, либо Wash2-EGFP на 15 ° снизило коэффициент Пирсона до значений, неотличимых от значений колокализации MitoTracker ( p ≥ 0,05;). Эти результаты показывают, что комплекс WASH и актиновые филаменты располагаются в субдоменах PI4KIIα-содержащих эндосом. Эти находки подтверждают, что аппарат Wash2-actin способен регулировать транспортировку PI4KIIα и др. Грузов BLOC-1 из ранних эндосом.

PI4KIIα колокализуется с комплексом WASH. (A, C) Клетки HEK293T либо временно трансфицировали EGFP-меченными субъединицами комплекса WASH, либо окрашивали зеленым MitoTracker, фиксировали и обрабатывали для непрямой иммунофлуоресцентной микроскопии. Изображения были получены с помощью деконволюционной микроскопии с высоким разрешением. Показаны проекции стопки z . (B, D) Визуализация изоповерхности стека z , созданная с помощью программного обеспечения Imaris. (E) Расчет коэффициента корреляции Пирсона между интенсивностями сигналов strumpellin-EGFP, WASH-EGFP или MitoTracker и эндогенного PI4KIIα.Корреляция пропадала при повороте одного канала на 15 °. Здесь n = 6 для WASH-EGFP, n = 7 для strumpellin-EGFP и n = 9 для MitoTracker-A488. Статистические сравнения проводились с помощью непараметрического анализа с использованием группового критерия суммы рангов Краскела – Уоллиса с последующими индивидуальными критериями суммы рангов Вилкоксона – Манна – Уитни.

Комплекс WASH модулирует нацеливание на грузы BLOC-1

Истощение комплекса WASH характеризуется появлением увеличенных загруженных грузом канальцев из эндосом и неправильной сортировкой груза (Gomez and Billadeau, 2009; Gomez et al., 2012 г .; Harbour et al. , 2012 г .; Jia et al. , 2012 г .; Моряк, 2012 г .; Helfer et al. , 2013). Поэтому мы предположили, что PI4KIIα присутствует в трубчатых структурах, длина которых регулируется комплексом WASH. Чтобы проверить эту гипотезу, мы экспрессировали PI4KIIα-EGFP в клетках HEK293T, стабильно экспрессирующих FLAG-меченный β2-адренергический рецептор, и визуализировали клетки с помощью микроскопии живых клеток. Эндосомы были однозначно идентифицированы по индуцированной лигандом интернализации флуоресцентных антител FLAG, связанных с экзофациальным доменом β2-адренорецептора.Трубочки, содержащие PI4KIIα и / или β2-адренергический рецептор, выходят из ранних эндосом, и их размер увеличивается в клетках, истощенных комплексом WASH (19). В целом размер ранних эндосом, содержащих PI4KIIα и β2-адренергический рецептор, не зависел от дефицита комплекса WASH (). Напротив, истощение BLOC-1 путем нацеливания shRNA на паллидин характеризовалось увеличением этих ранних эндосом без увеличения канальцев (2). Изменения в архитектуре ранних эндосом, содержащих PI4KIIα и β2-адренергический рецептор, за счет истощения комплексов BLOC-1 или WASH подтверждают модель, в которой комплексы WASH во взаимодействии с BLOC-1 регулируют нацеливание грузов BLOC-1 из ранних эндосом.

Истощение паллидина и струмпеллина изменяет морфологию эндосом. (A) Клетки HEK293T, стабильно экспрессирующие сигнальные последовательности FLAG-меченных β2-адренергических рецепторов (SSF-B2AR) и PI4KIIα-EGFP, трансдуцировали лентивирусами scrambled, pallidin или strumpellin shRNA. Клетки, обедненные паллидином, получали изображение через 8 дней после начала трансдукции, а клетки, истощенные по струмпеллину, отображали через 5 дней после трансдукции. Клетки выращивали в условиях отбора после 2-го дня трансдукции. Все нокдауны сравнивали с параллельной трансдукцией скремблированной кшРНК.Изображения представляют собой максимальные проекции трех конфокальных срезов, снятых с интервалами 0,3 мкм. (B) Частотная гистограмма окружности эндосомы для клеток, обработанных скремблированной (синий) или паллидиновой (красный) shРНК. Вставка слева изображает вероятностный график тех же данных. Значение p , определенное непараметрическим критерием Колмогорова – Смирнова. Здесь n = 150 для контрольных клеток и n = 117 для клеток, обедненных паллидином. (C) Процент клеток, экспрессирующих скремблированную или струмпеллиновую shРНК, отображающих эндосомные канальцы.Отбор клеток выполняли в канале SSF-B2AR и ослепляли на PI4KIIα перед интернализацией антитела FLAG, затем визуализировали через 15 минут после добавления 10 мкМ изопротеренола. Значение p определяли непараметрическим точным критерием Фишера. Здесь n = 112 для контрольных клеток и n = 101 для клеток, обедненных паллидином.

Мы предсказали, что дефицит комплекса WASH изменит субклеточное распределение грузов BLOC-1, если эти комплексы действуют по одному и тому же пути.Чтобы проверить это предсказание, мы обработали клетки меланомы MNT1 кшРНК, нацеленной на субъединицу струмпеллина комплекса WASH или контроль скремблирования. Мы оценили уровень на клеточной поверхности двух грузов BLOC-1: переносчика меди Менкеса ATP7A и лизосомного белка SNARE VAMP7 (Salazar et al. , 2006; Setty et al. , 2008; Newell-Litwa et al. , 2009, 2010). Как описано ранее, мы наблюдали увеличение общего клеточного содержания ATP7A в ~ 1,5 раза при истощении комплекса WASH (дорожки 1–4).Однако уровни ATP7A на клеточной поверхности увеличиваются в 3,3 ± 0,8 раза при истощении комплекса WASH (дорожки 5 и 6; среднее значение ± SEM). Сходным образом уровни VAMP7 на клеточной поверхности увеличивались в 2,5 ± 0,6 раза при истощении комплекса WASH по сравнению с контролем, тогда как общие клеточные уровни VAMP7 были умеренно, но незначительно затронуты (полосы 5 и 6 и). Это увеличение клеточной поверхности было специфическим для грузов BLOC-1, а не глобальных возмущений, так как общее клеточное содержание и уровни рецептора трансферрина на клеточной поверхности не были затронуты в клетках, истощенных комплексом WASH ().Более того, окрашивание серебром общего биотинилированного белка клеточной поверхности не показало глобального увеличения белков клеточной поверхности из-за истощения комплекса WASH (). Таким образом, грузы BLOC-1 не попадают на поверхность клетки при истощении комплекса WASH. Эти данные подтверждают модель, в которой комплексы WASH изменяют движение грузов BLOC-1.

Истощение комплекса WASH изменяет субклеточное распределение грузов BLOC-1. (A) Клетки меланомы MNT1 обрабатывали кшРНК, направленной против субъединицы струмпеллина комплекса WASH или контроля скремблирования.Белки клеточной поверхности метили поверхностным биотинилированием и выделяли стрептавидиновыми шариками. Репрезентативные иммуноблоты показывают увеличение поверхностного содержания ATP7A и Vamp7, двух грузов BLOC-1, в истощении комплекса WASH. (B) Рецептор трансферрина (TrfR) измеряли в качестве контроля. Окрашивание выделенных белков серебром не выявило глобального снижения содержания белков на клеточной поверхности (сравните дорожки 5 и 6). (C) Количественная оценка поверхностной экспрессии представляющих интерес белков при истощении комплекса WASH по сравнению с контролем скремблирования.Данные являются средними ± SEM. Мы обнаружили значительное увеличение грузов ATP7A и Vamp7 в BLOC-1 в 3,3 ± 0,8 раза и 2,5 ± 0,6 раза, соответственно. Рецептор трансферрина существенно не изменился. Значение p определяли с помощью непараметрического критерия суммы рангов Вилкоксона – Манна – Уитни. Всего было n = 8 определений из четырех независимых экспериментов.

ОБСУЖДЕНИЕ

В этом исследовании мы идентифицировали ранее нераспознанные компоненты пути сортировки мембранных белков, затронутые при синдроме Hermansky – Pudlak, путем выделения заякоренной в мембране липидкиназы PI4KIIα.PI4KIIα связывает и регулирует два комплекса, мутировавших при синдроме Германского-Пудлака, комплексы AP-3 и BLOC-1, посредством мотива сортировки дилейцина и его киназной активности (Craige et al. , 2008; Salazar et al. , 2009; Ларимор и др. , 2011; Гохале и др. , 2012a). Мы поэтому предположили, что PI4KIIα взаимодействует с нераспознанными компонентами пути транспорта везикул, требующих комплекса BLOC-1 – AP-3 – PI4KIIα. PI4KIIα может взаимодействовать с этими компонентами либо одновременно со связыванием с AP-3 и BLOC-1, и / или на стадиях, предшествующих или следующих за связыванием с этими комплексами.Поэтому мы разработали стратегию для обогащения взаимодействующих PI4KIIα перед и после события распознавания мотива сортировки дилейцина PI4KIIα. Для достижения этой цели мы получили антитело против пептида из 20 остатков PI4KIIα, который содержит сортирующий мотив ERQPLL. Мутации этого мотива в ERQPAA достаточно для предотвращения распознавания PI4KIIα этим антителом при иммуноблоттинге. Хотя мотив ERQPLL присутствует в пяти других белках, кодируемых в геноме человека, ни один из этих белков не обогащен во взаимодействии PI4KIIα, что гарантирует, что это антитело специфически распознает PI4KIIα (www.mrc-lmb.cam.ac.uk/genomes/madanm/harvey/). Мы использовали это антитело для иммуноаффинной очистки PI4KIIα из меченных изотопами клеточных лизатов (SILAC), что позволило количественно идентифицировать взаимодействующие белки по сравнению с неспецифическими загрязнителями и иммуноглобулинами (Ong et al. , 2002; Mann, 2006; Zlatic et al. , 2010; Гохале и др. , 2012a). Поразительно, что выделение PI4KIIα предпочтительно кообогащено белками, которые регулируют актиновый цитоскелет, включая факторы обмена гуанина для GTPases семейства Rho, RhoGEF1, DOCK7 и GEF-h2, а также нескольких субъединиц комплекса WASH.Кроме того, PI4KIIα соизолирован с мембранными белками, такими как тяжелая цепь клатрина и субъединица β3A комплекса AP-3. Эти комплексы, транспортирующие через мембрану, коизолированы с PI4KIIα при более низкой стехиометрии по сравнению с регуляторами актина, как и предполагалось в нашей стратегии выделения. Мы биохимически подтвердили некоторые из этих взаимодействий PI4KIIα. Кроме того, мы предсказали, что если компоненты взаимодействия PI4KIIα будут взаимодействовать, то нарушение этих белков изменит общее содержание в клетке других компонентов взаимодействия.Исходя из этого руководящего обоснования, мы установили, что генетическое истощение самого PI4KIIα, комплекса BLOC-1, RhoGEF1 или комплекса WASH изменяет общее клеточное содержание либо компонентов взаимодействия PI4KIIα, либо грузов BLOC-1, переносчика меди болезни Менкеса ATP7A и лизосомный SNARE VAMP7 (Salazar et al. , 2006; Setty et al. , 2008; Newell-Litwa et al. , 2009, 2010). Мы пришли к выводу, что эти новые интеракторы PI4KIIα биохимически и генетически взаимодействуют с компонентами актинового цитоскелета.Мы предпочитаем модель, в которой грузы мембранных белков сортируются с помощью BLOC-1-зависимого механизма в трубчатые носители, размер которых контролируется комплексом WASH, возможно, за счет генерирования силы для разрыва мембраны.

Мы сосредоточили наши усилия на описании последствий этих взаимодействий для комплекса WASH. Wash2 представляет собой фактор, способствующий зародышеобразованию I типа, который связывает комплекс Arp2 / 3 для локального зародышеобразования и организации полимеризации разветвленных актиновых филаментов (Derivery et al., 2009 г .; Jia et al. , 2010; Велтман и Инсолл, 2010; Rotty et al. , 2012). Комплекс WASH локализуется в трубчатых доменах ранних эндосом, где предполагается, что полимеризация актина создает локализованные мембранные домены для сортировки грузов и / или регулирует морфологию канальцев путем рассечения мембраны (Gomez and Billadeau, 2009; Gomez et al. , 2012; Duleh и Welch, 2010, 2012; Harbour и др., , 2012; Helfer, и др., , 2013). Наша работа идентифицирует комплекс WASH как ранее неизвестный интерактор BLOC-1 и PI4KIIα.Это утверждение основано на следующих выводах и обосновании. Мы обнаружили, что субъединицы комплекса WASH локализуются в органеллах, содержащих PI4KIIα, и соосаждены с субъединицами комплекса BLOC-1, что согласуется с предыдущим сообщением о том, что Wash2 взаимодействует с субъединицей BLOS2 комплекса BLOC-1 с помощью дрожжевого двухгибридного анализа и иммунопреципитации меченые субъединицы (Monfregola et al. , 2010). Кроме того, мы обнаружили, что PI4KIIα содержится в небольших трубчатых структурах, которые исходят из ранних эндосом, которые функционально помечены интернализованными β-адренергическими рецепторами.Если BLOC-1 и комплекс WASH координируются, чтобы регулировать морфологию ранних эндосомных канальцев и / или сортировку грузов, то мы предсказали, что морфологические и неправильные фенотипы будут возникать при нарушении белковых комплексов. Во-первых, мы предсказали ранние морфологические изменения эндосом в истощении комплексов BLOC-1 и WASH, ведущие либо к увеличению эндосом, либо к эндосомным канальцам. Действительно, мы обнаружили, что истощение BLOC-1 увеличивает размер функционально идентифицированных ранних эндосом без увеличения размера канальцев.Этот фенотип согласуется с нашими предыдущими находками, что эндосомы увеличиваются в размере после истощения AP-3, BLOC-1 или PI4KIIα (Salazar et al. , 2009). Кроме того, при истощении комплекса WASH мы обнаружили удлинение ранних эндосомных PI4KIIα-содержащих канальцев, что согласуется с предыдущими сообщениями, демонстрирующими увеличение длины эндосомных канальцев при истощении Wash2 (Derivery et al. , 2009; Gomez and Billadeau, 2009). Во-вторых, мы предсказали неправильную сортировку груза BLOC-1 при истощении комплекса WASH, что может указывать на нарушение потока грузов или мембраны из эндосом.Мы сконцентрировались на неправильном переносе специфических эндолизосомных грузов на поверхность клетки, что является характерным фенотипом для дефицитов AP-3, BLOC-1 и PI4KIIα (Dell’Angelica et al. , 1999; Peden et al. , 2002; Ди Пьетро и др. , 2006; Салазар и др. , 2006; Сетти и др. , 2007; Бауст и др. , 2008). Два груза BLOC-1, ATP7A и VAMP7, неправильно локализуются на поверхности клетки при истощении комплекса WASH. Этот фенотип был специфическим для эндолизосомного груза, поскольку уровни на клеточной поверхности рецептора, который подвергается конститутивной рециклингу, рецептора трансферрина, не изменились.

Как BLOC-1 и комплекс WASH механистически координируются, чтобы регулировать морфологию эндосом и сортировку грузов? Полимеризация актина выполняет множество функций в сортировке и транспортировке мембранных белков, включая создание доменов для пространственной организации механизма сортировки, обеспечение механической поддержки деформации мембраны во время отпочкования везикул, создание силы, способствующей расслоению мембраны везикул, и продвижение носителей после завершения бутонизации (Qualmann и др. , 2000).Фенотип неправильной сортировки груза BLOC-1, наблюдаемый после истощения комплекса WASH, предполагает роль Wash2 на стадиях, происходящих на или выше мембранного разрыва пузырьков. Полимеризация актина комплексом WASH, как предполагается, генерирует силу, необходимую для разрыва мембраны, — гипотеза, ожидающая проверки путем биохимического восстановления in vitro (Bear, 2009; Derivery et al. , 2009; Gomez and Billadeau, 2009; Rotty et al. , 2012). Однако эта модель согласуется с бинарной биохимической ассоциацией субъединиц комплекса WASH, PI4KIIα, BLOC-1 и грузов ATP7A и VAMP7 BLOC-1, описанной здесь и в нашей предыдущей работе (Salazar et al., 2009 г .; Larimore et al. , 2011). Кроме того, эта модель предсказывает, что эти компоненты взаимодействуют одновременно, что еще предстоит задокументировать. Альтернативная гипотеза состоит в том, что PI4KIIα и комплекс BLOC-1 независимо связываются с комплексом WASH, чтобы регулировать его активность. Независимо от того, действуют ли BLOC-1 и PI4KIIα совместно или как независимые факторы, мы предполагаем, что комплекс WASH действует как общий механизм нуклеации разветвленной полимеризации актина в эндосомах с пространственной специфичностью или специфичностью груза, определяемой различными предшествующими дополнительными факторами, такими как оболочка и / или липидные модификации.

PI4KIIα является интересным кандидатом в активатор комплекса WASH из-за его способности продуцировать PI4P (Balla et al. , 2002; Barylko et al. , 2002). Предполагается, что субъединица Fam21 комплекса WASH, компонент интерактома PI4KIIα, локализует WASH на эндосомных мембранах путем связывания фосфоинозитидов и субъединиц комплекса сортировки белков мембраны, таких как субъединица Vps35 ретромерного комплекса (Gomez and Billadeau, 2009; Harbor et al. al., 2012 г .; Helfer et al. , 2013). Fam21 связывает PI4P in vitro, липидный продукт PI4KIIα (Jia et al. , 2010). PI4KIIα и PI4P могут, таким образом, либо рекрутировать комплекс WASH на ранние эндосомные мембраны, либо стабилизировать комплекс на этих мембранах для функции внутри AP-3-BLOC-1 или множественных путей сортировки. Как обсуждается ниже, генетическое нарушение субъединицы комплекса WASH и PI4K2A вызывает общие нейродегенеративные фенотипы у пациентов и мышей, поддерживая регуляторную роль PI4KIIα в локализации WASH (Valdmanis et al., 2007; Simons et al. , 2009 г .; Clemen et al. , 2010). Кроме того, компоненты интерактома PI4KIIα могут регулировать активацию комплекса WASH. Общей чертой факторов, способствующих зародышеобразованию, таких как Wash2, является их регуляция и активация малыми GTPases. Регуляторная GTPase для комплекса WASH остается неуловимой в клетках млекопитающих. У Drosophila melanogaster описано генетических взаимодействий между Rho и Wash2 (Liu et al. , 2009).Высокостехиометрическая ассоциация фактора обмена гуанина RhoA, RhoGEF1, с PI4KIIα и сходство между истощением струмпеллина и истощением RhoGEF1 в клетках MNT1 предполагают регуляторный механизм между этими двумя взаимодействующими элементами PI4KIIα. Будущие эксперименты необходимы для проверки точных молекулярных и функциональных отношений между PI4KIIα, RhoGEF1, комплексом WASH и комплексом BLOC-1.

В дополнение к расширению нашей концепции пути везикулярного транспорта, контролируемого комплексом синдрома Германского-Пудлака BLOC-1, наши результаты имеют новое значение для понимания нейродегенеративных заболеваний, которые влияют на аксоны центральных или периферических мотонейронов, таких как наследственная спастическая параплегия (HSP).Точечные мутации в субъединице комплекса WASH струмпеллин вызывают аутосомно-доминантный HSP (OMIM 610657), который характеризуется дегенерацией аксонов, проецирующихся в спинной мозг из моторной коры головного мозга (Valdmanis et al. , 2007; Clemen et al. , 2010). Более 50 генов были связаны с HSP у человека (Finsterer et al. , 2012). Общей темой этого заболевания является дегенерация центральных нейронов с длинными аксонами, предположительно из-за высокой нагрузки на поддержание синапса, удаленного от тела соответствующей клетки.В соответствии с этой темой, многие из 50 идентифицированных генов представляют собой комплексы переноса через мембрану эндосом (Blackstone, 2012). Не описано никаких взаимодействий между струмпеллином и другими генами, вызывающими HSP, что затрудняет размещение струмпеллина и комплекса WASH в клеточной структуре, чтобы понять, как мутации в белке струмпеллина приводят к заболеванию. Недавнее исследование показало, что субъединицы струмпеллина, содержащие мутации, вызывающие заболевание HSP, собираются в комплексы WASH, которые локализуются в ранних эндосомах нейронов и не имеют очевидных последствий для рециклинга β-адренергических рецепторов, опосредованного ретромерным комплексом (Freeman et al., 2013). Наши данные предполагают, что компоненты взаимодействия PI4KIIα могут быть альтернативным путем, нарушенным этими мутациями. Эта гипотеза подтверждается HSP-подобным фенотипом, который возникает после целенаправленного разрушения PI4KIIα у мышей (Simons et al. , 2009). Помимо роли PI4KIIα в дегенерации центральных мотонейронов, наши данные предполагают связь с механизмами болезни в дегенерации аксонов периферических мотонейронов. Точечные мутации ATP7A-карго BLOC-1 у людей вызывают дегенерацию периферических моторных аксонов (Kennerson et al., 2010; Yi et al. , 2012). В этой статье мы обнаружили, что ATP7A неправильно локализован в клетках, лишенных струмпеллина. Кроме того, PI4KIIα сам по себе является грузом BLOC-1, что указывает на то, что он также может неправильно локализоваться в пертурбациях струмпеллина, которые вызывают HSP у людей. Поэтому мы предполагаем, что нарушение компонентов взаимодействия PI4KIIα может вносить вклад в патофизиологию дегенерации аксонов центральных и периферических мотонейронов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Антитела и культура клеток

Антитела, использованные в этом исследовании, перечислены в дополнительной таблице S3.Антитело PI4KIIα, используемое здесь для иммунопреципитации, вестерн-блоттинга и иммунофлуоресцентной микроскопии, было получено против последовательности 51-PGHDRERQPLLDRARGAAAQ-70 и описано в Larimore et al. (2011). Мы получили этот антигенный пептид путем индивидуального пептидного синтеза (Bio-Synthesis, Lewisville, TX). Антигенный пептид разбавляли до 20 мМ исходного раствора в 0,5 M MOPS, pH 7,4 и хранили при -80 ° C.

Клетки

HEK293T и SHSY-5Y (Американская коллекция типовых культур, Манассас, Вирджиния) поддерживали в DMEM с 4.5 г / л глюкозы, 1-глутамина и пирувата натрия (Cellgro, Manassas, VA) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS; HyClone, Logan, UT) и 100 мкг / мл пенициллина / стрептомицина (HyClone) при 37 ° C и 10% CO ₂ . Клетки MNT1 поддерживали в среде DMEM с добавлением 20% среды AIM-V (Life Technologies, Карлсбад, Калифорния), 10% FBS (инактивированный нагреванием при 65 ° C в течение 60 мин) и 100 мкг / мл пенициллина / стрептомицина при 37 ° C. и 5% CO ₂ .

Для мечения SILAC клетки выращивали либо в легкой среде, содержащей только ¹² C и ¹⁴ N аминокислот аргинина и лизина (R0K0), либо в тяжелой среде, содержащей ¹³ C и ¹⁵ N в этих аминокислотах. аминокислоты (R10K8).Все реагенты для мечения SILAC были получены от Dundee Cell Products (Данди, Великобритания). Клетки выращивали за семь пассажей, чтобы гарантировать максимальное включение этих аминокислот. Наша предыдущая работа показала, что эти условия приводят к включению этих аминокислот в общий клеточный пул> 97,5% (Ong and Mann, 2006; Gokhale et al. , 2012a; Perez-Cornejo et al. , 2012).

ДНК-экспрессирующие конструкции

Были использованы следующие экспрессионные конструкции PI4KIIα: PI4KIIα-EGFP WT, PI4KIIα-HA WT, PI4KIIα-HA D308A и PI4KIIα-HA LL60,61AA (Craige et al., 2008 г.). Конструкция дисбиндина с меткой FLAG описана в предыдущей работе (Gokhale et al. , 2012a). Wash2-EGFP, Strumpellin-EGFP, KIAA1033-EGFP и FAM21-EGFP были описаны ранее (Harbor et al. , 2010). Кортактин-dsRed и β2-адренергические рецепторы, меченные сигнальной последовательностью FLAG (SSF-B2AR), были описаны ранее (Kaksonen et al. , 2000; Puthenveedu et al. , 2010).

Иммунопреципитация и иммуноаффинная хроматография

Клетки нейробластомы SHSY-5Y выращивали до слияния и минимально сшивали, как описано ранее (Zlatic et al., 2010; Gokhale et al. , 2012а, б; Perez-Cornejo et al. , 2012). Вкратце, клетки быстро перемещали из инкубатора на ледяную баню и дважды промывали ледяным фосфатно-солевым буфером (PBS) с добавлением CaCl ₂ (0,1 мМ) и MgCl ₂ (1 мМ) (PBS- Ca-Mg). После этой промывки клетки инкубировали в течение 2 часов в 1 мМ DSP, разведенном в PBS-Ca-Mg или контроле только в диметилсульфоксидном носителе. После сшивания реакцию DSP гасили добавлением 25 мМ Трис, pH 7.4, раствор 15 мин. Затем клетки дважды промывали ледяным PBS-Ca-Mg и лизировали в течение 30 минут в буфере A (150 мМ NaCl, 10 мМ 4- (2-гидроксиэтил) -1-пиперазинэтансульфоновая кислота [HEPES], 1 мМ этиленгликоль. тетрауксусная кислота [EGTA], 0,1 мМ MgCl ₂ ) с 0,5% Triton X-100, дополненным полной антипротеазой (Roche, Indianapolis, IN). После лизиса обломки клеток соскребали с планшетов и лизаты центрифугировали при 16 100 × г в течение 15 мин. Супернатант собирали и разбавляли до 1 мг / мл.Для иммунопреципитации 500 мкг этого осветленного клеточного лизата наносили на 30 мкл магнитных шариков Dynal (Invitrogen, Carlsbad, CA), покрытых представляющим интерес антителом для иммунопреципитации. Эти реакции иммунопреципитации инкубировали в течение 2 ч с вращением «конец за концом» при 4 ° C. Для контроля конкуренции пептида PI4KIIα антигенный пептид PI4KIIα включали в реакцию иммунопреципитации в концентрации 40 мкМ. Для конкурентных контролей FLAG был включен пептид 3X FLAG в концентрации 340 мкМ, как описано ранее (Gokhale et al., 2012а; Perez-Cornejo et al. , 2012). Для конкурентных контролей HA пептид HA был включен в концентрации 10 мкМ. После 2-часовой инкубации шарики пять раз промывали в буфере A с 0,1% Triton X-100. Затем белки элюировали из шариков либо кипячением в буфере для образцов Лэммли при 75 ° C в течение 5 минут, либо инкубированием с антигенным пептидом в течение 2 часов на льду. Пептиды разбавляли в буфере для лизиса до их концентрации элюирования (антигенный пептид PI4KIIα, 200 мкМ; пептид 3X FLAG, 340 мкМ).Образцы разделяли электрофорезом в SDS – PAGE с последующим окрашиванием серебром или иммуноблоттингом для обнаружения отдельных белков. Для анализа SILAC было проведено 18 иммуноаффинных хроматографий и 18 контрольных реакций. Элюаты этих реакций объединяли и осаждали трихлоруксусной кислотой, чтобы сконцентрировать образцы для SDS-PAGE и масс-спектрометрического анализа. Образцы были проанализированы для идентификации белка SILAC в MS Bioworks (Анн-Арбор, Мичиган) и Emory CND Proteomics Facility (Атланта, Джорджия).Меченые SILAC образцы разделяли на 4–12% минигеле Bis-Tris Novex (Invitrogen) с использованием буферной системы MOPS и окрашивали кумасси, и дорожку вырезали на 20 равных сегментов с использованием сетки. Кусочки геля обрабатывали с использованием робота (ProGest; Digilab, Мальборо, Массачусетс), как описано (Gokhale et al. , 2012a; Perez-Cornejo et al. , 2012).

Переходный нокдаун белка и анализ иммуноблоттинга

Для нокдауна shRNA-опосредованного белка конструкции в pLKO.1 вектор был получен от Open Biosystems (Хантсвилл, Алабама). Идентификаторы клонов для целевых конструкций следующие: приглушенный (Bloc1s5), TRCN0000129117; паллидин (Bloc1s6), TRCN0000122781; струмпеллин, TRCN0000128018; и RhoGEF1, TRCN0000033567. Вектор управления скремблированием был получен от Addgene (Кембридж, Массачусетс; Vector 1864). Клетки HEK293T, засеянные в шестилуночные планшеты, трансфицировали 1 мкг ДНК конструкции shRNA в течение ночи с помощью Lipofectamine 2000 (Life Technologies) в соответствии с инструкциями производителя.Клетки MNT1 и SHSY-5Y высевали в шестилуночные планшеты и обрабатывали 1-2 мкл лентивирусных частиц с высоким титром, содержащих соответствующую лентивирусную конструкцию. Ядро вирусного вектора Emory NINDS подготовило все лентивирусы с высоким титром. Через два дня после доставки конструкции shРНК трансформированные клетки отбирали обработкой 2 мкг / мл пуромицина (Invitrogen) в подходящей питательной среде, как описано. Общая продолжительность лечения составляла 5–10 дней, чтобы обеспечить эффективный нокдаун интересующих белков.Олигонуклеотидные последовательности малых интерферирующих РНК (миРНК) против PI4KIIα и контролей, а также процедуры были описаны ранее (Craige et al. , 2008; Salazar et al. , 2009).

Для иммуноблот-анализа уровней белка клетки выращивали до слияния в шестилуночных планшетах. Клетки обрабатывали лентивирусами в течение 7 дней. Планшеты быстро перемещали на ледяную баню и сразу же дважды промывали ледяным PBS. Затем клетки помещали в буфер A и центрифугировали при 16 100 × г в течение 1 мин для получения осадка.Клетки MNT1 инкубировали в течение 10 мин в буфере А перед подъемом для облегчения высвобождения из планшета для культуры ткани. Осадки клеток ресуспендировали в 100 мкл буфера А, дополненного полной антипротеазой. Затем клетки лизировали ультразвуком (три цикла по пять импульсов по 1 с). Лизаты разбавляли до 1 мг / мл и разделяли с помощью SDS-PAGE и иммуноблоттинга. На лунку загружали от 5 до 15 мкг клеточного лизата.

Иммунофлуоресцентная микроскопия

Клетки HEK293T трансфицировали в шестилуночных планшетах 1 мкг конструкции ДНК с помощью липофектамина 2000 в течение 4 часов, а затем переводили в среду для выращивания.Через 24 ч клетки высевали на покровные стекла, покрытые матригелем. На следующий день покровные стекла перемещали на лед, дважды промывали ледяным PBS, а затем фиксировали 4% параформальдегидом в PBS в течение 20 минут. Для клеток, окрашенных красителем A488 MitoTracker (Invitrogen), клетки инкубировали с 500 нМ красителем MitoTracker, разведенным в питательной среде в течение 30 мин. После инкубации клетки немедленно фиксировали при 37 ° C в 4% параформальдегиде. После фиксации все покровные стекла дважды промывали PBS, а затем блокировали и обеспечивали проницаемость в течение 30 мин при комнатной температуре в растворе 0.02% сапонина (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури), 15% лошадиной сыворотки (HyClone), 2% бычьего сывороточного альбумина (Roche) и 1% желатина рыбьей кожи (Sigma-Aldrich) в PBS. Первичные антитела (дополнительная таблица S3) разводили в блокирующем растворе и применяли в течение 30 мин при 37 ° C. После инкубации первичных антител покровные стекла трижды промывали блокирующим раствором. Покровные стекла инкубировали в течение 30 минут при 37 ° C с вторичными антителами, конъюгированными с флуорофором (дополнительная таблица S3), разведенными в блокирующем растворе.Покровные стекла промывали два раза в блокирующем растворе, один раз в PBS и один раз в сверхчистой воде, а затем помещали на предметные стекла в установочной среде Gelvatol (Sigma-Aldrich).

Для микроскопии деконволюции фиксированных клеток изображения получали на инвертированном микроскопе Zeiss Axiovert 200M (Carl Zeiss, Jena, Germany) с набором фильтров Sedat (Chroma Technology, Brattleboro, VT). Программное обеспечение Slidebook 4.0 OSX использовалось для запуска многоволновой системы трехмерной микроскопии с широким полем поля (Intelligent Imaging Innovations, Денвер, Колорадо).Изображения были визуализированы с помощью 100-кратного масляного дифференциального интерференционного контрастного объектива с числовой апертурой 1,4 и сняты с помощью охлаждаемой камеры Cool-Snap HQ с зарядовой связью научного уровня (Photometrics, Tucson, AZ) с чипом ORCA-ER (Hamamatsu Photonics, Хамамацу, Япония). Изображения были получены при длине волны 200 нм между плоскостями z . Для удаления расфокусированного света использовался ограниченный итерационный алгоритм деконволюции с ограничением ближайшего соседа с гауссовым сглаживанием (Swedlow и др. , 1997, 2002).Изображения были экспортированы из программного обеспечения Slidebook 4.0 как 8-битные серии TIF. Для анализа колокализации из сфокусированных плоскостей изображения вычитали фон с помощью 10-пиксельного алгоритма катящегося шарика на Фиджи (ImageJ; Национальные институты здравоохранения, Бетесда, Мэриленд). Была выбрана представляющая интерес область, непосредственно окружающая отдельные ячейки, и коэффициент Пирсона был рассчитан с помощью подключаемого модуля Coloc 2. Трехмерные реконструкции были созданы из деконволютированных 8-битных изображений серии TIF, импортированных в Imaris 6.3.1 с использованием ручного определения порога и минимального ограничения громкости в 4 вокселя (Bitplane Scientific Software, Цюрих, Швейцария).

Для визуализации живых клеток EGFP-меченного PI4KIIα и меченного mCherry пептида LifeAct клетки HEK293T, экспрессирующие флуоресцентно меченые белковые конструкции, высевали в покрытые матригелем культуральные чашки со стеклянным дном (Matek Corporation, Ashland, MA). Перед визуализацией клетки поддерживали в ростовой среде HEK293T, как описано, при 37ºC и 10% CO ₂ . Непосредственно перед визуализацией применялась среда для визуализации, состоящая из сбалансированного солевого раствора Хэнка за вычетом фенолового красного и NaHCO ₂ (Sigma-Aldrich) с добавлением 10% FBS (HyClone).Клетки получали с помощью инвертированного микроскопа Nikon TE2000 (Nikon Instruments, Мелвилл, Нью-Йорк), оснащенного гибридным сканером Perfect Focus и камерой для регулирования температуры до 37 ° C и 5% CO ₂ . Изображения были получены с помощью масляного объектива с числовой апертурой 100 ×, 1,49 и наборов фильтров 500–550 / 570–620 с использованием программного обеспечения NIS-Elements AR 3.1 (Nikon). Клетки поочередно возбуждали лазерами с длиной волны 488 и 568 нм каждые 4,25 с, и было получено одно изображение конфокальной плоскости.Изображения были экспортированы в виде 8-битных серий TIF в программе NIS-Elements, а рисунки были скомпилированы в Photoshop (Adobe, Сан-Хосе, Калифорния).

Для визуализации живых клеток PI4KIIα с мечеными функционально меченными эндосомами флуоресцентные метки были взяты из экспрессированных белковых конструкций (GFP и dsRed) или антитела против FLAG M1, конъюгированного с красителем Alexa 647. Клетки выращивали на покровных стеклах и поддерживали в 10% FBS (Life Technologies), DMEM с высоким содержанием глюкозы (HyClone) и отображали в Opti-MEME (Life Technologies) с 10% FBS и забуферивали до pH 7.4 с 40 мМ HEPES. Конфокальные изображения живых клеток получали на системе Revolution XD Spinning Disk (Андор, Белфаст, Великобритания) с инвертированным микроскопом Nikon Eclipse Ti. Объектив, использованный для захвата, представлял собой флуоресцентный объектив с числовой апертурой 100 × / 1,49 от компании Nikon с полным внутренним отражением. И микроскоп, и объективы были помещены в шкаф для контроля температуры, поддерживаемый на уровне 37 ° C. Источниками света служили твердотельные лазеры с длиной волны 488, 561 и 647 нм, а изображения получали на камеру электронного умножителя с зарядовой связью iXON + 897 с использованием Andor iQ.Анализ изображений проводился на необработанных изображениях в ImageJ. Изображения не подвергались никаким изменениям, кроме назначения цвета и яркости / контраста для многоканальных изображений. Для оценки канальцев слепым методом отбирали клетки в канале β2-адрегенергического рецептора. Мы считали, что клетка имеет фенотип канальцев, если она содержит более одного объекта, который примерно в четыре раза длиннее, чем ширина в диапазоне размеров эндосом. Клетки были поставлены в фокус с использованием только канала β2-дрегенергического рецептора перед агонистом, чтобы избежать смещения при выборе клеток с фенотипом.Все имена файлов были рандомизированы для слепой оценки.

Фракционирование клеток

Конфлюэнтные клетки HEK293T дважды промывали ледяным PBS, а затем переносили во внутриклеточный буфер (38 мМ аспартат калия, 38 мМ глутамат калия, 38 мМ глюконат калия, 20 мМ MOPS-KOH, pH 7,2, 5 мМ восстановленный глутатион, 5 мМ карбонат натрия, 2,5 мМ сульфат магния, 2 мМ EGTA). Клетки центрифугировали при 800 × г для получения осадка, а затем ресуспендировали в минимальном объеме внутриклеточного буфера, дополненного 5-кратной концентрацией полной антипротеазы.Клетки гомогенизировали с использованием устройства для взлома клеток с зазором 12 мкм (Clift-O’Grady et al. , 1998; Lichtenstein et al. , 1998). От 200 до 250 мкл гомогената (450-800 мкг) наносили слоями на 10-45% градиенты сахарозы, забуференные 20 мМ MOPS (pH 7,2), которые получали с использованием Gradient Master (Biocomp Instruments, Фредериктон, Канада). Градиенты сахарозы центрифугировали в течение 1 ч при 210 000 × g при 4 ° C в роторе Beckman SW55Ti и фракции анализировали с помощью иммуноблоттинга.Показатели преломления сахарозы для каждой фракции измеряли рефрактометром (Leica, Wetzlar, Германия).

Поверхностная маркировка и извлечение стрептавидина

После 7 дней обработки лентивирусами, нацеленными на скрембл или струмпеллин, планшеты сливающихся клеток MNT1 перемещали в ледяную баню и дважды промывали ледяным PBS-Ca-Mg (0,1 мМ CaCl ₂ и 1 мМ MgCl ₂ в PBS). Все использованные растворы были ледяными при нанесении на клетки, и клетки поддерживали на ледяной бане на всем протяжении.После промываний клетки инкубировали в 1 мМ растворе периодата натрия (Sigma-Aldrich), приготовленном в PBS-Ca-Mg, в течение 30 мин, после чего раствор периодата удаляли и гасящий раствор 1 мМ глицерина в PBS-Ca-Mg. был добавлен (Zeng et al. , 2009). Затем клетки дважды промывали PBS-Ca-Mg и наносили раствор для лигирования биотина из 100 мкМ аминооксибиотина (Biotium, Hayward, CA) и 10 мМ анилина (Sigma-Aldrich) на 90 мин. После лигирования биотина клетки дважды промывали PBS-Ca-Mg и лизировали в течение 30 мин в буфере A с 0.5% Triton X-100, дополненный полной антипротеазой. Эта процедура биотинилирования основана на образующемся периодатом альдегиде на сиаловых кислотах. Этот процесс катализируется анилин-зависимым лигированием с соответствующей меткой. Катализ анилином ускоряет лигирование, облегчая реакцию с низкими концентрациями аминооксибиотина при нейтральном pH для мечения большинства сиалилированных гликопротеинов клеточной поверхности (Zeng et al. , 2009). После лизиса обломки клеток соскребали с планшетов и лизаты центрифугировали при 16 100 × г в течение 15 мин.Супернатант собирали и разбавляли до 0,2 мг / мл. Небольшой объем (50 мкл) покрытых нейтр-авидином агарозных шариков (Thermo Scientific, Waltham, MA) предварительно дважды промывали в буфере A с 0,1% Triton X-100, и 100 мкг клеточного лизата инкубировали с шариками в течение 2 часов. с непрерывным вращением при 4 ° C. Затем шарики промывали пять раз в буфере A с 0,1% Triton X-100 в течение 5 минут с вращением «конец за концом» при 4 ° C. Белки элюировали из шариков кипячением в буфере для образцов Лэммли при 75 ° C в течение 5 минут, и образцы анализировали с помощью SDS-PAGE с последующим окрашиванием серебром или иммуноблоттингом.

Вычислительный и статистический анализ

Функциональная аннотация гена для набора PI4KIIα-взаимодействующих белков (дополнительная таблица S2) была выполнена с использованием терминов базы данных для аннотаций, визуализации и интегрированного обнаружения (DAVID, версия 6.7) и генной онтологии (GO). (Деннис и др. , 2003; Хуанг да и др. , 2007). Плагин Cytoscape Enrichment Map использовался для отображения совпадения терминов генной онтологии в Cytoscape (версия 2.8.3; Merico et al., 2010). Размер узла был сопоставлен с количеством генов в категории GO, а цвет узла был сопоставлен со значением p для обогащения данной категории. Для сетевого анализа была построена карта сетевого взаимодействия с использованием GeneGo Metacore (версия 6.11, сборка 41105) для взаимодействующих с PI4KIIα белков (дополнительная таблица S1) и субъединиц BLOC-1. Сеть была визуализирована в Cytoscape, и цвет узлов был сопоставлен с интересующими белками.

Условия экспериментов сравнивали с помощью программы KaleidaGraph, версия 4.1.3 (Synergy Software, Reading, PA) или StatPlus Mac Built5.6.0pre / Universal (AnalystSoft, Ванкувер, Канада). Данные представлены в виде прямоугольных диаграмм, отображающих четыре квартиля данных, причем «прямоугольник» содержит два средних квартиля, разделенных медианой. Верхний и нижний квартили представлены одиночными линиями, отходящими от прямоугольника.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами Национальных институтов здравоохранения ({«type»: «entrez-nucleotide», «attrs»: {«text»: «GM077569», «term_id»: «221372554»}} } GM077569 и NS42599) и Детский центр нейробиологии CHOA В.F. P.V.R. был поддержан стипендией F31NS0765 Национальной исследовательской службы. Этот исследовательский проект частично поддержан Интегрированным ядром микроскопии клеточной визуализации Университета Эмори и вирусными ядрами Национального института неврологических расстройств и инсульта Национального института неврологии Эмори, грантом P30NS055077. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Используемые сокращения:

90bis7 РНК

ATP7A	АТФаза Cu ++, транспортирующая альфа-полипептид
BLOC	биогенез комплекса органелл, связанных с липосомами
DSP	зеленый флуоресцентный протеин
HA	гемагглютинин
ВЭЖХ	высокоэффективная жидкостная хроматография
HPS		Hermansky-Pudlak МС	масс-спектрометрия
МС / МС	тандемная масс-спектрометрия
PI4KIIα	фосфатидилинозитол-4-киназа типа IIα
8 PY4P 90spositol 90spit48		90sposit	PI4 солевой раствор с фосфатным буфером
SILAC	мечение стабильных изотопов аминокислотами в клеточной культуре
миРНК	малые интерферирующие
РНК	shRNA		рецептор коротких шпилек
VAMP7	мембранный белок, связанный с везикулами 7

ССЫЛКИ

• Aittaleb M, Boguth CA, Tesmer JJ.Структура и функция факторов обмена генов нуклеотидов, регулируемых гетеротримерным G-белком. Mol Pharmacol. 2010. 77: 111–125. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Anitei M, Hoflack B. Динамика мостиковой мембраны и цитоскелета в секреторных и эндоцитарных путях. Nat Cell Biol. 2012; 14: 11–19. [PubMed] [Google Scholar]
• Anitei M, Stange C, Parshina I, Baust T, Schenck A, Raposo G, Kirchhausen T., Hoflack B. Белковые комплексы, содержащие CYFIP / Sra / PIR121, координируют передачу сигналов Arf1 и Rac1 во время клатрин-AP -1-покрытый биогенез носителя в TGN.Nat Cell Biol. 2010. 12: 330–340. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Балла А., Туйметова Г., Баршишат М., Гейзт М., Балла Т. Характеристика изоформ фосфатидилинозитол-4-киназы типа II выявила ассоциацию ферментов с эндосомными везикулярными компартментами. J Biol Chem. 2002; 277: 20041–20050. [PubMed] [Google Scholar]
• Барылко Б., Влодарски П., Биннс Д.Д., Гербер С.Х., Эрнест С., Судхоф Т.С., Гричин Н., Албанези Дж.П. Анализ каталитического домена фосфатидилинозитол-4-киназы II типа.J Biol Chem. 2002; 277: 44366–44375. [PubMed] [Google Scholar]
• Baust T, Anitei M, Czupalla C, Parshyna I, Bourel L, Thiele C, Krause E, Hoflack B. Белковые сети, поддерживающие функцию AP-3 в нацеливании на белки лизосомных мембран. Mol Biol Cell. 2008; 19: 1942–1951. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Bear JE. Сортировка эндосом в WASH. Dev Cell. 2009. 17: 583–584. [PubMed] [Google Scholar]
• Биркенфельд Дж., Налбант П., Юн Ш., Бокоч Г. М.. Клеточные функции GEF-h2, Rho-GEF, регулируемого микротрубочками: измененная активность GEF-h2 является решающим фактором патогенеза заболевания.Trends Cell Biol. 2008. 18: 210–219. [PubMed] [Google Scholar]
• Blackstone C. Клеточные пути наследственной спастической параплегии. Annu Rev Neurosci. 2012; 35: 25–47. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Блазиус А.Л., Брандл К., Крозат К., Ся Й, Хованант К., Кребс П., Смарт Н.Г., Замполли А., Руджери З.М., Бейтлер Б.А. Мыши с мутациями Dock7 имеют общую гипопигментацию и белые пятна, но демонстрируют нормальную неврологическую функцию. Proc Natl Acad Sci USA. 2009. 106: 2706–2711.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Bonifacino JS, Glick BS. Механизмы почкования и слияния пузырьков. Клетка. 2004. 116: 153–166. [PubMed] [Google Scholar]
• Брокер С., Энгельбрехт-Вандре С., Унгерманн С. Мультисубъединичные связывающие комплексы и их роль в слиянии мембран. Curr Biol. 2010; 20: R943 – R952. [PubMed] [Google Scholar]
• Бултема Дж. Дж., Ди Пьетро С. М.. Rab32 и Rab38, специфичные к типу клеток, взаимодействуют с повсеместным механизмом биогенеза лизосом для синтеза специализированных органелл, связанных с лизосомами.Малые GTPases. 2013; 4: 16–21. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Campellone KG, Welch MD. Гонка вооружений нуклеаторов: клеточный контроль сборки актина. Nat Rev. Mol Cell Biol. 2010; 11: 237–251. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Карнелл М., Зеч Т., Каламинус С.Д., Ура С., Хагедорн М., Джонстон С.А., Май Р.С., Солдати Т., Маски Л.М., Insall RH. Полимеризация актина, вызванная WASH, вызывает извлечение V-АТФазы и нейтрализацию везикул перед экзоцитозом. J Cell Biol. 2011; 193: 831–839.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Clemen CS, et al. Струмпеллин — новый валозин-содержащий белок связывающий партнер, связывающий наследственную спастическую параплегию с заболеваниями агрегации белков. Головной мозг. 2010; 133: 2920–2941. [PubMed] [Google Scholar]
• Клифт-О’Грейди Л., Деснос К., Лихтенштейн Ю., Фаундез В., Хорнг Дж. Т., Келли Р. Б.. Восстановление биогенеза синаптических пузырьков из клеточных мембран PC12. Методы. 1998. 16: 150–159. [PubMed] [Google Scholar]
• Коннер С.Д., Шмид С.Л.Регулируемые порталы входа в камеру. Природа. 2003; 422: 37–44. [PubMed] [Google Scholar]
• Craige B, Salazar G, Faundez V. Фосфатидилинозитол-4-хиназа типа II альфа содержит мотив сортировки AP-3 и киназный домен, которые необходимы для трафика эндосом. Mol Biol Cell. 2008; 19: 1415–1426. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Delevoye C, et al. AP-1 и KIF13A координируют сортировку и позиционирование эндосом во время биогенеза меланосом. J Cell Biol. 2009. 187: 247–264.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Dell’Angelica EC. AP-3-зависимая торговля людьми и болезни: первое десятилетие. Curr Opin Cell Biol. 2009; 21: 552–559. [PubMed] [Google Scholar]
• Dell’Angelica EC, Shotelersuk V, Aguilar RC, Gahl WA, Bonifacino JS. Измененный трафик лизосомных белков при синдроме Германского-Пудлака из-за мутаций в бета-субъединице 3A адаптера AP-3. Mol Cell. 1999; 3: 11–21. [PubMed] [Google Scholar]
• Деннис Дж., Младший, Шерман Б.Т., Хосак Д.А., Ян Дж., Гао В., Лейн ХК, Лемпицки Р.А.ДЭВИД: База данных для аннотаций, визуализации и интегрированного обнаружения. Genome Biol. 2003; 4: P3. [PubMed] [Google Scholar]
• Derivery E, Sousa C, Gautier JJ, Lombard B, Loew D, Gautreau A. Активатор Arp2 / 3 WASH контролирует деление эндосом через большой мультипротеиновый комплекс. Dev Cell. 2009; 17: 712–723. [PubMed] [Google Scholar]
• Ди Пьетро С. М., Фалькон-Перес Дж. М., Тенза Д., Сетти С. Р., Маркс М. С., Рапосо Дж., Dell’Angelica EC. BLOC-1 взаимодействует с BLOC-2 и комплексом AP-3, облегчая перенос белков в эндосомы.Mol Biol Cell. 2006; 17: 4027-4038. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Duleh SN, Welch MD. WASH и комплекс Arp2 / 3 регулируют форму и транспорт эндосом. Цитоскелет (Хобокен) 2010; 67: 193–206. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Duleh SN, Welch MD. Регуляция переноса интегрина, клеточной адгезии и миграции клеток с помощью WASH и комплекса Arp2 / 3. Цитоскелет (Хобокен) 2012; 69: 1047–1058. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Ferguson SM, De Camilli P.Динамин, ГТФаза, ремоделирующая мембраны. Nat Rev Mol Cell Biol. 2012; 13: 75–88. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Finsterer J, Loscher W, Quasthoff S, Wanschitz J, Auer-Grumbach M, Stevanin G. Наследственные спастические параплегии с аутосомно-доминантным, рецессивным, X-сцепленным или материнским признаком наследства. J Neurol Sci. 2012; 318: 1–18. [PubMed] [Google Scholar]
• Freeman C, Seaman MN, Reid E. Наследственный белок спастической параплегии strumpellin: характеристика нейронов и влияние патологических мутаций на сборку и функцию комплекса WASH.Biochim Biophys Acta. 2013; 1832: 160–173. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Gao Y, Zorman S, Gundersen G, Xi Z, Ma L, Sirinakis G, Rothman JE, Zhang Y. Отдельные воссозданные нейронные комплексы SNARE застегиваются на три различных этапа. Наука. 2012; 337: 1340–1343. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Gokhale A, Larimore J, Werner E, So L, Moreno-De-Luca A, Lese-Martin C, Lupashin VV, Smith Y, Faundez V. Количественная протеомика и Генетический анализ фактора восприимчивости к шизофрении дисбиндин выявляет новые роли в биогенезе комплекса органелл, связанных с лизосомами 1.J Neurosci. 2012a; 32: 3697–3711. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Gokhale A, Perez-Cornejo P, Duran C, Hartzell HC, Faundez V. Комплексная стратегия идентификации стехиометрических взаимодействий с мембранными белками. Сотовый Логист. 2012b; 2: 1–8. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Gomez TS, Billadeau DD. Комплекс WASH, содержащий FAM21, регулирует ретромер-зависимую сортировку. Dev Cell. 2009; 17: 699–711. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Gomez TS, Gorman JA, de Narvajas AA, Koenig AO, Billadeau DD.Дефекты движения в фибробластах, нокаутированных по WASH, происходят из-за разрушенных эндосомных и лизосомных сетей. Mol Biol Cell. 2012; 23: 3215–3228. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Guo J, Wenk MR, Pellegrini L, Onofri F, Benfenati F, De Camilli P. Фосфатидилинозитол-4-киназа типа IIalpha отвечает за активность фосфатидилинозитол-4-киназы, связанную с синаптические везикулы. Proc Natl Acad Sci USA. 2003; 100: 3995–4000. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Хао Й. Х., Дойл Дж. М., Раманатан С., Гомес Т. С., Цзя Д., Сюй М., Чен З. Дж., Билладо Д. Д., Розен М. К., Поттс П. Р..Регуляция WASH-зависимой полимеризации актина и транспорта белков путем убиквитинирования. Клетка. 2013; 152: 1051–1064. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Harbour ME, Breusegem SY, Antrobus R, Freeman C, Reid E, Seaman MN. Карго-селективный ретромерный комплекс является центром рекрутирования белковых комплексов, которые регулируют динамику эндосомных канальцев. J Cell Sci. 2010; 123: 3703–3717. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Harbour ME, Breusegem SY, Seaman MN. Рекрутирование эндосомного комплекса WASH опосредуется удлиненным «хвостом» связывания Fam21 с ретромерным белком Vps35.Биохим Дж. 2012; 442: 209–220. [PubMed] [Google Scholar]
• Helfer E, Harbour ME, Henriot V, Lakisic G, Sousa-Blin C, Volceanov L, Seaman MN, Gautreau A. Эндосомное рекрутирование комплекса WASH: активные последовательности и мутации, нарушающие взаимодействие с ретромер. Biol Cell. 2013; 105: 191–207. [PubMed] [Google Scholar]
• Хуанг да В. и др. Ресурсы DAVID по биоинформатике: расширенная база данных аннотаций и новые алгоритмы для лучшего извлечения биологии из больших списков генов. Nucleic Acids Res.2007; 35: W169 – W175. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Huizing M, Helip-Wooley A, Westbroek W., Gunay-Aygun M, Gahl WA. Нарушения биогенеза лизосомальных органелл: клиническая и молекулярная генетика. Анну Рев Геномикс Хум Генет. 2008. 9: 359–386. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Джиа Д., Гомес Т.С., Билладо Д.Д., Розен М.К. Множественные повторяющиеся элементы в хвосте FAM21 связывают регуляторный комплекс актина WASH с ретромером. Mol Biol Cell. 2012; 23: 2352–2361.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Джиа Д., Гомес Т.С., Метлагель З., Уметани Дж., Отвиновски З., Розен М.К., Билладо Д.Д. Регуляторы актина WASH и WAVE семейства белков синдрома Вискотта-Олдрича (WASP) контролируются аналогичными структурно родственными комплексами. Proc Natl Acad Sci USA. 2010; 107: 10442–10447. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Kaksonen M, Peng HB, Rauvala H. Ассоциация кортактина с динамическим актином в ламеллиподиях и на эндосомальных пузырьках.J Cell Sci. 2000; 113: 4421–4426. [PubMed] [Google Scholar]
• Каксонен М., Торет С.П., Друбин Д.Г. Модульная конструкция аппарата эндоцитоза, опосредованного клатрином и актином. Клетка. 2005; 123: 305–320. [PubMed] [Google Scholar]
• Каксонен М., Торет С.П., Друбин Д.Г. Использование динамики актина для клатрин-опосредованного эндоцитоза. Nat Rev Mol Cell Biol. 2006; 7: 404–414. [PubMed] [Google Scholar]
• Кантети П., Диас М.Э., Педен А.Е., Сеонг Е.Э., Долан Д.Ф., Робинсон М.С., Ноэбельс Дж. Л., Бурмейстер М.Л.Генетический и фенотипический анализ мутанта мыши mh (2J), аллеля Ap3d, вызванного вставкой элемента IAP. Мамм Геном. 2003. 14: 157–167. [PubMed] [Google Scholar]
• Kennerson ML, et al. Миссенс-мутации в гене переносчика меди ATP7A вызывают Х-сцепленную дистальную наследственную моторную нейропатию. Am J Hum Genet. 2010. 86: 343–352. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Larimore J, et al. Фактор восприимчивости к шизофрении дисбиндин и связанный с ним комплекс сортируют грузы от тел клеток к синапсу.Mol Biol Cell. 2011; 22: 4854–4867. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Li W, et al. Синдром Германского-Пудлака типа 7 (HPS-7) является результатом мутантного дисбиндина, члена биогенеза связанного с лизосомами комплекса органелл 1 (BLOC-1) Nat Genet. 2003. 35: 84–89. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Lichtenstein Y, Desnos C, Faundez V, Kelly RB, Clift-O’Grady L. Везикуляция и сортировка эндосом, полученных из PC12, in vitro. Proc Natl Acad Sci USA. 1998; 95: 11223–11228.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Лю Р., Абреу-Бланко М.Т., Барри К.С., Линардопулу Е.В., Осборн Г.Э., Паркхерст С.М. Wash действует ниже Rho и связывает линейные и разветвленные факторы нуклеации актина. Разработка. 2009. 136: 2849–2860. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Ломант А.Дж., Фэрбенкс Г. Химические исследования расширенных биологических структур: синтез и свойства расщепляемого белка сшивающего реагента [35S] дитиобис (сукцинимидилпропионат) J Mol Biol.1976; 104: 243–261. [PubMed] [Google Scholar]
• Манн М. Функциональная и количественная протеомика с использованием SILAC. Nat Rev. Mol Cell Biol. 2006; 7: 952–958. [PubMed] [Google Scholar]
• McMahon HT, Boucrot E. Молекулярный механизм и физиологические функции клатрин-опосредованного эндоцитоза. Nat Rev. Mol Cell Biol. 2011; 12: 517–533. [PubMed] [Google Scholar]
• Мерико Д., Иссерлин Р., Стюкер О., Эмили А., Бадер Г. Д.. Карта обогащения: сетевой метод визуализации и интерпретации обогащения набора генов.PloS One. 2010; 5: e13984. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Minogue S, Waugh MG, De Matteis MA, Stephens DJ, Berditchevski F, Hsuan JJ. Фосфатидилинозитол-4-киназа необходима для эндосомного переноса и деградации рецептора EGF. J Cell Sci. 2006; 119: 571–581. [PubMed] [Google Scholar]
• Монфрегола Дж., Наполитано Дж., Д’Урсо М., Лаппалайнен П., Урсини М.В. Функциональная характеристика белка синдрома Вискотта-Олдрича и гомолога рубца (WASH), бимодульного фактора, способствующего нуклеации, способного взаимодействовать с биогенезом связанной с лизосомами субъединицы 2 органеллы (BLOS2) и гамма-тубулина.J Biol Chem. 2010; 285: 16951–16957. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Мурен О.Л., Галлетта Б.Дж., Купер Дж.А. Роль сборки актина в эндоцитозе. Анну Рев Биохим. 2012. 81: 661–686. [PubMed] [Google Scholar]
• Mossinger J, Wieffer M, Krause E, Freund C., Gerth F, Krauss M, Haucke V. Функция фосфатидилинозитол-4-киназы IIальфа в эндосомах регулируется убиквитинлигазой Itch. EMBO Rep. 2012; 13: 1087–1094. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Nakagawa T., Setou M, Seog D, Ogasawara K, Dohmae N, Takio K, Hirokawa N.Новый мотор, KIF13A, транспортирует маннозо-6-фосфатный рецептор к плазматической мембране посредством прямого взаимодействия с комплексом AP-1. Клетка. 2000; 103: 569–581. [PubMed] [Google Scholar]
• Newell-Litwa K, Chintala S, Jenkins S, Pare JF, McGaha L, Smith Y, Faundez V. Hermansky-Pudlak, белковые комплексы, AP-3 и BLOC-1, по-разному регулируют пресинаптический состав в полосатом теле и гиппокампе. J Neurosci. 2010. 30: 820–831. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Newell-Litwa K, Salazar G, Smith Y, Faundez V.Роль комплексов BLOC-1 и AP-3 в сортировке грузов в синаптические везикулы. Mol Biol Cell. 2009; 20: 1441–1453. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Ньюэлл-Литва К., Сеонг Э., Бурмейстер М., Фаундез В. Нейрональные и ненейрональные функции механизма сортировки AP-3. J Cell Sci. 2007; 120: 531–541. [PubMed] [Google Scholar]
• Ong SE, Blagoev B, Kratchmarova I., Kristensen DB, Steen H, Pandey A, Mann M. Мечение стабильных изотопов аминокислот в культуре клеток, SILAC, как простой и точный подход к экспрессии протеомика.Mol Cell Proteom. 2002; 1: 376–386. [PubMed] [Google Scholar]
• Онг С.Э., Манн М. Практический рецепт мечения стабильных изотопов аминокислотами в культуре клеток (SILAC) Nat Protoc. 2006; 1: 2650–2660. [PubMed] [Google Scholar]
• Педен А.А., Радж Р.Э., Луи У.В., Робинсон М.С. Сборка и функция комплексов AP-3 в клетках, экспрессирующих мутантные субъединицы. J Cell Biol. 2002. 156: 327–336. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Perez-Cornejo P, Gokhale A, Duran C, Cui Y, Xiao Q, Hartzell HC, Faundez V.Аноктамин 1 (Tmem16A) Ca2 + -активированный хлоридный канал стехиометрически взаимодействует с сетью эзрин-радиксин-моэзин. Proc Natl Acad Sci USA. 2012; 109: 10376–10381. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Piotrowski JT, Gomez TS, Schoon RA, Mangalam AK, Billadeau DD. WASH-нокаутные Т-клетки демонстрируют дефектный перенос рецепторов, пролиферацию и эффекторную функцию. Mol Cell Biol. 2013; 33: 958–973. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Puthenveedu MA, Lauffer B, Temkin P, Vistein R, Carlton P, Thorn K, Taunton J, Weiner OD, Parton RG, von Zastrow M.Последовательно-зависимая сортировка рециклирующих белков с помощью стабилизированных актином эндосомных микродоменов. Клетка. 2010. 143: 761–773. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Квалманн Б., Кессельс М.М., Келли Р.Б. Молекулярные связи между эндоцитозом и актиновым цитоскелетом. J Cell Biol. 2000; 150: F111 – F116. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Raposo G, Marks MS. Меланосомы — темные органеллы просветляют транспорт через эндосомную мембрану. Nat Rev. Mol Cell Biol. 2007. 8: 786–797. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Raposo G, Marks MS, Cutler DF.Органеллы, связанные с лизосомами: специализация компартментов после Гольджи. Curr Opin Cell Biol. 2007; 19: 394–401. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Riedl J, et al. Lifeact: универсальный маркер для визуализации F-актина. Нат методы. 2008; 5: 605–607. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Россман К.Л., Дер С.Дж., Сондек Дж. GEF означает: включение ГТФаз RHO с факторами обмена гуаниновых нуклеотидов. Nat Rev Mol Cell Biol. 2005; 6: 167–180. [PubMed] [Google Scholar]
• Rottner K, Hanisch J, Campellone KG.WASH, WHAMM и JMY: регуляция комплекса Arp2 / 3 и не только. Trends Cell Biol. 2010. 20: 650–661. [PubMed] [Google Scholar]
• Rotty JD, Wu C, Bear JE. Новое понимание регуляции и клеточных функций комплекса ARP2 / 3. Nat Rev Mol Cell Biol. 2012; 14: 7–12. [PubMed] [Google Scholar]
• Salazar G, et al. Дефицит комплекса BLOC-1 изменяет нацеливание на грузы адапторного белкового комплекса-3. Mol Biol Cell. 2006; 17: 4014–4026. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Salazar G, Zlatic S, Craige B, Peden AA, Pohl J, Faundez V.Белковые комплексы синдрома Германского-Пудлака связываются с фосфатидилинозитол-4-киназой типа II альфа в нейрональных и ненейрональных клетках. J Biol Chem. 2009. 284: 1790–1802. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Schmid EM, McMahon HT. Интеграция молекулярной и сетевой биологии для декодирования эндоцитоза. Природа. 2007; 448: 883–888. [PubMed] [Google Scholar]
• Шмид С.Л., Фролов В.А. Dynamin: функциональная конструкция мембранного катализатора деления. Annu Rev Cell Dev Biol. 2011; 27: 79–105.[PubMed] [Google Scholar]
• Seaman MN. Ретромерный комплекс — рециклинг эндосомного белка и не только. J Cell Sci. 2012; 125: 4693–4702. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Setty SR, Tenza D, Sviderskaya EV, Bennett DC, Raposo G, Marks MS. Клеточно-специфический транспорт ATP7A поддерживает медьзависимую активность тирозиназы в меланосомах. Природа. 2008; 454: 1142–1146. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Setty SR, et al. BLOC-1 необходим для груз-специфической сортировки от вакуолярных ранних эндосом к органеллам, связанным с лизосомами.Mol Biol Cell. 2007. 18: 768–780. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Simons JP, et al. Потеря активности фосфатидилинозитол-4-киназы 2альфа вызывает позднюю дегенерацию аксонов спинного мозга. Proc Natl Acad Sci USA. 2009. 106: 11535–11539. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Starcevic M, Dell’Angelica EC. Идентификация снапина и трех новых белков (BLOS1, BLOS2 и BLOS3 / снижение пигментации) как субъединиц биогенеза комплекса-1 связанных с лизосомами органелл (BLOC-1) J Biol Chem.2004; 279: 28393–28401. [PubMed] [Google Scholar]
• Styers ML, Salazar G, Love R, Peden AA, Kowalczyk AP, Faundez V. Механизм эндолизосомной сортировки взаимодействует с цитоскелетом промежуточных волокон. Mol Biol Cell. 2004. 15: 5369–5382. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Сведлоу Дж. Р., Ху К., Эндрюс П. Д., Роос Д. С., Мюррей Дж. М.. Измерение содержания тубулина в Toxoplasma gondii : сравнение лазерной сканирующей конфокальной и широкопольной флуоресцентной микроскопии.Proc Natl Acad Sci USA. 2002; 99: 2014–2019. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Сведлоу Дж. Р., Седат Дж. У., Агард Д. А.. Деконволюция в оптической микроскопии. В: Янссон П.А., редактор. Деконволюция изображений и спектров. Сан-Диего, Калифорния: Academic Press; 1997. С. 284–307. [Google Scholar]
• Тейлор MJ, Perrais D, Merrifield CJ. Высокоточный обзор молекулярной динамики клатрин-опосредованного эндоцитоза у млекопитающих. PLoS Biol. 2011; 9: e1000604. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Trinkle-Mulcahy L, et al.Идентификация конкретных партнеров взаимодействия белков с использованием количественной масс-спектрометрии и протеомов бус. J Cell Biol. 2008. 183: 223–239. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Valdmanis PN, et al. Мутации в гене KIAA0196 в локусе SPG8 вызывают наследственную спастическую параплегию. Am J Hum Genet. 2007. 80: 152–161. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Велтман Д.М., Insall RH. Белки семейства WASP: их эволюция и физиологические последствия. Mol Biol Cell.2010; 21: 2880–2893. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Вэй А.Х., Синдром Ли В. Хермански-Пудлака: пигментные и непигментные дефекты и их патогенез. Pigment Cell Melanoma Res. 2013; 26: 176–192. [PubMed] [Google Scholar]
• Викнер В., Шекман Р. Слияние мембран. Nat Struct Mol Biol. 2008. 15: 658–664. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Yi L, Donsante A, Kennerson ML, Mercer JF, Garbern JY, Kaler SG. Измененная внутриклеточная локализация и взаимодействие валозин-содержащего белка (p97 VCP) лежат в основе дистальной моторной нейропатии, связанной с ATP7A.Human Mol Genet. 2012; 21: 1794–1807. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Zech T, Calaminus SD, Caswell P, Spence HJ, Carnell M, Insall RH, Norman J, Machesky LM. Активатор Arp2 / 3 WASH регулирует инвазивную миграцию, опосредованную альфа5бета1-интегрином. J Cell Sci. 2011; 124: 3753–3759. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Zeng Y, Ramya TN, Dirksen A, Dawson PE, Paulson JC. Высокоэффективное мечение сиалилированных гликопротеинов на живых клетках. Нат методы. 2009; 6: 207–209.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Zlatic SA, Ryder PV, Salazar G, Faundez V. Выделение лабильных мультибелковых комплексов с помощью in vivo контролируемого клеточного сшивания и иммуномагнитной аффинной хроматографии. J Vis Exp. 2010; pii: 1855. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

Генная группа | Комитет по номенклатуре генов HUGO

Переключить навигацию Меню

• Данные гена
  • Отчеты по символам генов
  • Отчеты группы генов
• Инструменты
  • БиоМарт
  • HCOP
  • Мультисимвольный чекер
  • Поиск
• Загрузки
  • БиоМарт
  • Архив полный комплект
  • Пользовательские загрузки
  • Служба REST
  • Статистика и файлы для скачивания
  • GitHub (код)
• VGNC
  • Домашняя страница VGNC
  • О VGNC
• Свяжитесь с нами
  • Контактные данные
  • Форма обратной связи
• Более
  • О
    • О HGNC
    • Руководящие принципы
    • Инструкции для авторов
    • Команда HGNC
    • Посещаемость встреч
    • Уведомление о конфиденциальности
    • Публикации
    • Научно-консультативный совет
    • Советники-специалисты
    • Мастерские
  • Помощь
    • Часто задаваемые вопросы
    • Справка BioMart
    • Справка браузера
    • Справка по пользовательским загрузкам
    • Помощь группы генов
    • Справка HCOP
    • Справка по мультисимвольной проверке
    • Запросить помощь по символу
    • Справка веб-службы REST
    • Помощь по поиску
    • Справка по статистике и загрузкам
    • Справка по символьному отчету
    • Полезные ссылки
  • Новости
    • Объявления HGNC
    • Блог Genenames
    • Текущий информационный бюллетень
    • Архив новостей
• Символ запроса

границ | Сборка и активность молекулярной машины WASH: отличительные особенности на перекрестке актина и цитоскелета микротрубочек

Введение

Активное движение клеток или внутри клеток подпитывается динамикой цитоскелетных элементов, таких как актиновые филаменты и микротрубочки вместе со связанными с ними молекулярными моторами.Мономерный глобулярный актин полимеризуется в линейные или разветвленные структуры нитевидного актина. Некоторые линейные актиновые цитоскелеты, например, стресс-волокна, могут проявлять сократительные силы посредством ассоциированных миозинов, но разветвленные актиновые структуры также генерируют силы, в данном случае толкающие силы, посредством простой полимеризации. Ключевая роль разветвленного актина заключается в ремоделировании мембран во время миграции клеток, эндоцитоза и внутриклеточного переноса.

Полимеризация разветвленного актина обусловлена ​​консервативным и повсеместным гептамерным комплексом, комплексом Arp2 / 3, который зарождается новые актиновые филаменты от ранее существовавших (Pollard, 2007).Комплекс Arp2 / 3 активируется конформационным изменением, при котором два связанных с актином белка, которые он содержит, Arp2 и Arp3, оказываются в непосредственной близости, таким образом имитируя конец актинового филамента, который затем может инициировать новый филамент. Активности Arp2 / 3 способствует связывание факторов, способствующих нуклеации (NPF) с двумя сайтами в комплексе Arp2 / 3 (Zimmet et al., 2020). Поскольку актиновая нить необходима для генерации новых нитей комплексом Arp2 / 3, реакция разветвления является автокаталитической: продукты реакции могут стать субстратами последующих реакций.Это поднимает вопрос о том, откуда берется первая нить накала, от Achard et al. (2010). Было предложено несколько ответов: короткие и свободно диффундирующие актиновые филаменты могут образовываться в результате индуцированного кофилином разрыва предыдущих филаментов (Ichetovkin et al., 2002; Chen and Pollard, 2013), праймерные филаменты могут зарождаться независимыми нуклеаторами, такими как как формины или Spire (Zuchero et al., 2009; Isogai et al., 2015), или самим комплексом Arp2 / 3, активируемым в этом случае атипичными активаторами, такими как SPIN90, которые не требуют ранее существовавшего филамента ( Wagner et al., 2013). Эти различные механизмы не исключают друг друга и могут сочетаться (Cao et al., 2020).

NPF несут свой мотив активации Arp2 / 3, обычно называемый WCA, на своем С-конце. Мотив WCA индуцирует конформационное изменение комплекса Arp2 / 3 и загружает первую молекулу актина на перестроенный Arp2 / 3 (Pollard, 2007). Мотивы WCA конститутивно активны, поскольку они сворачиваются при связывании своих партнеров, актина и Arp2 / 3 (Chereau et al., 2005; Derivery et al., 2009a; Zimmet et al., 2020). Следовательно, чтобы регулировать активацию Arp2 / 3, мотивы WCA должны быть замаскированы либо в аутоингибируемой конформации, как для N-WASP, либо внутри стабильного мультипротеинового комплекса, как для WAVE (Derivery and Gautreau, 2010). Четыре семейства NPFs, WAVE, WASH, WASP и WHAMM, сосуществуют в клетках млекопитающих с общим разделением труда, заключающимся в активации комплекса Arp2 / 3 в разных субклеточных местах (Molinie and Gautreau, 2018). Например, WAVE генерирует разветвленные актиновые сети в коре клеток и особенно в адгезивных выступах, таких как ламеллиподии, тогда как WASH генерирует разветвленные актиновые сети на поверхности эндосом и вокруг центросом.Мультибелковые комплексы, содержащие NPF, ответственны за субклеточную локализацию NPF, его поддержание в неактивном состоянии и воздействие WCA при связывании с вышестоящими активаторами (Molinie and Gautreau, 2018).

Монтаж комплексов Wash и Wave

WASH и WAVE регулируются в аналогичных комплексах

WAVE был выделен из бычьего мозга и клеток HeLa с помощью классической хроматографии, и было обнаружено, что он содержится в пентамерном комплексе (Sharon et al., 2002; Gautreau et al., 2004). Канонический комплекс WAVE состоит из субъединиц CYFIP, NCKAP, ABI, WAVE и BRK1 с вариациями изоформ из-за присутствия 2 или 3 паралоговых генов для 4 из 5 субъединиц. Подробная карта взаимодействий субъединиц была получена из восстановлений in vitro, а затем кристаллографии (Gautreau et al., 2004; Innocenti et al., 2004; Chen et al., 2010). В целом тримерный субкомплекс, состоящий из ABI-WAVE-BRK1, покрывается платформой, состоящей из димерного субкомплекса, состоящего из больших субъединиц NCKAP и CYFIP.Нативные и правильно восстановленные комплексы WAVE являются неактивными NPF, потому что их мотив WCA замаскирован (Derivery et al., 2009a; Ismail et al., 2009; Chen et al., 2010).

WASH был очищен с помощью обычной и аффинной хроматографии, и было обнаружено, что он также содержится в пентамерном комплексе (Derivery et al., 2009b; Gomez and Billadeau, 2009; Jia et al., 2010). Комплекс WASH состоит из субъединиц SWIP, Strumpellin, FAM21, WASH и CCDC53. Эти субъединицы недавно были переименованы в WASHC1-5, но мы будем использовать здесь исходные названия для облегчения распознавания в подавляющем большинстве публикаций.Один ген обычно кодирует субъединицы комплекса WASH, за исключением WASH и FAM21, которые кодируются паралогическими генами в геномах млекопитающих (Linardopoulou et al., 2007; Gomez and Billadeau, 2009).

Jia и др. Распознали аналогичные пары субъединиц в комплексах WAVE и WASH, используя анализ HHPred (Jia et al., 2010). CYFIP соответствует SWIP, NCKAP соответствует Strumpellin, WAVE соответствует WASH и BRK1 соответствует CCDC53. Последняя субъединица ABI также, вероятно, соответствует FAM21, хотя эта пара ниже порога обнаружения.Анализ HHPred, который сравнивает консенсусные последовательности, полученные из нескольких ортологов пары, выявляет отдаленные отношения, которые обычно избегают анализа BlastP. Действительно, до сих пор не обнаружено гибридного комплекса между субъединицами WAVE и WASH. У эволюционно далеких видов, когда ген WAVE теряется, весь набор генов, кодирующих субъединицы комплекса WAVE, также теряется, как и для WASH (Veltman and Insall, 2010). Эти наблюдения дополнительно подчеркивают важность комплексов WAVE и WASH и их различных функций.

Линии сборки комплексов WAVE и WASH

Вопрос о том, как возникающие субъединицы в конечном итоге собираются в функциональный мультибелковый комплекс, редко решался, но оказался важным. В большинстве случаев оказывается, что уровни экспрессии субъединиц каким-то образом координируются и что оставшиеся избыточные субъединицы деградируют (Taggart et al., 2020). Вероятно, поэтому мультибелковые комплексы часто дестабилизируются, когда одна из их субъединиц отсутствует в экспериментах с нокдауном или нокаутом.Об этом постоянно сообщалось для комплекса WAVE (Kunda et al., 2003; Innocenti et al., 2005; Steffen et al., 2006; Derivery et al., 2008) и комплекса WASH (Derivery et al., 2009b; Jia et al., 2010; Gomez et al., 2012; Visweshwaran et al., 2018).

Сборка комплекса WAVE была сначала признана многоэтапным процессом. Его наименьшая субъединица, BRK1, является единственной субъединицей в избытке в цитозоле (Gautreau et al., 2004), и эта свободная форма представляет собой гомотример, собранный вдоль спиральной спирали (Derivery et al., 2008; Linkner et al., 2011). Внутри комплекса WAVE одиночная молекула BRK1 ассоциируется с одиночными молекулами ABI и WAVE через гетеротримерную спиральную спираль (Chen et al., 2010). Таким образом, должна была существовать стадия диссоциации от свободного гомотримера к гетеротримеру (рис. 1). Но неизвестно, был ли этот переход спонтанным или облегченным. В аналогичной ситуации с комплексом WASH этот процесс облегчается.

Рисунок 1. Модель сборки и активации комплексов WAVE и WASH.Наименьшие субъединицы, BRK1 и CCDC53 соответственно, также существуют в виде свободных тримеров, которые являются предшественниками комплексов. Чтобы собрать первый тримерный субкомплекс, эти тримеры должны быть диссоциированы, чтобы внести вклад в сборку комплекса одной субъединицей. HSBP1, центросомный белок, способствует этому этапу в случае комплекса WASH. Nudel способствует сборке пентамерного комплекса WAVE. Комплекс WAVE неактивен и должен активироваться небольшой GTPase Rac1 и посредством фосфорилирования белка WAVE внутри комплекса.Комплекс WASH, напротив, активен уже в промежуточном тримерном состоянии. Активация полностью собранного комплекса WASH требует фосфорилирования и K63-связанного убиквитинирования WASH.

Фактор сборки HSBP1 способствует переходу гомотримеров в гетеротример CCDC53, эквивалента BRK1 в комплексе WASH. HSBP1, белок 1, связывающий фактор теплового шока, ингибирует фактор транскрипции HSF1, который активен как тример, организованный вдоль спиральных спиралей (Satyal et al., 1998; Pockley, 2003).HSBP1 сам по себе также является свободным гомотримером, организованным по спиральной спирали (Visweshwaran et al., 2018). Когда два гомотримера, HSBP1 и CCDC53, смешиваются в пробирке, они спонтанно образуют смешанный гетеротример, содержащий единственную субъединицу CCDC53 (Visweshwaran et al., 2018). Итак, этот переход гомо-гетеротример, который был выведен для комплекса WAVE, как было показано, требует фактора сборки в случае комплекса WASH.

Дефект, связанный с инактивацией HSBP1 в клетках, заключается в отсутствии тримерной формы комплекса WASH, содержащего 3 «маленькие» субъединицы, CCDC53, WASH и FAM21 (но не Strumpellin или SWIP).Эквивалентный субкомплекс не был обнаружен в клетках для комплекса WAVE, но, вероятно, существует, поскольку реконструкция in vitro комплекса WAVE включала объединение тримерного субкомплекса малых субъединиц с димером больших субъединиц NCKAP-CYFIP (Chen et al. др., 2010, 2014). Удивительно, но инактивация HSBP1 не влияла на уровни пентамерного комплекса WASH, даже несмотря на то, что она действительно нарушала связанные с WASH функции при эндосомной сортировке (Visweshwaran et al., 2018). Таким образом, тримерный комплекс WASH должен быть активным.Этот вывод согласуется с тем фактом, что инактивация Strumpellin не отменяет WASH-зависимую полимеризацию актина на поверхности эндосом (Tyrrell et al., 2016).

В случае комплекса WASH пока не известно, как построен пентамерный комплекс. Интактные уровни пентамерного WASH в клетках, истощенных по HSBP1, противоречат простому добавлению димерного комплекса к тримерному комплексу, но это наблюдение также можно объяснить, если пентамеры строятся из тримеров с гораздо большей скоростью, чем сборка тримеров.В случае комплекса WAVE, Nudel, как сообщается, способствует сборке пентамерной WAVE. Действительно, этот белок участвует во множественных взаимодействиях с субъединицами обоих субкомплексов WAVE (Wu et al., 2012). Однако структурный переход в сборке комплекса WAVE, который способствует Nudel, еще не установлен.

Центросома, привилегированное место для сложной сборки

Фактор сборки HSBP1 очень сконцентрирован в перицентриолярном материале, окружающем центриоли. Эта центросомная локализация наблюдалась в Dictyostelium ameba, а также в тканях и линиях клеток человеческого происхождения (Visweshwaran et al., 2018). Другой фактор сборки, Nudel, является адаптером двигателя микротрубочек динеина, который транспортирует грузы к минус-концам микротрубочек. Соответственно, Nudel накапливается в центросомах (Feng et al., 2000). Когда клетки производятся без центросом с помощью центринона, химического ингибитора, который блокирует их дупликацию, HSBP1 становится диффузным, и стабильные уровни комплексов WASH снижаются (Visweshwaran et al., 2018). Вместе эти наблюдения подтверждают, что комплекс WASH и, вероятно, комплекс WAVE, собираются в центросоме.Концентрация реагентов в одном определенном месте по сравнению со всем трехмерным объемом клетки может облегчить сборку этих мультибелковых комплексов.

Известно, что перицентриолярный материал состоит из многих белков, содержащих спиральные спирали (Kuhn et al., 2014), которые могут вносить вклад в переход гомотримеров в гетеротример. Белок Pericentriolar Material 1 (PCM1) представляет собой белок центросомной спиральной спирали, который, по-видимому, закрепляет комплекс WASH на центросоме, где он способствует зарождению разветвленных актиновых сетей (Farina et al., 2016). WASH также связывается с центросомными белками, γ-тубулином и BLOS2 (Monfregola et al., 2010). Комплекс WASH активен в центросоме (Farina et al., 2016). WASH-зависимый центросомный разветвленный актин, как было обнаружено, прикрепляет центросомы к ядерной оболочке в интерфазных клетках посредством комплекса LINC (Obino et al., 2016). В митотических клетках WASH-зависимый центросомный разветвленный актин способствует образованию микротрубочек веретена в начале митоза в прометафазе (Plessner et al., 2019) и наоборот, может быть ответственным за уменьшение микротрубочек веретена во время выхода из митоза в анафазе (Farina et al., 2019).

Центросомы также являются привилегированным участком деградации, опосредованной убиквитин-протеасомным путем. Неправильно свернутые белки расщепляются путем убиквитин-протеасомного пути и накапливаются вокруг центросом, когда способность к деградации подавлена ​​(Johnston et al., 1998; Kopito, 2000). Термин агресома был придуман для обозначения этой центральной агрегации из-за транспорта, опосредованного динеином.Было показано, что Nudel участвует в этом транспорте неправильно свернутых белков (Wan et al., 2012). Фактически имеет смысл, что центросомы являются привилегированными сайтами как для сборки мультибелковых комплексов, так и для деградации неправильно свернутых белков. Действительно, сложная сборка часто терпит неудачу из-за дисбаланса субъединиц: неполные сборки не могут достичь естественного состояния полного комплекса, и, таким образом, деградация неправильных промежуточных продуктов сборки предотвращает их потенциальные вредные эффекты.

Регулировка комплексов Wave и Wash

Регулирование уровней и деятельности

Регулирование уровней мультибелковых комплексов в принципе может быть достигнуто за счет скоординированной регуляции экспрессии всех субъединиц или за счет регуляции скорости их сборки, поскольку субъединицы стабильны только тогда, когда являются частью своего соответствующего комплекса.Существует множество публикаций, в которых сообщается о повышении или понижении регуляции отдельной субъединицы из мультипротеинового комплекса. Например, комплексы Arp2 / 3 и WAVE активируются при многих раковых заболеваниях (ссылки в Molinie and Gautreau, 2018), но механизмы, ответственные за эти случаи дерегуляции, неизвестны. Комплекс WASH также активируется при карциномах молочной железы (Visweshwaran et al., 2018). В этом случае HSBP1 также сверхэкспрессируется, что позволяет предположить, что опухолевые клетки способны продуцировать больше комплексов WASH за счет повышения регуляции фактора сборки HSBP1.Кроме того, сверхэкспрессия HSBP1 связана с плохой выживаемостью без метастазов у ​​пациентов с раком груди.

Регуляция активности комплексов WAVE и WASH изучается чаще, чем регуляция их уровней. Активация комплексов WAVE и WASH включает экспонирование так называемого мотива WCA, который активирует комплекс Arp2 / 3. В состоянии покоя мотив WCA замаскирован, и посттрансляционные модификации N-концевых доменов субъединиц WAVE и WASH, по-видимому, играют критическую роль в высвобождении замаскированной WCA.Фосфорилирование Tyr 150 из WAVE2 с помощью Abl киназы необходимо для активности WAVE (Ленг и др., 2005; Стюарт и др., 2006; Чен и др., 2010). Точно так же фосфорилирование Tyr141 и 261 с помощью Lck и Btk, соответственно, оказалось критическим для активности WASH (Huang et al., 2016; Tsarouhas et al., 2019). Полиубиквитинирование WASH на Lys 220 с помощью цепи, связанной с K63, синтезированной убиквитинлигазой MAGE-L2 / TRIM27 E3, активирует комплекс WASH в анализе in vitro (Hao et al., 2013).

Однако предшествующая регуляция комплексов WAVE и WASH значительно различается. Комплексы WAVE зависят от небольшой GTPase Rac1 для их рекрутирования и активации на краю ламеллиподиальных клеток (Miki et al., 1998; Steffen et al., 2004). Rac1 сотрудничает с др. Малой GTPase Arf1 для активации WAVE (Koronakis et al., 2011; Humphreys et al., 2012). Напротив, среди многих связывающих партнеров комплекса WASH неясно, какой из них отвечает за его активацию, если какой-либо из них.Рекрутирование комплекса WASH на поверхности эндосом включает множественные сайты связывания для ретромера вдоль удлиненного хвоста субъединицы FAM21 (Harbor et al., 2012; Jia et al., 2012; Helfer et al., 2013). Однако эндосомное рекрутирование комплекса WASH также происходит в отсутствие функционального ретромера (McNally et al., 2017; Evans et al., 2020). HRS участвует в независимом от ретромера рекрутинге, даже если HRS и WASH не принадлежат к одним и тем же эндосомным микродоменам (MacDonald et al., 2018). Прямое взаимодействие комплекса WASH с эндосомными липидами также может вносить вклад в рекрутинг эндосом (Derivery et al., 2009b, 2012). Фосфоинозитиды, такие как фосфатидилинозитол-3-фосфат (PI3P) и фосфатидилинозитол-4-фосфат (PI4P), по-видимому, имеют решающее значение для привлечения и активации WASH на эндосомных микродоменах (Dong et al., 2016; Singla et al., 2019).

Роли комплекса WASH

Комплекс WASH занимается эндосомной сортировкой грузов. WASH впервые был вовлечен в ретроградный транспорт катион-независимого маннозо-6-фосфатного рецептора, CI-MPR, даже если ретромер не участвует в торговле CI-MPR вопреки всем ожиданиям (Gomez and Billadeau, 2009; Kvainickas et al., 2017; Simonetti et al., 2017; Evans et al., 2020). WASH неоднократно участвовал в рециркуляции грузов к плазматической мембране, в случае β2-адренергического рецептора (Puthenveedu et al., 2010), интегринов α5 / β1 (Zech et al., 2011), EGFR (Gomez et al., 2012) , GLUT1 (Piotrowski et al., 2013; Lee et al., 2016), TCR (Piotrowski et al., 2013), переносчик меди ATP7A (Phillips-Krawczak et al., 2015), LDLR (Bartuzi et al., 2016 ) и ряд других. Эта деятельность основана на взаимодействии комплекса WASH с так называемой коммандерской сборкой комплексов, состоящей из ретромеров и ретромероподобных компонентов, ретриверных и CCC-комплексов (Phillips-Krawczak et al., 2015; Бартузи и др., 2016; McNally et al., 2017; Chen et al., 2019).

Разветвленные актиновые сети, которые генерирует WASH, непосредственно участвуют в сортировке рецепторов при условии, что они обладают сродством к актину (Puthenveedu et al., 2010; MacDonald et al., 2018). Разветвленный актин поддерживает липидные микродомены, диффундирующие в эндосомальную мембрану, потому что, когда полимеризация актина нарушается, они объединяются в единый домен, где WASH, по-видимому, не может отделиться от мембраны эндосомы, как было замечено FRAP (Derivery et al., 2012). Это поведение лучше всего наблюдается, когда эндосомы искусственно увеличиваются за счет экспрессии активной формы Rab5. Иногда сообщалось, что эндосомы слипаются, когда WASH инактивирован или полимеризация актина ингибируется (Drengk et al., 2003; Derivery et al., 2009b; Gomez et al., 2012; Gautreau et al., 2014). Этот фенотип слипания может быть связан с отсутствием динамики эндосомных микродоменов и их актиновой оболочки. Но наиболее часто сообщаемые фенотипы — это выраженные канальцы эндосом (Derivery et al., 2009b; Gomez and Billadeau, 2009), увеличенные сферические эндосомы (Gomez et al., 2012) или их смесь (Fokin et al., 2021). Причина преобладания одного фенотипа над другим неизвестна, но дефектная сортировка грузов и дефектная генерация транспортных промежуточных звеньев одинаково характеризуют оба фенотипа.

Эндосомы представляют собой тубуло-везикулярные структуры, поэтому фенотип канальцев в нарушенных условиях является преувеличением нормального процесса. Это просто показывает, что вытягивание эндосомальных мембран с помощью моторов микротрубочек продолжается, когда нарушается образование разветвленного актина.Трубчатые удлинения, содержащие отсортированные грузовые белки, при расщеплении дают начало автономным транспортным промежуточным звеньям. Когда разрез блокируется химическим ингибитором динамина, WASH может быть четко локализован в основании эндосомных канальцев в нужном месте для выполнения разрезания (Derivery et al., 2009b; Рисунок 2). Когда эндосомы увеличиваются однородно, оставаясь сферическими, после инактивации WASH (Gomez et al., 2012), дефект можно интерпретировать как роль разветвленного актина в генерации мембранных канальцев.Разветвленный актин необходим для стабилизации канальцев, содержащих β2-адренергический рецептор (Puthenveedu et al., 2010). Механически разветвленный актин будет давить на основную часть эндосомы в этом случае, чтобы способствовать образованию канальцев, способом, наиболее сходным с ролью разветвленного актина в эндоцитозе дрожжей (Kaksonen and Roux, 2018). В клетках млекопитающих разветвленный актин окружает шейку ямок, покрытых клатрином, подобно сжимающемуся воротнику, и вместе с динамином способствует расщеплению (Collins et al., 2011). К сожалению, ультраструктурная организация разветвленного актина на поверхности эндосом еще не выяснена. Основное различие между эндоцитозом и генерацией транспортных промежуточных звеньев из эндосом состоит в том, что последние требуют, помимо разветвленного актина, микротрубочек и моторов микротрубочек, как показано в реконструкциях in vitro (Bananis et al., 2003; Murray et al. , 2008).

Рисунок 2. Модель WASH-зависимого образования эндосомного разветвленного актина. (A) Динактин является важным адаптером для транспорта, опосредованного динеином. Динактин взаимодействует с комплексом WASH, который раскрывает его актин-подобную минифиламент через мотив CPI. (B) Неограниченный динактин удлиняет актиновую нить, которая затем может служить субстратом для опосредованного Arp2 / 3 ветвления, индуцированного его мотивом WCA. (C) Актин-подобные минифиламенты динактина встроены в разветвленную актиновую сеть и, таким образом, подвергаются ретроградному току. Мембранная трубка удлиняется за счет тянущей силы динеина, тогда как WASH-Arp2 / 3 на шейке мембранной трубки давит на основную часть эндосомы.Эти противодействующие силы могут растягивать мембрану и способствовать ее разрыву. WASH-зависимые разветвленные сети актина регулируют организацию липидных микродоменов и эндосомных канальцев.

Роль динактина в инициировании разветвленного эндосомного актина

Динактин представляет собой большой мегадальтонный комплекс, который способствует активности и процессивности направленного к минус-концу моторного динеина микротрубочек (Schroer, 2004). Динактин организован вдоль минифиламента, состоящего из 8 молекул родственного актину белка 1 (Arp1), одной молекулы Arp11 и одной молекулы β-актина (Urnavicius et al., 2015). Эта актин-подобная нить закрыта белком-кэпом. Кепирующий белок, фактически являющийся гетеродимером CPα и CPβ, прекращает удлинение актиновых филаментов в цитозоле. Присутствие актин-подобных минифиламентов в комплексе, ориентированном на двигатели микротрубочек и микротрубочек, остается загадкой с момента его открытия почти 30 лет назад (Lees-Miller et al., 1992). Комплекс WASH также привлекает кэпирующий белок. Это происходит через так называемый мотив CPI на С-конце субъединицы FAM21 (Derivery et al., 2009b; Эрнандес-Валладарес и др., 2010; Jia et al., 2010). Этот мотив CPI является уникальным для комплекса WASH, поскольку эквивалентная субъединица в комплексе WAVE, ABI, скорее отображает домен Sh4 на своем С-конце.

Динактин можно найти по всему цитозолю, но он обогащен на поверхности эндосом (Habermann et al., 2001; Yeh et al., 2012), где он взаимодействует с комплексом оболочки ESCPE-1, состоящим из димеров SNX1. / SNX2, с одной стороны, и SNX5 / SNX6, с другой (Wassmer et al., 2009; Simonetti et al., 2019). Динактин / динеин, как и кинезины, участвуют в канальцах эндосом (Hunt et al., 2013; Brown et al., 2014; Delevoye et al., 2014; Marchesin et al., 2015). Динактин может колокализоваться и коиммунопреципитироваться с комплексом WASH, что указывает на то, что две молекулярные машины прямо или косвенно взаимодействуют (Fokin et al., 2021). При смешивании в пробирке CPI комплекса WASH присваивает кэпирующий белок динактина. Минифиламент Arp1 / 11 динактина затем может быть удлинен с помощью актина и, таким образом, обеспечивает первую актиновую нить для реакции ветвления Arp2 / 3, контролируемой WCA субъединицы WASH (Рис. 2).Этот молекулярный сценарий объясняет тот факт, что и динактин, и мотив CPI в FAM21 необходимы для генерации эндосомных разветвленных актиновых сетей.

Минифиламент динактина Arp1 / 11 встроен в разветвленную актиновую сеть, которую он инициирует. Как следствие, он должен подвергаться так называемому ретроградному потоку из-за удлинения волокон, примыкающих к отображающей мембране WASH. Еще неизвестно, образует ли динактин комплекс с динеиновыми моторами и адаптерами, когда они встроены в разветвленную актиновую сеть.Это вполне может быть так, поскольку минифиламент может размещать динеиновые адаптеры на своих сторонах и удлинять актиновую нить от своего зазубренного конца. В структурном отношении, кажется, нет стерических препятствий (Urnavicius et al., 2015, 2018). Если это действительно так, то динеин, вытягивающий мембранный каналец, и разветвленный актин, толкающий основную часть эндосом, растягивают шейку канальца. Эта механическая деформация может способствовать либо удлинению канальца, либо расщеплению канальца в его основании, что согласуется с фенотипами, описанными при нокдауне или нокауте WASH.

Заключение

Многие исследования комплекса WASH основывались на его аналогии с комплексом WAVE. Его сборка поразительно похожа на сборку WAVE, например, в том, что касается этого перехода гомо-гетеротример. Это позволило идентифицировать фактор сборки HSBP1, который усиливает связи WASH с центросомой, которая является местом сборки и функционирования комплекса WASH. Изучение сборки WASH также выявило новый подкомплекс, тримерный WASH-CCDC53-FAM21, который, по-видимому, несет многие, если не все, функции, связанные с WASH.Регуляция сборки, по-видимому, является основным способом, который опухолевые клетки используют для активации комплекса WASH при инвазивном раке. Однако комплекс WASH отличается от комплекса WAVE многочисленными взаимодействиями, которые он осуществляет с молекулярными машинами, связанными с микротрубочками. Это естественно соответствует важной роли микротрубочек в форме, подвижности и функции эндосом. Одним из наиболее ярких примеров сотрудничества является использование динактина для создания первого праймерного филамента и, таким образом, для инициирования эндосомных разветвленных актиновых сетей.Сборка молекулярных машин и их взаимодействие в суперкомплексах — это основные проблемы, стоящие перед нами для понимания внутреннего функционирования WASH-зависимой эндосомной сортировки. Это требует усилий по восстановлению in vitro в сочетании с клеточной биологией.

Взносы авторов

AF написал первый черновик рукописи и нарисовал рисунки. AG написал дополнительные части текста и усреднил окончательную рукопись. Оба автора одобрили окончательный вариант рукописи.

Финансирование

Эта работа была поддержана грантами Национального агентства исследований (ANR-15-CE13-0016-01 и ANR-20-CE13-0016-01) и Национального института рака (INCA_6521).

Конфликт интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Ссылки

Ахард, В., Мартиель, Дж. Л., Мишело, А., Герэн, К., Рейманн, А.С., Бланшуан, Л. и др. (2010). Механизм на основе «праймера» лежит в основе образования и подвижности сети разветвленных актиновых филаментов. Curr. Биол. 20, 423–428. DOI: 10.1016 / j.cub.2009.12.056

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бананис, Э., Мюррей, Дж. У., Стокерт, Р. Дж., Сатир, П., и Волкофф, А. У. (2003). Регуляция ранней подвижности и деления эндоцитарных пузырьков в восстановленной системе. J. Cell Sci. 116, 2749–2761.DOI: 10.1242 / jcs.00478

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бартузи П., Билладо Д. Д., Фавье Р., Ронг С., Деккер Д., Федосеенко А. и др. (2016). Эндосомная сортировка LDLR, опосредованная CCC и WASH, необходима для нормального клиренса циркулирующих LDL. Nat. Commun. 7: 10961. DOI: 10.1038 / ncomms10961

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Браун, А. К., Хант, С. Д., Стивенс, Д. Дж. (2014).Противоположные двигатели микротрубочек контролируют подвижность, морфологию и сегрегацию грузов во время транспортировки ER-to-Golgi. Biol. Откройте 3, 307–313. DOI: 10.1242 / bio.20147633

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Cao, L., Yonis, A., Vaghela, M., Barriga, E.H., Chugh, P., Smith, M. B., et al. (2020). SPIN90 ассоциирует с mDia1 и комплексом Arp2 / 3, чтобы регулировать организацию кортикального актина. Nat. Cell Biol. 22, 803–814. DOI: 10.1038 / s41556-020-0531-y

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Чен, Б., Бринкманн, К., Чен, З., Пак, К. В., Ляо, Ю., Ши, С. и др. (2014). Регуляторный комплекс WAVE связывает различные рецепторы с актиновым цитоскелетом. Cell 156, 195–207. DOI: 10.1016 / j.cell.2013.11.048

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Чен К. Э., Хили М. Д. и Коллинз Б. М. (2019). К молекулярному пониманию эндосомного трафика ретромером и ретривером. Трафик 20, 465–478. DOI: 10.1111 / tra.12649

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Chen, Q., и Поллард, Т. Д. (2013). Разрыв актиновых волокон кофилином разрушает актиновые пятна и производит материнские волокна для новых пятен. Curr. Биол. 23, 1154–1162. DOI: 10.1016 / j.cub.2013.05.005

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Чен З., Борек Д., Падрик С. Б., Гомес Т. С., Метлагель З., Исмаил А. М. и др. (2010). Структура и контроль актинового регуляторного комплекса WAVE. Природа 468, 533–538. DOI: 10.1038 / nature09623

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Chereau, D., Керфф, Ф., Грацеффа, П., Грабарек, З., Лангсетмо, К., и Домингес, Р. (2005). Связанные с актином структуры белка синдрома Вискотта-Олдрича (WASP) — гомологичный домен 2 и значение для сборки филаментов. Proc. Natl. Акад. Sci. США 102, 16644–16649. DOI: 10.1073 / pnas.0507021102

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Коллинз А., Уоррингтон А., Тейлор К. А., Свиткина Т. (2011). Структурная организация актинового цитоскелета в местах клатрин-опосредованного эндоцитоза. Curr. Биол. 21, 1167–1175. DOI: 10.1016 / j.cub.2011.05.048

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Delevoye, C., Miserey-Lenkei, S., Montagnac, G., Gilles-Marsens, F., Paul-Gilloteaux, P., Giordano, F., et al. (2014). Для рециклинга морфогенеза эндосомных канальцев из сортировки эндосом необходим кинезиновый мотор KIF13A. Cell Rep. 6, 445–454. DOI: 10.1016 / j.celrep.2014.01.002

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Деривери, Э., Финк, Дж., Мартин, Д., Худусс, А., Пиль, М., Страдал, Т. Е. и др. (2008). Free Brick1 — это тримерный предшественник в сборке функционального волнового комплекса. PLoS One 3: e2462. DOI: 10.1371 / journal.pone.0002462

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Деривери, Э., Готро, А. (2010). Генерация разветвленных сетей актина: сборка и регуляция молекулярных машин N-WASP и WAVE. Bioessays 32, 119–131. DOI: 10.1002 / bies.200

3

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Деривери, Э., Хелфер, Э., Анрио, В., и Готро, А. (2012). Полимеризация актина контролирует организацию доменов WASH на поверхности эндосом. PLoS One 7: e39774. DOI: 10.1371 / journal.pone.0039774

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Деривери, Э., Суза, К., Готье, Дж. Дж., Ломбард, Б., Лоу, Д., и Готро, А. (2009b).Активатор Arp2 / 3 WASH контролирует деление эндосом через большой мультипротеиновый комплекс. Dev. Cell 17, 712–723. DOI: 10.1016 / j.devcel.2009.09.010

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Донг Р., Сахеки Ю., Сваруп С., Лукаст Л., Харпер Дж. У. и Де Камилли П. (2016). Контакты эндосома-ER контролируют нуклеацию актина и функцию ретромера посредством VAP-зависимой регуляции PI4P. Ячейка 166, 408–423. DOI: 10.1016 / j.cell.2016.06.037

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Drengk, A., Fritsch, J., Schmauch, C., Rühling, H., and Maniak, M. (2003). Покрытие из нитчатого актина предотвращает кластеризацию поздних эндосомных вакуолей in vivo . Curr. Биол. 13, 1814–1819. DOI: 10.1016 / j.cub.2003.09.037

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Эванс, А. Дж., Дейли, Дж. Л., Ануар, А. Н. К., Симонетти, Б., и Каллен, П. Дж.(2020). Острая инактивация ретромера и ESCPE-1 приводит к разрешенным во времени дефектам в сортировке эндосомных грузов. J. Cell Sci. 133: jcs246033. DOI: 10.1242 / JCS.246033

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Фарина Ф., Рамкумар Н., Браун Л., Самандар Эвейс Д., Анштатт Дж., Варинг Т. и др. (2019). Локальная нуклеация актина настраивает нуклеацию центросомных микротрубочек во время прохождения митоза. EMBO J. 38: e99843. DOI: 10.15252 / embj.201899843

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Фенг, Ю., Олсон, Э. К., Стукенберг, П. Т., Фланаган, Л. А., Киршнер, М. В., и Уолш, К. А. (2000). LIS1 регулирует ламинирование ЦНС, взаимодействуя с mNudE, центральным компонентом центросомы. Neuron 28, 665–679. DOI: 10.1016 / S0896-6273 (00) 00145-8

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Фокин, А., Давид, В., Огиевецкая, К., Деривери, Э., Стоун, К., Цао, Л., и другие. (2021 г.). Минифиламент динактина Arp1 / 11 активирует эндосомный комплекс Arp2 / 3. Sci. Adv. 7. doi: 10.1126 / sciadv.abd5956

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Gautreau, A., Ho, H.Y., Li, J., Steen, H., Gygi, S.P., and Kirschner, M. W. (2004). Очищение и архитектура вездесущего комплекса Wave. Proc. Natl. Акад. Sci. США 101, 4379–4383. DOI: 10.1073 / pnas.0400628101

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Готро, А., Огиевецкая К., Унгерманн К. (2014). Функции и регуляция механизмов эндосомного слияния и деления. Колд Спринг Харб. Перспектива. Биол. 6: a016832. DOI: 10.1101 / cshperspect.a016832

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Гомес, Т. С., Горман, Дж. А., Артал-Мартинес де Нарвахас, А., Кениг, А. О., и Билладо, Д. Д. (2012). Дефекты движения в фибробластах, нокаутированных по WASH, происходят из-за разрушенных эндосомных и лизосомных сетей. Мол. Биол. Cell 23, 3215–3228. DOI: 10.1091 / mbc.E12-02-0101

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хаберманн А., Шроер Т.А., Гриффитс Г. и Буркхардт Дж. К. (2001). Иммунолокализация цитоплазматического динеина и субъединиц динактина в культивируемых макрофагах: обогащение ранних эндоцитарных органелл. J. Cell Sci. 114, 229–240.

Google Scholar

Хао, Ю. Х., Дойл, Дж. М., Раманатан, С., Гомес, Т. С., Jia, D., Xu, M., et al. (2013). Регуляция WASH-зависимой полимеризации актина и транспорта белков путем убиквитинирования. Ячейка 152, 1051–1064. DOI: 10.1016 / j.cell.2013.01.051

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Харбор, М. Э., Брейзегем, С. Ю., Симан, М. Н. Дж. (2012). Рекрутирование эндосомного комплекса WASH опосредуется удлиненным «хвостом» связывания Fam21 с ретромерным белком Vps35. Biochem. J. 442, 209–220.DOI: 10.1042 / BJ20111761

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хелфер, Э., Харбор, М. Э., Анрио, В., Лакишич, Г., Суза-Блин, К., Волчанов, Л. и др. (2013). Рекрутирование комплекса WASH эндосомами: активные последовательности и мутации, нарушающие взаимодействие с ретромером. Biol. Cell 105, 191–207. DOI: 10.1111 / boc.201200038

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Эрнандес-Валладарес, М., Ким, Т., Каннан Б., Тунг А., Агуда А. Х., Ларссон М. и др. (2010). Структурная характеристика мотива взаимодействия кэпирующего белка определяет семейство регуляторов актиновых филаментов. Nat. Struct. Мол. Биол. 17, 497–503. DOI: 10.1038 / nsmb.1792

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хуан Л., Чжу П., Ся П. и Фань З. (2016). Wash играет решающую роль в цитотоксичности NK-клеток через Lck-опосредованное фосфорилирование. Cell Death Dis. 7: e2301.DOI: 10.1038 / cddis.2016.212

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хамфрис, Д., Лю, Т., Дэвидсон, А. К., Хьюм, П. Дж., И Коронакис, В. (2012). Гомолог Arf1 Drosophila Arf79F важен для образования ламеллиподий. J. Cell Sci. 125, 5630–5635. DOI: 10.1242 / jcs.108092

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хант, С. Д., Таунли, А. К., Дэнсон, К. М., Каллен, П. Дж., И Стивенс, Д. Дж.(2013). Моторы микротрубочек опосредуют сортировку эндосом, поддерживая организацию функциональных доменов. J. Cell Sci. 126, 2493–2501. DOI: 10.1242 / jcs.122317

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ичетовкин, И., Грант, В., и Кондилис, Дж. (2002). Кофилин продуцирует недавно полимеризованные актиновые филаменты, которые предпочтительны для зарождения дендритов комплексом Arp2 / 3. Curr. Биол. 12, 79–84. DOI: 10.1016 / s0960-9822 (01) 00629-7

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Инноченти, М., Gerboth, S., Rottner, K., Lai, F. P. L., Hertzog, M., Stradal, T. E. B., et al. (2005). Abi1 регулирует активность N-WASP и WAVE в различных актиновых процессах. Nat. Cell Biol. 7, 969–976. DOI: 10.1038 / ncb1304

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Innocenti, M., Zucconi, A., Disanza, A., Frittoli, E., Areces, L. B., Steffen, A., et al. (2004). Abi1 необходим для образования и активации сигнального комплекса WAVE2. Nat.Cell Biol. 6, 319–327. DOI: 10.1038 / ncb1105

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Исмаил А. М., Падрик С. Б., Чен Б., Уметани Дж. И Розен М. К. (2009). Подавляется регуляторный комплекс WAVE. Nat. Struct. Мол. Биол. 16, 561–563. DOI: 10.1038 / nsmb.1587

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Isogai, T., van der Kammen, R., Leyton-Puig, D., Kedziora, K.M, Jalink, K., and Innocenti, M.(2015). Инициирование ламеллиподий и складок вовлекает сотрудничество между mDia1 и комплексом Arp2 / 3. J. Cell Sci. 128, 3796–3810. DOI: 10.1242 / jcs.176768

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Джиа Д., Гомес Т. С., Билладо Д. Д. и Розен М. К. (2012). Множественные повторяющиеся элементы в хвосте FAM21 связывают регуляторный комплекс актина WASH с ретромером. Мол. Биол. Cell 23, 2352–2361. DOI: 10.1091 / mbc.E11-12-1059

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Цзя, Д., Gomez, T. S., Metlagel, Z., Umetani, J., Otwinowski, Z., Rosen, M. K., et al. (2010). Регуляторы актина WASH и WAVE семейства белков синдрома Вискотта-Олдрича (WASP) контролируются аналогичными структурно родственными комплексами. Proc. Natl. Акад. Sci. США 107, 10442–10447. DOI: 10.1073 / pnas.03107

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Копито, Р. Р. (2000). Агресомы, тельца включения и агрегация белков. Trends Cell Biol. 10, 524–530. DOI: 10.1016 / S0962-8924 (00) 01852-3

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Коронакис В., Хьюм П. Дж., Хамфрис Д., Лю Т., Хорнинг О., Йенсен О. Н. и др. (2011). Активация регуляторного комплекса WAVE за счет взаимодействия GTPases Arf и Rac1. Proc. Natl. Акад. Sci. США 108, 14449–14454. DOI: 10.1073 / pnas.1107666108

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кун, М., Хайман, А.А., Бейер, А.(2014). Белки спиральной спирали способствовали функциональному расширению центросомы. PLoS Comput. Биол. 10: e1003657. DOI: 10.1371 / journal.pcbi.1003657

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кунда, П., Крейг, Г., Домингес, В., и Баум, Б. (2003). Abi, Sra1 и Kette контролируют стабильность и локализацию SCAR / WAVE, чтобы регулировать образование актиновых выступов. Curr. Биол. 13, 1867–1875. DOI: 10.1016 / j.cub.2003.10.005

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Kvainickas, A., Orgaz, A.J., Nägele, H., Diedrich, B., Heesom, K.J., Dengjel, J., et al. (2017). Зависимая от ретромера и WASH сортировка переносчиков питательных веществ требует поливалентной сети взаимодействия с ANKRD50. J. Cell Sci. 130, 382–395. DOI: 10.1242 / jcs.196758

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ли С., Чанг Дж. И Блэкстоун К. (2016).FAM21 направляет грузы ретромера SNX27 к плазматической мембране, предотвращая транспортировку к аппарату Гольджи. Nat. Commun. 7: 10939. DOI: 10.1038 / ncomms10939

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Лис-Миллер, Дж. П., Хельфман, Д. М., и Шроер, Т. А. (1992). Связанный с актином белок позвоночных является компонентом мультисубъединичного комплекса, участвующего в подвижности пузырьков на основе микротрубочек. Природа 359, 244–246. DOI: 10.1038 / 359244a0

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ленг, Ю., Zhang, J., Badour, K., Arpaia, E., Freeman, S., Cheung, P., et al. (2005). Абельсон-интерактор-1 способствует транслокации мембраны WAVE2 и опосредованному Абельсоном фосфорилированию тирозина, необходимому для активации WAVE2. Proc. Natl. Акад. Sci. США 102, 1098–1103. DOI: 10.1073 / pnas.040

02

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Линардопулу, Э. В., Парги, С. С., Фридман, К., Осборн, Г. Э., Паркхерст, С. М., и Траск, Б. Дж. (2007). Субтеломерные гены WASH человека кодируют новый подкласс семейства WASP. PLoS Genet. 3: E237. DOI: 10.1371 / journal.pgen.0030237

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Линкнер, Дж., Витте, Г., Страдал, Т., Курт, У., и Фэикс, Дж. (2011). Рентгеновская структура с высоким разрешением предшественника комплекса тримерного рубца / ВОЛНЫ Brk1. PLoS One 6: e21327. DOI: 10.1371 / journal.pone.0021327

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

MacDonald, E., Brown, L., Selvais, A., Liu, H., Варинг Т., Ньюман Д. и др. (2018). Ось HRS-WASH управляет рециклингом эндосом, опосредованным актином, и клеточной инвазией. J. Cell Biol. 217, 2549–2564. DOI: 10.1083 / jcb.201710051

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Марчезин В., Кастро-Кастро А., Лодиллински К., Кастаньино А., Сирта Дж., Бонсанг-Китцис, Х. и др. (2015). ARF6-JIP3 / 4 регулируют эндосомные канальцы для экзоцитоза MT1-MMP при раковой инвазии. J. Cell Biol. 211, 339–358.DOI: 10.1083 / jcb.201506002

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

МакНалли, К. Э., Фолкнер, Р., Стейнберг, Ф., Галлон, М., Гай, Р., Пим, Д., и др. (2017). Ретривер представляет собой мультибелковый комплекс для рециклинга эндосомных грузов, не зависящего от ретромеров. Nat. Cell Biol. 19, 1214–1225. DOI: 10.1038 / ncb3610

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Miki, H., Suetsugu, S., and Takenawa, T. (1998). WAVE, новый белок семейства WASP, участвующий в реорганизации актина, индуцированной Rac. EMBO J. 17, 6932–6941. DOI: 10.1093 / emboj / 17.23.6932

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Монфрегола, Дж., Наполитано, Дж., Д’Урсо, М., Лаппалайнен, П., и Урсини, М. В. (2010). Функциональная характеристика белка синдрома Вискотта-Олдрича и гомолога рубца (WASH), бимодульного фактора, способствующего нуклеации, способного взаимодействовать с биогенезом связанной с лизосомами субъединицы 2 органеллы (BLOS2) и гамма-тубулина. J. Biol. Chem. 285, 16951–16957.DOI: 10.1074 / jbc.M109.078501

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Мюррей, Дж. У., Саркар, С., и Волкофф, А. У. (2008). Анализ одиночных везикул деления эндоцитов на микротрубочках in vitro . Трафик 9, 833–847. DOI: 10.1111 / j.1600-0854.2008.00725.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Обино Д., Фарина Ф., Мальбек О., Саез П. Дж., Маурин М., Гайяр Дж. И др. (2016). Зарождение актина в центросоме контролирует полярность лимфоцитов. Nat. Commun. 7: 10969. DOI: 10.1038 / ncomms10969

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Филипс-Кравчак, К. А., Сингла, А., Старокадомский, П., Дэн, З., Осборн, Д. Г., Ли, Х. и др. (2015). COMMD1 связан с комплексом WASH и регулирует эндосомный перенос переносчика меди ATP7A. Мол. Биол. Cell 26, 91–103. DOI: 10.1091 / mbc.E14-06-1073

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Пиотровски, Я.Т., Гомес, Т. С., Шун, Р. А., Мангалам, А. К., и Билладо, Д. Д. (2013). WASH-нокаутные Т-клетки демонстрируют дефектный перенос рецепторов, пролиферацию и эффекторную функцию. Мол. Клетка. Биол. 33, 958–973. DOI: 10.1128 / mcb.01288-12

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Плесснер М., Кнерр Дж. И Гроссе Р. (2019). Сборка центросомного актина необходима для правильного формирования митотического веретена и хромосомной конгресса. iScience 15, 274–281.DOI: 10.1016 / j.isci.2019.04.022

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Покли А.Г. (2003). Белки теплового шока как регуляторы иммунного ответа. Ланцет 144, 1331–1339. DOI: 10.1016 / S0140-6736 (03) 14075-5

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Поллард, Т. Д. (2007). Регуляция сборки актиновых филаментов комплексом Arp2 / 3 и форминами. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 36, 451–477. DOI: 10.1146 / annurev.биофиз. 35.040405.101936

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Puthenveedu, M.A., Lauffer, B., Temkin, P., Vistein, R., Carlton, P., Thorn, K., et al. (2010). Последовательно-зависимая сортировка рециклирующих белков с помощью стабилизированных актином эндосомных микродоменов. Ячейка 143, 761–773. DOI: 10.1016 / j.cell.2010.10.003

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Сатьял, С. Х., Чен, Д., Фокс, С. Г., Крамер, Дж. М., и Моримото, Р.И. (1998). Отрицательная регуляция транскрипционного ответа теплового шока HSBP1. Genes Dev. 12, 1962–1974. DOI: 10.1101 / gad.12.13.1962

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Шарон, Э., Раджат, Р., Александр, В. П., Матиас, М., и Марк, В. К. (2002). Механизм регуляции индуцированной WAVE1 нуклеации актина с помощью Rac1 и Nck. Природа 418, 790–793. DOI: 10.1038 / nature00859

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Симонетти, Б., Дэнсон, К. М., Хисом, К. Дж., И Каллен, П. Дж. (2017). Зависимое от последовательности распознавание груза с помощью SNX-BARs опосредует независимый от ретромера транспорт CI-MPR. J. Cell Biol. 216, 3695–3712. DOI: 10.1083 / jcb.201703015

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Simonetti, B., Paul, B., Chaudhari, K., Weeratunga, S., Steinberg, F., Gorla, M., et al. (2019). Молекулярная идентификация комплекса оболочки, содержащего BAR-домен, для эндосомного рециклинга трансмембранных белков. Nat. Cell Biol. 21, 1219–1233. DOI: 10.1038 / s41556-019-0393-3

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Сингла А., Федосеенко А., Гиридхаран С. С. П., Оверли Б. Л., Лопес А., Джиа Д. и др. (2019). Эндосомная регуляция PI (3) P комплексом COMMD / CCDC22 / CCDC93 (CCC) контролирует рециклинг мембранного белка. Nat. Commun. 10: 4271. DOI: 10.1038 / s41467-019-12221-6

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Штеффен, А., Faix, J., Resch, G. P., Linkner, J., Wehland, J., Small, J. V., et al. (2006). Формирование филоподий в отсутствие функциональных WAVE- и Arp2 / 3-комплексов. Мол. Биол. Cell 16, 5356–5372. DOI: 10.1091 / mbc.E05

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Steffen, A., Rottner, K., Ehinger, J., Innocenti, M., Scita, G., Wehland, J., et al. (2004). Sra-1 и Nap1 связывают Rac с актиновой сборкой, управляя образованием ламеллиподий. EMBO J. 23, 749–759. DOI: 10,1038 / sj.emboj.7600084

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Стюарт, Дж. Р., Гонсалес, Ф. Х., Каваи, Х. и Юань, З. М. (2006). c-Abl взаимодействует с сигнальным комплексом WAVE2, вызывая вздутие мембраны и разрастание клеток. J. Biol. Chem. 281, 31290–31297. DOI: 10.1074 / jbc.M602389200

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Таггарт, Дж. К., Заубер, Х., Селбах, М., Ли, Г. У., и МакШейн, Э. (2020). Контроль пропорций компонентов белкового комплекса. Cell Syst. 10, 125–132. DOI: 10.1016 / j.cels.2020.01.004

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Царухас В., Лю Д., Цикала Г., Федосеенко А., Зинн К., Мацуда Р. и др. (2019). Фосфорилирование WASH уравновешивает целостность эндосомной и корковой актиновой сети во время эпителиального морфогенеза. Nat. Commun. 10: 2193. DOI: 10.1038 / s41467-019-10229-6

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Тиррелл, Б.Дж., Вудхэм, Э. Ф., Спенс, Х. Дж., Стратди, Д., Инсолл, Р. Х., и Мачески, Л. М. (2016). Потеря струмпеллина в меланоцитарной линии нарушает комплекс WASH, но не влияет на цвет шерсти. Pigment Cell Melanoma Res. 29, 559–571. DOI: 10.1111 / PCMR.12506

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Urnavicius, L., Lau, C. K., Elshenawy, M. M., Morales-Rios, E., Motz, C., Yildiz, A., et al. (2018). Крио-ЭМ показывает, как динактин задействует два динеина для более быстрого движения. Природа 554, 202–206. DOI: 10.1038 / природа25462

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Urnavicius, L., Zhang, K., Diamant, A. G., Motz, C., Schlager, M. A., Yu, M., et al. (2015). Структура динактинового комплекса и его взаимодействие с динеином. Наука 347, 1441–1446. DOI: 10.1126 / science.aaa4080

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Visweshwaran, S. P., Thomason, P. A., Guerois, R., Вашер С., Денисов Е.В., Таширева Л.А. и др. (2018). Тримерный белок HSBP 1 со спиральной спиралью способствует сборке комплекса WASH в центросомах. EMBO J. 37: e97706. DOI: 10.15252 / embj.201797706

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Вагнер А. Р., Луан К., Лю С. и Нолен Б. Дж. (2013). Статья Dip1 определяет класс комплексных активаторов Arp2 / 3, которые функционируют без предварительно сформированных актиновых филаментов. Curr. Биол. 23, 1990–1998.DOI: 10.1016 / j.cub.2013.08.029

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Wan, Y., Yang, Z., Guo, J., Zhang, Q., Zeng, L., Song, W., et al. (2012). Неправильно свернутый Gβ рекрутируется Nudel в цитоплазматический динеин для эффективного клиренса. Cell Res. 22, 1140–1154. DOI: 10.1038 / cr.2012.41

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Wassmer, T., Attar, N., Harterink, M., van Weering, J. R. T., Traer, C.J., Oakley, J., и другие. (2009). Комплекс ретромерной оболочки координирует эндосомную сортировку и динеин-опосредованный транспорт с распознаванием носителей транс-сетью Гольджи. Dev. Cell 17, 110–122. DOI: 10.1016 / j.devcel.2009.04.016

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ву, С., Ма, Л., Ву, Ю., Цзэн, Р., и Чжу, X. (2012). Nudel имеет решающее значение для сборки комплекса WAVE in vivo , избирательно способствуя стабильности и образованию субкомплексов посредством прямых взаимодействий. Cell Res. 22, 1270–1284. DOI: 10.1038 / cr.2012.47

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Yeh, T.-Y., Quintyne, N.J., Scipioni, B.R., Eckley, D.M, and Schroer, T.A. (2012). Комплекс с заостренным концом Dynactin представляет собой модуль наведения на груз. Мол. Биол. Cell 23, 3827–3837. DOI: 10.1091 / mbc.E12-07-0496

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Зеч, Т., Каламинус, С. Д. Дж., Касуэлл, П., Спенс, Х.J., Carnell, M., Insall, R.H., et al. (2011). Активатор Arp2 / 3 WASH регулирует (5 (1-интегрин-опосредованная инвазивная миграция. J. Cell Sci. 124, 3753–3759. Doi: 10.1242 / jcs.080986

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Циммет, А., Ван Иувен, Т., Бочковска, М., Ребовски, Г., Мураками, К., и Домингес, Р. (2020). Крио-ЭМ структура NPF-связанного человеческого комплекса Arp2 / 3 и механизм активации. Sci. Adv. 6. DOI: 10.1126 / sciadv.

No related posts.